Mikrobiologia Ćw. 7

Identyfikacja bakterii metodami serologicznymi

(odczyn aglutynacji, aglutynacji pośredniej, precypitacji)

Określanie typu bakteriologicznego

Kiedy stosujemy identyfikację serologiczną?

- cechy morfologiczne

- sposób barwienia się

- ruch lub jego brak

- właściwości biochemiczne

Kiedy wszystkie wymienione nie stanowią dostatecznego kryterium do różnicowania mikroorganizmów

Identyfikacja serologiczna - swoista reakcja między nieznanym antygenem (zarazkiem) i znaną surowicą diagnostyczną (przeciwciałem)

Swoistość rekcji - wyraża się tym, że dany antygen reaguje tylko i wyłącznie z tym przeciwciałem, które powstało pod jego wpływem.

Antygen - każda substancja, która rozpoznana przez organizm jako obca, uruchamia odpowiedź immunologiczną i reaguje swoiście z jej produktami (przeciwciała, uczulone limfocyty T) in vitro i in vivo.

Przeciwciała - swoiste białka powstające podczas odpowiedzi układu immunologicznego na antygen i reagujące swoiście tylko z tym antygenem, pod wpływem którego powstały in vivo i in vitro.

Surowice diagnostyczne - uzyskujemy w wyspecjalizowanych wytwórniach przez uodparnianie zwierząt znanym antygenem, w wyniku czego pojawiają się w ich surowicach przeciwciała skierowane przeciwko temu antygenowi.

W identyfikacji serologicznej mieszamy badany nieznany antygen (zarazek), kolejno z różnymi surowicami diagnostycznymi i obserwujemy, z którą z nich wystąpi określona reakcja dodatnia ( aglutynacji, precypitacji itp.). jej wystąpienie świadczy o identyczności badanego zarazka z tym, który był przyczyną powstania swoistych przeciwciał

W wyniku reakcji zachodzącej między antygenem i przeciwciałem powstaje kompleks antygen-przeciwciało, którego charakter zależy od postaci antygenu.

Antygeny upostaciowione (np. komórki) tworzą kompleksy w formie aglutynatu (reakcja aglutynacji), antygeny rozpuszczalne, nieupostaciowione (białka, wielocukry) tworzą kompleksy w postaci strątu - precypitatu (reakcja precypitacji).

Odczyn aglutynacji (zlepienia):

- odczyn dwufazowy - w pierwszej fazie następuje swoiste wiązanie się antygenu z przeciwciałem, w drugiej, w
obecności elektrolitów, dochodzi do wypadania powstałego kompleksu z roztworu.

- najczęściej używanym odczynem jest aglutynacja szkiełkowa (można wykonać probówkową).

- na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę surowicy diagnostycznej i obok kroplę płynu fizjologicznego (kontrola).
Do obu kropel wprowadzamy małą ilość badanej hodowli bakteryjnej i rozprowadzamy, aż do uzyskania jednolicie
mętnej zawiesiny, następnie ruchem okrężnym mieszamy składniki reakcji.

- wynik dodatni - po 1-3 min. przejaśnienie płynu i pojawienie się kłaczków lub ziarnistości

- kontrola lub wynik ujemny - mieszana zawiesina pozostaje jednolicie mętna.

Odczyn precypitacji (strącania):

- odczyn dwufazowy - w pierwszej fazie następuje swoiste wiązanie się antygenu z przeciwciałem, w drugiej fazie w
obecności elektrolitów, dochodzi do wypadania powstałego kompleksu z roztworu.

- bardzo czuły, umożliwiający wykrycie śladowych ilości substancji antygenowej

- in vitro stosowany w diagnostyce wąglika, wykrywaniu toksyn, określenia stereotypów paciorkowców, wykrywania
zafałszowań mięsa (badanie swoistości gatunkowej białka), w medycynie sądowej (ustalanie pochodzenia plam
krwi)

- in vivo - powstające kompleksy precypitacyjne odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu zjawisk alergicznych

- odczyn precypitacji można przeprowadzać w środowisku płynnym i stałym (żel)

- precypitację w żelu można wykonać w dwóch układach, jako dyfuzję pojedynczą (prostą) i podwójną.

Precypitacja pojedyncza (prosta):

- badana substancja dyfunduje do żelu, zawierającego znaną surowicę diagnostyczną. W miejscu optymalnego
stężenia kompleksów immunologicznych (antygen-przeciwciało) powstają prążki precypitacyjne.

Precypitacja podwójna:

- oba składniki dyfundują ku sobie (surowica i antygen). W miejscu optymalnego stężenia kompleksów
immunologicznych powstają prążki precypitacyjne.

Dyfuzja radialna - antygen dyfunduje z basenika do żelu zawierającego surowicę diagnostyczną. Dodatni wynik - pojawia się powstaniem pierścienia precypitacyjnego wokół basenika (im więcej antygenu, tym szerszy pierścień precypitacyjny).

Precypitacja pierścieniowa - na surowicę, wprowadzaną do probówki lub kapilary, nawarstwiamy badany wyciąg antygenowy. W przypadku obecności odpowiednich antygenów w wyciągu powstaje na granicy płynów w ciągu kilku min. wyraźny pierścień precypitacyjny.

Odczyn aglutynacji biernej (pośredniej):

- łączy w sobie cechy odczynów precypitacji i aglutynacji - antygen nieupostaciowany łącząc się z przeciwciałem
(surowicą diagnostyczną) zaadsorbowanym na nośniku (bantoinit, lateks, węgiel), powoduje ich aglutynację. Jeśli
nośnikiem jest krwinka czerwona odczyn określamy mianem hemoaglutynacji biernej (pośredniej).

Określanie typu bakteriologicznego:

Bakteriocyny:

- białkowe antybiotykopodobne substancje, wytwarzane przez niektóre szczepy bakterii G+

- wywierają działanie bakteriobójcze na inne szczepy danego gatunku lub blisko z nim spokrewnionego

- bakteriocyny wytwarzane przez pałeczki jelitowe zwane są kolicynami. Wrażliwość drobnoustroju na daną kolicynę
uwarunkowana jest istnieniem w ścianie komórkowej specyficznych dla tej kolicyny receptorów.

Badanie przynależności do określonego typu:

- na specjalne podłoże posiewamy w linii średnicy płytki badany szczep, a po 16h inkubacji (produkcja bakteriocyn),
inaktywujemy go chloroformem i spłukujemy z podłoża

- prostopadle do linii pierwszego posiewu wysiewamy określone szczepy wskaźnikowe i po inkubacji odczytujemy
wynik - dodatni zahamowanie wzrostu szczepu wskaźnikowego.

1

---