BIAŁKA FUZYJNE

Produkcja:

• Synteza chemiczna - małe cząst. Białkowe i peptydy,

• Techniki biologii molekularnej, inż. genet., duże i modyfikowane białka - b. rekombinowane

K. bioreaktory E.coli, Saccharomyces:

• Niska wydajność- niska ekspresja genu; obecność enzymów wewnątrz kom.; trudność w izolacji/ oczyszczaniu syntetyzowanych białek,

• Dołączenie syntetyzowanego białka do innego stabilnego białka:

• Zapobieganie degradacji zewnętrz.bioreaktorów,

• Zapewniają wysoką ekspresję,

• Ułatwia oczyszczanie.

Białka fuzyjne:

• Fuzje białek prowadzi się na poziomie DNA

• Sekwencja kodująca stabilne białko kom. łączy się z sekwencją kodującą białka, które ma być syntetyzowane,

• Po przeprowadzeniu transkrypcji i translacji powstaje białko fuzyjne.

• Połączenie musi respektować zasady kodu genet.: trójkowość, bezprzecinkowość, zgodność ramek odczytu.

Uwaga :

1. kodon „stop” gen. Kom. Musi być usunięty.

2. musi być zachowana ciągłość ramki odczytu białka fuzyjnego.

3. element fuzyjny może być usuwany przez trawienie enzymatyczne (endonukleoza, endopeptydaza).

Wektor do klonowania b. fuzyjnego:

• omp F - promotor genu,

• lac 2 - stabilne białko kom (umożliwia selekcję i izolację)

• omp F - gen białka docelowego.

Podłoze selekcyjne z ampicyliną.

Oczyszczanie białek fuzyjnych:

• białko kom. może przyłączyć się do wybranej cząstki np. przeciwciało (Pc)

• cząsteczka Pc może być z kolei przytwierdzona do stałego nośnika

• białko fuzyjne zostaje wychwycone na nośniku

• kolejny etap elucja b. f. z kolumną.

Białkiem kom. może być:

1. MBP (białko wiążące maltozę)

2. GST (transferaza glutationowa)

Kolumny są wypełnione wówczas maltozą lub glutationem.

Po syntezie i oczyszczeniu konieczne jest usunięcie dołączonego białka kom:

• Może zakłócać metabolizm kom.

• Może przeszkadzać w zastosowaniach klinicznych.

Rozszczepienie białek fuzyjnych:

Pomiędzy białkiem docelowym a b. kom. musi znajdować się sekwencja rozpoznawana przez proteazę (odp endonuklezay restrykcyjnej)

Proteaza Pochodzenie

Cz. Xa czynnik krzepnięcia

Enterokinaza jelito bydła

TEV proteazę Tobacco Etch Virus

Rozpoznają i przecinają krótkie sekwencje aminokwasów 7aa 8aa

Przykł.

ENBREL - domena rec TNF α i rejon Fc immunoglobiny G1; choroba Crona i RZS.

ONTAK - Il-2 + toksyna błonnicza - leczenie chłoniaka skóy.

Przeciwciała monoklonalne:

• Odporność to zdolność do czynnej i biernej ochrony organizmu przed patogenami

• Ze względu na mechanizm wyróżniamy odp. humoralną (Pc) i odp. komórkową (limf. T)

• Ze względu na swoistość:

1. Nieswoista :

• Bierna (skóra, błony śluzowe),

• Czynna (kaszel, kichanie)

2. swoista: bierna, czynna i kom. (limf. B, C i Pc)

• ze względu na szybkość i długość reakcji : wtórna i pierwotna.

Przeciwciała:

• są wydzielane do krążenia i wydzielnin surowiczo- śluzowych (mleko, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy, owodniowy) przez plazmocyty (powstałe z limf. B),

• cząsteczka Pc jest swoista wobec

Region Fab - powinowactwo (siła wiązania A g i Pc, swoistość)

Region Fc - warunkuje funkcje efektorowe, T_0.5 umożliwia przejście Ig przez łożysko.

X 2 łańcuchy ciężkie i lekkie.

Przeciwciała poliklonalne:

• wytwarzane przez liczne klony limf. B

• skierowane wobec całego zestawu epitopów na Ag

• zwiększona skuteczność w warunkach nat.

• Zmniejszenie przydatności do celów naukowych.

Przeciwciała monoklonalne:

• Powstają z jednego klonu limf. B

• Specyficzne względem jednego epitopu

• Wykorzystywane w diagnostyce terapii i badaniach naukowych.

Epitop:

• Przeciwciało rozpoznaje tylko niewielka część antygenu

• Fragment, który jest rozpoznawany nazywa sie epitopem

• Jeden antygen może posiadać wiele epitopów.

Produkcja:

• Antygen, przeciwko któremu projektowane jest przeciwciało, jest oczyszczany i wstrzykiwany do organizmu myszy. A g mają być całe kom błony kom. wirusy.

W celu wzmocnienia odp. immunologicznej z Ag wprowadza się adiuwant - wydłuża czas ekspozycji Ag, np. adiuwant Freunda.

• W organizmie myszy namnażają się limfocyty B, które wytwarzają przeciwciała przeciwko wstrzykniętemu antygenowi.

• Mysz immunizuje się tak długo aż uzyskamy odp. wysokie stężenie Pc w surowicy.

• Limf. B ( w tym te, które produkują Pc ) są izolowane ze śledziony.

• Limf. B wytwarzające Pc ulegają fuzji z kom szpiczaka myszy dając hybrydomy.

• m. fizyczna - ultradźwięki,

• m. chemiczna - z użyciem glikolu polietylenowego,

• m. biologiczna - z użyciem wirusa Senday.

• Namnażanie hybryd w org. myszy (infekcja podskórna lub dootrzewnowa).

Selekcja hybrydu:

• Fuzja:

• Limf-limf

• Kom szpiczaka-kom. szpiczaka

• Limf-kom szpiczaka

• Pożwyka selekcyjna HAT - hipoksantyna, tymidyna.

Amidopteryna- antagonista kw. foliowego blokuje syntezę puryn i pirymidyn; synteza de novo zablokowana.

Szlak ratunkowy: kom. syntetyzuje DNA wykorzystyjąc zasady azotowe zawarte w pożywce.

• Przekształcając tymidyne w tymine i hipoksantyne w guanine.

• Na pożywce HAT rosną limf. lecz liczba ich podziałów jest ograniczona do ok. 20.

• Kom. szpiczaka mają defekt genet. i metaboliczny - są mutantami niezdolnymi do produkcji enzymów HCPRT, TK ( kinaza tymidylanowa).

• Kom. szpiczaka na pożywce HAT nie rosną

• Limf. B z HCPRT giną po kilku pasażach - limit podziałów

• Przeżywają tylko hybrydony - wytwarzające Pc.

Zastosowanie:

• W medycynie klinicznej jako narzędzie w diagnostyce ( w tym obrazowej), terapii,

• Znakowanie Pc do detekcji i lokalizacji antygenów badanych próbek, np. western blot, immunizacja w skrawkach,

• Znakowanie radioaktywne Pc

• Western bloting.

Preparaty enzymatyczne:

RENINA:

• Ścinanie kazeiyn w mleku

• Mucor rouxini

• Produkcja serów

INWERTAZA:

• Hydroliza cukrów

• Aspergillus oryzae, drożdże

• Produkcja cukru do wyrobu słodyczy

PROTEAZY:

• Hydroliza białek

• B. subtilis

• Dodatek do detergentów

• Garbowanie skór

LIPAZA:

• Hydroliza lipidów

• Pseudomonas, grzyby

• Dodatek do detergentów

• Garbowanie skóry

AMYLAZA:

• Hydroliza skrobi

• B. subtilis, Aspergillus

• Produkcja syropu glukozowego

PULLULANAZA:

• Hydroliza skrobii

• Bacillus

• Rozcinanie wiązań α 1-4 i α 1-6

CELULAZY:

• Hydroliza celulozy

• Trichoderma viride, Penicylinum

• Produkcja glukozy z celulozy