Doświadczenie 2

Elektroforeza SDS-PAGE

Cel doświadczenia:

Zapoznanie się z metodą rozdziału elektroforetycznego białek.

Wymagane wiadomości:

Elektroforeza białek-zasada metody, wykorzystanie. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym - natywna i w warunkach denaturujących.

Sprzęt i materiały:

- homogenat (wyizolowane białko z mózgu szczura)

- lód

- wirówka

- thermoblock - płyta grzejna

- pipety automatyczne

- zasilacz

- aparat do elektroforezy

- kasetki na żel 1 lub 1,5 mm + grzebień o odpowiedniej grubości (1 lub 1,5 mm)

Odczynniki:

- mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0,8% bisakrylamid)

- 1,5 M Tris HCl pH 6.8

- 0,5 M Tris HCl 8.8

- 10% SDS

- woda destylowana

- 10% APS (ammonium persulfate)

- TEMED (N,N,N,N'- tetrametylenodiamina)

- bufor do elektroforezy

- komercyjny standard (marker) wielkości białek

Wykonanie:

1. Włóż kasetki, w których będziemy wylewać żel w aparacie do elektroforezy.

2. Przygotuj mieszaninę dla żelu rozdzielającego

12,5% Żel rozdzielający:

- 4,2 ml mieszaniny monomerów (30% akrylami, 0,8% bisakrylamid)

- 2,5 ml Buforu Tris HCl pH 8.8

- 3,3 ml wody destylowanej

- 100 μl 10% SDS

- 100 μl APS (10%)

- 10 μl TEMED

UWAGA: Przed dodaniem TEMED i APS wymieszać dobrze pozostałe składniki.

APS i TEMED dodaje się bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny do kasetki, ponieważ reakcja polimeryzacji postępuje bardzo szybko.

3. Po dodaniu katalizatorów polimeryzacji (APS i TEMED) roztwór dokładnie, ale delikatnie wymieszaj (unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza) i wlej (pipetą 1 ml) do przygotowanej kasetki, pozostawiając 3-4 cm (od góry) na żel rozdzielający

4. Nałóż (pipetą) na wierzch żelu rozdzielającego, warstwę wody destylowanej (ok. 1 ml) i pozostaw do polimeryzacji na co najmniej 30 min.(najlepiej 1 h).

5. Przygotuj mieszaninę dla żelu zagęszczającego

5% Żel zagęszczający:

- 500 μl mieszaniny monomerów (30% akrylami, 0,8% bisakrylamid)

- 750 μl Buforu Tris HCl pH 6.8

- 1,7 ml wody destylowanej

- 30 μl 10% SDS

- 50 μl APS (10%)

- 5 μl TEMED

UWAGA: Przed dodaniem TEMED i APS wymieszać dobrze pozostałe składniki.

APS i TEMED dodaje się bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny do kasetki, ponieważ reakcja polimeryzacji postępuje bardzo szybko. Wcześniej delikatnie zlej wodę z powierzchni żelu (wyciągnij i przechyl delikatnie kasetkę)

6. Wlej żel zagęszczający i włóż w niego grzebień o odpowiedniej grubości. Grzebień trzeba umieścić tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Żel jest gotowy do użycia po ok. 20-30 min.

Tak przygotowany żel można zapakować szczelnie w folię z kawałkiem mokrego ręcznika papierowego lub ligniny i przechowywać kilka dni w lodówce.

7. W międzyczasie przygotuj próbki do naniesienia na żel (każda osoba przygotowuje 1 próbkę)

- do opisanej probówki (eppendorfów) odpipetuj taką ilość homogenatu, w której znajduje się 20 μg białka

- uzupełnij 2% SDS do 10 μl

- dodaj do próbek po 10 μl buforu próbkowego (z DTT, loading buffer)

- gotuj 10 min. w temp. 95^oC w thermoblocku

- wiruj przez 5 min. w 10 tys. RPM

8. Po spolimeryzowaniu żelu zagęszczającego wyciągnij kasetkę z aparatu i usuń pasek ochronny (biały) na dole kasetki. Włóż kasetkę z powrotem do aparatu/pojemnika do elektroforezy.

9. Wyciągnij delikatnie grzebień (by nie uszkodzić studzienek) i zalej buforem do elektroforezy. Najpierw zalać komorę z żelem a następnie przednią mniej więcej do połowy.

UWAGA: przygotowany bufor jest 5x stężony (należy rozcieńczyć przed użyciem!)

10. Nanieś próbki na żel za pomocą wydłużonych tipsów. Czynność wykonujemy ostrożnie (i stosunkowo szybko), by nie uszkodzić studzienek, oraz by próbki nie „wyszły” ze studzienek. Każda osoba nakłada swoją próbkę. Wykonujemy to jedną końcówką, którą przed użyciem przepłukujemy 2x buforem do elektroforezy. Zanotować kolejność nakładania próbek! Nałożyć marker wielkości białek (1studzienka/żel)

11. dolej buforu do elektroforezy

12. Włącz aparaturę i rozpocznij elektroforezę:

- 90 V dla żelu zagęszczającego

- 130 V dla żelu rozdzielającego

13. Sprawdź, czy aparat nie przecieka i czy widać bąbelki (urządzenie dobrze pracuje)

14. Kiedy front dojdzie do końca żelu, kończymy elektroforezę

15. Pojemnik do elektroforezy przepłukać wodą destylowaną i osuszyć.

Przepisy na bufory i inne roztwory wykorzystywane do elektroforezy SDS-PAGE.

Wszystkie roztwory sporządzamy na wodzie destylowanej wg podanego przepisu.

Przygotowanie żeli do eletroforezy

1. TRIS HCl 1.5 M pH 8.8

• 3,69 g Tris-HCL

• 15,39 g Tris Base

• dopełnić wodą do 100 ml

2. TRIS HCL 0,5 M pH 6.8

• 7,5 g Tris-HCL

• 0,4 g Tris Base

• dopełnić wodą do 100 ml

3. SDS 10 % stock (krystalizuje na lodzie)

• 10 g SDS (przy odważaniu najlepiej założyć maseczkę)

• dopełnić wodą do 100 ml

Roztwory 1-3 przechowywać najlepiej w zakręcanych (opisanych) butelkach w temp. pokojowej. Rozpuszczać na mieszadle magnetycznym.

4. Acrylamide 30% + Bis-acrylamide 0.8% (po zmieszaniu chronić przed światłem, owinąć butelkę folią aluminiową; przechowywać w lodówce w ciemnej butelce)

• 30 g Acrylamide (przy odważaniu najlepiej założyć maseczkę)

• 0,8 g Bis-acrylamide

• dopełnić wodą do 100 ml

5. Ammonium persulfate 10% (po sporządzeniu rozpipetować po 1ml do eppendorfów i zamrozić w temp. -20^oC)

• 1 g Amonium persulfate

• dopełnić wodą do 10 ml

6. Bufor do próbek (po sporządzeniu rozpipetować po 1 ml do eppendorfów i zamrozić w temp. - 20^oC):

• 5 ml 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 (tego wcześniej przygotowanego)

• 1 g SDS

• 2 ml glycerol

• 0.31 g DTT

• dopełnić wodą do 10 ml

• 0.1 mg Bromphenol Blue

7. Bufor do elektroforezy 5x (rozcieńczyć przed elektoroforezą!!!) pH 8.3!!!:

• 7.55 g TRIZMA base (25 mM)

• 36 g Glycine (192 mM)

• 2.5 g SDS (0.1%)

• dopełnić wodą do 0.5 L

4