Zakładanie makrohodowli

Hodowlę komórkową zakładamy w sterylnym jednorazowym naczyniu hodowlanym NUNC o pojemności 25ml w warunkach jałowych (komora laminarna)

a)do sterylnej probówki z 1 ml heparyny (50 IU/ 1ml krwi) pobieramy 10 ml krwi żylnej. Odstawiamy do sedymentacji na około 2h w temperaturze pokojowej

b)osad białych krwinek wraz z 1 ml osocza przenosimy do naczynia hodowlanego z 8ml płynu hodowlanego oraz 1ml surowicy płodowej cielęcej. Naczynie należy szczelnie zamknąć, krańcowa objętość hodowli wynosi 10ml

c)umieścić naczynie hodowlane w cieplarce o temperaturze 37C na okres 48-72h, każdego dnia hodowlę mieszamy

d)na 2h przed zakończeniem hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy colcemidu
0,15 μg/ml i wstawiamy ponownie do cieplarki na 2h

1. Wykańczanie hodowli:

a)zawartość hodowli przenosimy do wirówki - 7min, 800obr/min

b)zlewamy płyn znad osadu, probówkę wstrząsamy, kroplami dodajemy 10ml 0,075M KCl (0,55%), na 17min w temperaturze pokojowej, wirujemy 7 min, 800obr/min

c)zlewamy płyn znad osadu, do osadu dodajemy 10ml płynu Carnoy'a (mieszanina metanolu i kwasu octowego lodowego w stosunku 3:1). Probówkę umieszczamy na 10 min w lodówce. Wirujemy 3 razy po 7 min, 800obr/min

d)po zlaniu płynu znad osadu osad nanosimy na oziębione szkiełka podstawowe

e)po wysuszeniu barwimy preparat barwnikiem Giemsy

Mikrohodowla - zakładanie

Mikrohodowla jest stosowana powszechnie w rutynowej diagnostyce noworodków i małych dzieci.

• Odczynniki jak w markohodowli

• Przygotowanie płynu komórkowego - jak w markohodowli

• Zakładanie mikrohodowli:

a)Wysterylizowane buteleczki po penicylinie o pojemności 5ml lub w naczyniach plastykowych

b)Do 2ml płynu dodajemy 4 krople (0,3-0,5ml) pełnej krwi obwodowej (pobranej z pięty lub żyły ciemieniowej)

c)Hodowla 72h, z zachowaniem tych samych procedur co w makrohodowli

Hodowla chromosomów z komórek szpiku ludzkiego

Bioptat szpiku (1-2ml) należy umieścić natychmiast po pobraniu w jałowej probówce z ogrzanym do 37C płynem hodowlanym (np. RPMI 1640) z dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotykami (penicylina, streptomycyna) w standardowych stężeniach. Dodatkowo należy dodać heparynę 250 IU/ml

Dwie drogi postępowania:

a)metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

b)metoda krótkotrwałej hodowli

a) metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

Polega na inkubacji komórek szpiku przez 1-2h w pożywce z colcemidem (25μg/ml). Jest zalecanym postępowaniem w przypadkach ostrych białaczek szpikowych i limfatycznych

b)metoda krótkotrwałej hodowli

hodowlę komórek zakładamy w w/w płynie hodowlanym stosując rozcieńczenie komórek szpiku kostnego - milion/ml hodowli. Komórki hoduje się przez 24-48h w temperaturze 37C, w atmosferze z 5% CO₂.

• Mitozy blokujemy colcemidem 5-10μg/ml na 40-60 min przed końcem hodowli

• Szok hipotoniczny - w celu odpowiedniego rozproszenia chromosomów w jądrze używamy 0,4% KCl lub mieszaniny 3g KCl, 4,8g HEPES, 0,2g EGTA w 1000ml wody o pH 7,4

Dalsze etapy utrwalania i wykańczania podobne jak w standardowych technikach cytogenetycznych.

W przypadkach białaczek, gdy komórki nowotworowe występują we krwi obwodowej stosuje się 24-48h niestymulowaną mitogenami hodowlę komórek pobranych drogą nakłucia żylnego.

Zasady barwienia takie same jak chromosomów z innych tkanek.

Hodowla chromosomów z tkanek pochodzących z guzów nowotworowych

Transport guza:

• Jałowe naczynie

• Płyn Hawksa lub Eagle'a ewentualnie 0,9% NaCl z dodatkiem antybiotyków: penicyliny krystalicznej (100 IU/ml), streptomycyny (100μg/ml)

Przygotowanie tkanek guza:

• 1-3cm³ guza przenosimy na szalkę Petriego

• Rozdrabniamy tkankę nożyczkami

• Dodajemy 2ml płynu Hawksa z antybiotykami i dalej rozdrabniamy

Skład płynu hodowlanego (100ml)

• Płyn RPM z penicyliną (100 IU/ml) i streptomycyną (100μg/ml)

• 10-15% surowica płodowa cielęca

• 1ml L-glutaminy

Przenoszenie tkanek guza do naczynia hodowlanego NUNC, w którym znajduje się 5ml płynu hodowlanego, 1ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml. Całość trzymamy w cieplarce (37C, 24h, 5%CO₂)

• Po 24h rozpipetowujemy do probówki wirowniczej

• Dodajemy 10ml płynu RPM z antybiotykami

• Wirujemy 10min 1000obr/min

• Po odwirowaniu dodajemy 1,5ml płynu RPM

Zakładanie hodowli: naczynie szklane 8,5ml płynu hodowlanego, 1,5ml zawiesiny komórek guza, naczynie plastykowe 4,5ml płynu hodowlanego 0,5ml zawiesiny komórek guza

Hodowla w temperaturze 37C, z przepływem 5%CO₂. Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym wzrost kolonii.

UWAGA!: co 2-3 dni zmiana płynu hodowlanego

Zakończenie hodowli

• Przy widocznych mitoza (po kilku, kilkunastu dniach i więcej), 30min - 2h przed zakończeniem hodowli colcemid 5-10μg/ml

• Komórki z hodowli zdrapujemy „drapaczką”

• Całość zalewamy do probówki wirowniczej, wirujemy 10 min 1100obr/min

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego:

Skład płynu hipotonicznego:KCL, HEPES, EGTA, WODA,Ph

Szok hipotoniczny przeprowadzamy w temperaturze 37st.C przez 45min. Następnie wirujemy 10min 1100obr/min

Utrwalanie materiału komórkowego

• Metanol : lodowy kwas octowy 3:1, powtarzamy 3x po 20 min

• Wirowanie 10min 1100obr/min

• Nanosimy na zimne (wyjęte z wody z lodem) szkiełka podstawowe

Dodatkowe czynności, które mogą być wykonane w czasie prowadzenia hodowli:

a)przy szybkim wzrosćie komórek (możliwość zahamowania wzrostu komórek) - możliwość pasażowania przy użyciu roztworu trypsyny (otrzymujemy 2 hodowle z jednej)

b)przy braku przyczepu komórek do ścian naczynia zakładamy ponownie hodowlę w naczyniach z kolagenem

c)nadmiar erytrocytów - płuczemy hodowlę w płynie niszczącym erytrocyty(NH₄Cl, NaHCO₃, EDTA)przez 15min w autoklawie

Wybarwienie prążków G w chromosomach metafazowych:

1)Do barwienia na prążki G używamy preparatów chromosomowych świeżych (4-10dni)

2)preparaty poddajemy trawieniu roztworem trypsyny o stężeniu 0,25%-0,5% w buforze Sorensena o pH 6,8

Odczynniki:

• roztwór wyjściowy trypsyny o składzie: 250mg trypsyny, 98ml płynu Hawksa, 2ml 2,8% NaHCO₃

• płyn PBS - zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

• bufor Sorensena o pH 6,8

• 3,5% roztwór Giemsy w buforze Sorensena o pH6,8

Wykonanie:

1)roztwór trawiący: pobrać 50ml roztworu wyjściowego trypsyny, dodać 30ml PBS, przelać do naczynia do barwienia

2)zanurzyć preparat w roztworze trawiącym na około 8-10s

3)płukać preparat kilkakrotnie w roztworze PBS

4)barwić 4-6x 3,5% roztworem Giemsy w buforze Sorensena o pH 6,8

5)płukać 3x w wodzie destylowanej

6)preparaty oceniać w mikroskopie świetlnym

CEL: rutynowe barwienie, ocena kariotypu

Wybarwianie prążków Q w chromosomach metafazowych:

Odczynniki:

a)roztwór wyjściowy barwnika fluorescencyjnego np. atebryny (rozpuszczonej w buforze Sorensena o pH 6,0)

Wykonanie:

a)barwić szkiełka w roztworze atebryny przez 5-10 min w temperaturze pokojowej,

b)płukać w buforze Sorensena o pH 6,0

c)pozostawić preparaty na 5min w nowej zmianie buforu Sorensena o pH 6,0

d)zamknąć preparaty w mieszaninie glicerolu i buforu McKraine'a o pH 7,0 (mieszanina kw. Cytrynowego z wodorofosforanem dwusodowym)

e)preparaty oceniać bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym i odpowiednimi filtrami

Wybarwianie prążków C

Uzyskanie prążków C wymaga usunięcia z chromosomu pewnych ilości DNA przy zastosowaniu wodorotlenku baru.

Wykonanie:

a)preparaty chromosomowe inkubować 1h w roztworze 0,1N HCl, w temperaturze pokojowej

b)opłukać w wodzie destylowanej

c)następnie preparaty inkubować przez 5-15min w świeżo przygotowanym 5% wodnym roztworze Ba(OH)₂ x8H₂O w temperaturze 50C,

d)opłukać w kilku zmianach wody destylowanej

e)inkubować 1h w 2xSSC o temperaturze 60C

f)opłukać krótko wodą destylowaną

g0preparaty przed barwieniem przepłukać 0,1N HCl

h)barwić barwnikiem Giemsy 2% w buforze Sorensena o pH 6,8

i)opłukać krótko wodą destylowaną i osuszyć preparaty bibułą

j)przeprowadzić przez szereg alkoholowy 20%, 80%

prążki C wybarwiają się barwnikiem Giemsy w okolicy heterochromatyny centromerowej i przewężeń wtórnych oraz dystalnych części ramion długich chromosomu Y

wybarwienie rejonów jąderko twórczych w chromosomach metafazowych (AgNOR)

a)preparaty pokryć roztworem 50% AgNO₃ i nałożyć szkiełko przykrywkowe

b)umieścić szkiełko w szczelnym naczyniu spełniającym rolę wilgotnej komory

c)preparaty inkubować przez 18h w temperaturze 37C lub przez 2-5h w temperaturze 50C

d)przebieg reakcji wysrebrzania oceniać pod mikroskopem kontrastowo-fazowym, w razie potrzeby można wydłużyć czas inkubacji

e0preparaty podbarwić 3% roztworem Giemsy i oceniać pod mikroskopem świetlnym

f)modyfikacja: można użyć amoniakalnego roztworu azotanu srebra i 3% formaliny