Ćwiczenie 1

Oznaczanie aktywności enzymów

Prowadzący: dr inż. Gabriela PASTUCH-GAWOŁEK

Miejsce ćwiczenia: sala 7

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie oraz badanie wpływu na aktywność amylazy różnych czynników, takich jak: temperatura, obecność jonów chlorkowych, silnych kwasów i zasad.

WSTĘP

Hydrolazy glikozydowe to grupa enzymów powodujących hydrolizę wiązań glikozydowych. Do najpowszechniej występujących enzymów w tej podgrupie należą amylazy. Przeprowadzają one hydrolizę skrobi, wielocukru złożonego z jednostek D-glukozy, połączonych wiązaniem glikozydowym. -amylazy rozrywają wiązania położone wewnątrz cząsteczki.

Przebieg procesu degradacji skrobi można śledzić obserwując zmianę barwy roztworu skrobi traktowanego jodem od niebieskiej (kompleks ze skrobią), poprzez fiołkową, czerwoną (kompleks z erytrodekstrynami) do bezbarwnej (utworzenie cukrów o niskim ciężarze cząsteczkowym). W czasie procesu rośnie zawartość cukrów redukujących, produktów hydrolizy skrobi i określając ich zawartość można śledzić przebieg reakcji.

Obecność cukrów redukujących można również stwierdzić wobec odczynnika Benedicta. Próba Benedicta należy do najbardziej swoistych i czułych prób redukcyjnych na cukry. Już 0,1% stężenie cukru redukującego powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. W zależności od ilości glukozy powstaje albo tylko zielone zabarwienie, albo osad żółty, pomarańczowy czy czerwony.

U człowieka enzym -amylaza występuje w ślinie, trzustce, surowicy krwi i moczu. Amylaza śliny i trzustki wykazuje aktywność w roztworach lekko zasadowych, obojętnych i słabo kwasowych. Optymalne pH działania: 6,6. Bardzo duży wpływ na działanie amylazy śliny wywierają elektrolity (Cl-, Br-).

PODSTAWY TEORETYCZNE

Skrobia jest polisacharydem zbudowanym z cząsteczek D-glukozy, które są połączone wiązaniami α-glikozydowymi. Jest ona obecna w roślinach, gdzie pełni rolę nośnika energii niezbędnego w większości procesów metabolicznych.

Skrobia jest zbudowana z dwóch składników strukturalnych amylozy i amylopektyny.

Amyloza tworzy proste, długie łańcuchy o masie cząsteczkowej od 4000 do 15000 Da. Reszty glukozylowe są przyłączane w niej wyłącznie wiązaniami 1→4-α-glikozydowymi.

Natomiast amylopektyna jest tworem rozgałęzionym zbudowanym z krótkich, prostych łańcuchów, złożonych z około 30 jednostek glukozy połączonych wiązaniami 1→4-α-glikozydowymi, a między sobą powiązanych wiązaniami 1→6-α-glikozydowymi. Dzięki obecności tych wiązań jednym z produktów hydrolizy amylopektyny jest izomaltoza. Masa cząsteczkowa amylopektyny jest znacznie większa niż amylozy i przekracza 500 kDa, a sięga nawet do 100000 kDa.

Skrobia jest typowym polisacharydem zapasowym, roślinnym i występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i nasionach wielu innych roślin. Tworzy różnego rodzaju granulki różniące się w zależności od źródła pochodzenia oraz sposobu wydzielania. Większość granulek składa się z kolejnych warstw, które ulegają asocjacji mając postać ziarenek widocznych pod mikroskopem. Stosunek amylozy i amylopektyny jest zasadniczą cechą poszczególnych gatunków skrobi. W tablicy podano niektóre własności skrobi.

Źródło	Kształt	Wielkość [μm]	Amyloza [%]
Algi	kulisty	15	1
Owies	kulisty	25	27
Kukurydza	kulisty	25	52
Jęczmień	kulisty	20	22
Pszenica	kulisty	30	28
Ziemniaki	owalny	40	23
Groch	owalny	40	66

Z przytoczonego zestawienia widać, że jedynie dla pewnych odmian kukurydzy i grochu wartość amylozy przekracza 50%. Ma to istotny wpływ na zdolność hydrolizy skrobi przez enzymy i w konsekwencji na zdolność przyswajania skrobi przez organizmy.

W procesie metabolizmu skrobi pierwszym stadium jest rozkład enzymatyczny na mniejsze fragmenty. Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu do maltozy lub glukozy. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału zapasowego; znalazło to zastosowanie przy otrzymywaniu słodu.

Znane są trzy rodzaje amylaz: α-amylaza zaliczana do endoamylaz oraz β-amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz.

Wszystkie rodzaje amylaz katalizują hydrolizę wiązań 1-4-α-glikozydowych, a zgodnie z nazwą endoamylazy, α-amylaza atakuje wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha, natomiast β-amylaza i glukoamylaza, jako egzoamylazy, rozrywają odpowiednio co drugie lub kolejne wiązania glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha.

Skrobia zawiera obok frakcji amylozy, również frakcję amylopektyny, złożoną z łańcuchów rozgałęzionych. Ponieważ wiązania 1-6-α-glikozydowe, występujące przy rozgałęzieniach w amylopektynie, stanowią barierę dla działania β-amylazy, rozkład tej frakcji skrobi jest inny: boczne łańcuchy są rozkładane przez β-amylazę do maltozy, podobnie jak prosty łańcuch amylozy, po czym reakcja zatrzymuje się na rozgałęzionych wiązaniach 1→6. Powstaje więc nierozłożona, wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna, która stanowi około 40-45% masy amylopektyny i wykazuje znaczną lepkość w roztworze i fioletową barwę z jodem. Rozkładowi ulega ona dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż α-amylaza przeskakuje przez wiązania 1→6-α-, tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być rozkładane przez β-amylazę.

Tak więc, w wyniku działania α- i β-amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy, czyli α-D-glukozylo-1→6-glukozy, oraz niewielkiej ilości wolnej glukozy. Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również 1→4-α-glukozydazę i 1→6-α-glukozydazę (izomaltazę), enzymy te rozkładają wytworzone disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem rozkładu enzymatycznego skrobi. Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt. Rozkłada ona zarówno wiązania 1→4-α-, jak i 1→6-α-glikozydowe i dlatego przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy.

Liczne grzyby nitkowate, bytujące w środowiskach bogatych w polisacharydy, są zdolne do syntezy i wydzielania znacznych ilości amylaz; jest to wykorzystywane przy technicznym ich otrzymywaniu.

WYKONANIE ĆWICZENIA

Sprzęt:

 statyw z probówkami,

 pipety,

 łaźnie wodne o temperaturze 0^oC, 18 ^oC, 37 ^oC, 45 ^oC, 60 ^oC.

Materiał i odczynniki:

 0,5% roztwór skrobi,

 bufor fosforanowy pH 6,6,

 1% roztwór NaCl,

 odczynnik Lugola (roztwór I₂ w KI)

 1M HCl,

 1M NaOH.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie.

Przygotować statyw z probówkami zawierającymi po 0,5 ml odczynnika Lugola i 0,5 ml 1M HCl.

W kalibrowanej probówce (1) zebrać około 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, wymieszać i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC.

Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na 5 minut.

Po 5 minutach do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać, zanotować czas i ponownie wstawić do łaźni wodnej. W krótkich odstępach czasu (od 30s do 3 min) do probówek w statywie, zawierających płyn Lugola, wprowadzać pipetą próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy jodu- punkt achromowy.

Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach / ml. W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37oC, w pH 6,6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem - punkt achromowy.

Przykład obliczenia:

Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml stokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 8 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/8 x 100 = 125 jednostek / ml.

Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność -amylazy.

Jon chlorkowy jest aktywatorem -amylazy. Oznaczyć punkt achromowy jak w zadaniu 1 zastępując w probówce (2) chlorek sodu wodą destylowaną.

Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność -amylazy.

Do czterech probówek odmierzyć po 5 ml skrobi, 2 ml buforu i 2 ml NaCl. Każdą probówkę umieścić w innej łaźni i po 5 minutach dodać do każdej po 1 ml roztworu śliny, zamieszać i oznaczyć punkty achromowe analogicznie jak w zadaniu 1.

Podać optymalna temperaturę dla -amylazy.

Zadanie 4. Wpływ silnych kwasów i zasad na aktywność -amylazy.

Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu śliny. Do pierwszej dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Po 15 minutach zawartość probówek zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić objętość buforem do 5 ml. Do trzech następnych probówek odmierzyć po 2 ml skrobi, 1 ml NaCl, 1 ml buforu pH 6,6. Do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny rozcieńczonej wodą, do drugiej 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej 1 ml śliny traktowanej zasadą. Probówki ponownie umieścić w łaźni wodnej i oznaczyć aktywność -amylazy.

---