JĄDRO KOMÓRKOWE
Organizacja DNA
Podstawową strukturą jest nukleosom ( dysk o wymiarach 11nm x 5-6nm). Jest on utworzony przez oktamer histonów - środek oktameru tworzą histony. H3 i H4, a na obrzeżach zlokalizowane są H2A i H2B. Na dysk ten nawinięta jest nić DNA.długości 146 par zasad. W skład nukleosomu wchodzi ponadto odcinek łączący długości ok. 60 par zasad. Ten ciągły układ tworzy nukleofilament. Daje to duże uporządkowane, zabezpieczenie przed “plątaniem się” nici w przestrzeni. Powoduje to także upakowanie nici - 2x zmniejsza się długość.
Raz wytworzone nukleosomy pozostają w tym samym miejscu (nie przesuwają się wzdłuż nici DNA).ich położenie na nici determinowane jest sekwencją nukleotydow (fragmenty nici zawierające krótkie sekwencje A-T będą się latwiej owijać wokół oktameru niż odcinki pozbawione A-T).
Histon H1 (ma najwięcej lizyny a najmniej argininy) leży na powierzchni nukleosomu i fiksuje całą strukturę - spina wchodzący i wychodzący fragment nici DNA.. W jego strukturze istnieją dwie domeny: globularną - która spoczywa na nukleosomie oraz ogonek - którym może reagować z sąsiednim histonem H1. Powoduje to zbliżanie do siebie poszczególnych nukleosomów, tworząc model zyg-zag. Innym modelem opisującym strukturę upakowywania DNA jest model okrężny- superhelisy, w której na jeden skręt przypada 6 nukleosomów W obu modelach histony H1 znajdują się wewnątrz struktury ściągając ją i tworząc ją bardziej zwartą.
Oprócz białek histonowych chromatynę współtworzą białka niehistonowe, które tworzą pętle oparte o rusztowanie chromatydy . Pętle mogą mieć od 30 - 100 par zasad. Przypuszcza się że w obrębie jednej pętli zlokalizowane są geny powiązane fizjologicznie, aby podczas aktywacji jednej pętli dawała dostęp do wszystkich genów związanych z procesem który “aktywuje” pętle. Białka, które spinają pętle to białka grupy HMG (High Mobility Group - o niskiej ,lub wysokiej masie cząsteczkowej (14, 17 lub 100, 200 kD). .Głownym białkiem rusztowania chromatydy jest enzym odpowiadający za rozkręcanie DNA - topoizomeraza II.
Aktywacja ekspresji genu
Chromatyna aktywna (na poziomie nukleofilamentów) od nieaktywnej (wszystkie struktury powyżej nukleofilamentu) różni się morfologicznie i biochemicznie: aktywna ma większą aktywność nukleazy, słabsze wiązanie hist. H1, a także zwiększona acetylacja histonów rdzenia oraz częściowa fosforylacja hist. H2B. Ufosforylowane białka HMG 14, 17 częściowo zastępują histony H1.
dekondensacja chromatyny:
W rejonie lokalnej kontroli pętli (LCR - powyżej genu) dochodzi do związania pętli z enzymem gyrazą, która rozkręca spiralę, pętla jest rozprostowywana do postaci nukleofilamentu. Dalej zachodzi rozluźnienie kontaktu nici DNA z rdzeniem nukleosomu (dzięki fosforylacji seryny)
rozluźnienie struktury DNA:
Polimeraza RNA w miarę przesuwania się powoduje kolejne rozplątywanie, a związek między DNA i nukleosomem jest utrzymywany dzięki oddz. jonowym - DNA ma ładunek ujemny - (wynikający z obecności gr. fosforanowych) a Histony dodatni, który się jednak zmniejsza gdy histony ulegają acetylacji (a H1 jest modyfikowany przez fosforylację i jego ładunek zmienia się z +5 na -2) następuje rozluźnienie tych wiązań. Histony H1 są zastąpione przez białka HMG14 i HMG17. Regulacja aktywności jest kontrolowana przez dwa enzymy:
HAT - acetylaza - pewne jego elementy wchodzą w skład rdzenia nukleosomu,
HDA - deacetylaza - odpowiada za inaktywacje chromatyny.
Kompleks związany z acetylazą jest aktywującym transkrypcje. Gdy HAT wiąże się z rdzeniem modyfikuje go. Jest to możliwe dzięki podobnej budowie podjednostek HAT i histonów.
różnice chromatyny aktywnej i nieaktywnej:
- podatnością na działanie nukleaz
- luźniejszym wiązaniem histonu H1
- silniejszą acetylacją histonów rdzenia nukleosomu
-przyłączeniem do nukleosomów białek HMG14 i HMG17
- częstszym występowaniem wariantowej formy H2A
Transkrypcja vs Replikacja
Transkrypcja zachodzi w jądrze w tzw. fabrykach transkrypcyjnych (średnio przypada od 300 do 500 na jądro), które uwidacznia się przez podanie znakowanej urydyny W każdym z takich.miejsc pojawia się ok.6o pol;imeraz II. .Transkrypcje można rownież śledzić w momencie obróbki HnRNA(-splicingu) poprzez , tworzenie informosomów.. W jądrze można obserwować także także fabryki replikacyjne (średnio 150 na jądro). Uwidacznia się je podając znakowaną tymidynę. W każdej z takich fabryk występujeę ok. 40 widełek replikacyjnych.
Morfologiczne wskaźniki transkrypcji-translacji
Fabryki transkrypcyjne |
Lokalizacja |
Fabryki replikacyjne |
300-500 na jądro |
|
150 na jądro |
ok. 60 polimeraz RNA II |
jąderka |
ok.40 widełek replikacyjnych |
spliceosomy |
|
|
informosomy |
podj. rybosomów |
|
Procesy transkrypcji i replikacji
Nici DNA z wyróżnionymi centrami aktywnymi, zbliżają się do kompleksów enzymatycznych (związanych z transkrypcją lub translacją) i powstają miejsca prekursorowe, które wykazują wysoką stałość i wysoki stopień uporządkowaniaa DNA w ich obrębie może z łatwością się przesuwać wytwarzając tzw. pętle dodatkowe.
W centrach replikacyjnych gromadzą się białka, stanowiące centra aktywności proliferacyjnej komórki. Są one tworzone dopiero gdy komórki podejmą decyzje o podziale. Odpowiedzialne za to jest białko PCNA (proliferation cell nuclear antygen). Tam także znajdują się inne antygeny K-67 czyli bialko pomocnicze polimerazy.II. Ich obecność wykorzystuje się w celu oznaczania aktywności czynności proliferacyjnych komórki w odniesieniu do diagnostyki i prognozowania.
Istnieją dwie formy chromatyny: euchromatyna, która może być luźna bądź zwarta (aktualnie aktywna i nieaktywną )oraz heterochromatyna, która wogole nie podlega transkrypcji. Ta ostatnia representowana jest przez wysoce powtarzalne selwencje, satelitarnego DNA chromosomu (zlokalizowane wokół centromerów).
Transkrypcja zachodzi na granicy eu- i heterochromatyny. Produkty transkrypcji można stwierdzić przez obecność włókien i ziaren perichromatynowych (RNA z dołączonymi białkami).
W pewnej odległości od tych miejsc pojawiają się ziarna interchromatynowe, gdzie gromadzone są fragmenty spliceosomów.
Produktem transkrypcji jest hnRNA, on jednak nie opuszcza jądra. Dochodzi do wycinania z niego intronów Dokonuje się to przez różne alternatywne sposob splicingu (ta obróbka potranskrypcyjna jest uważana za jedno z największych osiągnięć ewolucji - równocześnie z pojawieniem się tych procesów doszło do wytworzenia otoczki jądrowej).
Transkrypcja jest oddzielona czasowo i przestrzennie (przez istnienie otoczki jądrowej) od translacji. W międzyczasie mają miejsce procesy dojrzewania RNA (włączając w to splicing). Wówczas również dochodzi do ukierunkowania każdego rodzaju z RNA. Np.: snRNA jest zgrupowywane w snRNP, które to biorą udział w procesach splicingu jako jednostki o aktywności enzymatycznej. Snurp's są niewiele większe od rybosomów i porównywalnie lekkie (mają podobną stałą sedymentacji). W okół nich powstają ziarenka informosomów, które przesuwają się w kierunku otoczki jądrowej.
jąderko
Jego pojawienie w komórce uważane jest za sukces ewolucyjny - jest to miejsce transkrypcji rRNA (z małym wyj.- 5s rRNA). Jest tworem chwilowym - tzn. że istnieje jedynie podczas intensywnej transkrypcji rRNA. Tempo tej transkrypcji wynika z tego, że w odróżnieniu do mRNA, który podlega wielokrotnemu odczytowi ( zjawisko amplifikacji - na jednej nici może powstać do 10000 cz. białka) rRNA jest produktem końcowym. Ze wzgledu na duże zapotrzebowanie na rRNA i brak amplifikacji, geny kodujące ten kwas występują w mnogich kopiach (ok. 200)..
Jąderko gęste centra fibrylarne, ziarniste- są to miejsca nagromadzenia produktów transkrypcji rRNA. W niektórych komórkach powstają “bańki”, miejsca gdzie do RNA dołączane są białka, które będą współtworzyć podjednostki rybosomalne. Mała podjednostka rybosomu powstaje szybciej - po ok.30 min. Druga dojrzewa o wiele wolniej!
Otoczka jądrowa
Jest to podwójna błona plazmatyczna. Spełnia następujące funkcje:
komunikację jądra z cytoplazmą - po przez pory jądrowe w obrembie otoczki,
odgranicza procesy - zachodzące w jądrze (transkrypcja) od procesów w cytoplaźmie (np.: translacja),
ochrona chromosomów przed elementami cytoszkieletu - Otoczka zapobiega rozerwaniu chromosomów otoczka pojawiła się wraz z pojawieniem się cytoszkieletu - jego elementy mogłyby wywoływać nadmierne napięcia w obrębie chromosomów,
określaniu jednostek replikacyjnych - rozluźnione elementy chromatyny są do niej przytwierdzone za pomocą białek, którymi są laminy, a dokładnie ich końców tyrozynowych,
określa czas replikacji - gwarancje odpowiedniej koordynacji metabolizmu DNA - utrzymanie stałego stosunku 1 replikacji na jeden cykl komórkowy.
W skład otoczki wchodzą laminy otoczki jądrowej, które można podzielić na A, B i C przy czym laminy C są produktem alternatywnego splicingu
Podczas interfazy lamina B łączy się z:
- chromosomami
- laminą A
- otoczką jądrową (receptor dla lamin p58 oraz LAPs - “lamina associated peptides”)
Podczas mitozy laminy A odłączone są od błony (fosforylacja) zaś laminy B pozostają przy błonie; pęcherzyki “przejściowo dokują” przy IF wimentynowych.
pory jądrowe
Warunkują kontakt z cytoplazmą. Mają średnicę ok. 50-80 nm. Wnętrze jest wypełnione kompleksem poru. Składa się on z dwóch głównych pierścieni: cytoplazmatycznego i jądrowego Pierścień cytoplazmatyczny zawiera oktamer globularnych białek., z którymi łączą się filamenty zwrócone do cytoplazmy. Filamenty te mają stanowić miejsce dokowania substancji, które są adresowane do jądra. Od strony cytoplazmatycznej znajduje się koszyczek, który stanowi zabezpieczenie przed „przepuklinami” chromatynowymi, oraz bierze udział w dokowaniu substancji eksportowanych z jądra. Centralne miejsce w obrębie kompleksu pory zajmuje tzw. transporter centralny odpowiedzialny za kontrolę substancji transportowanych do i z jądra. Białka wchodzące w skład pierścieni łączą się z transporterem centralnym za pomocą promieniście ułożonych szprych.
Transport jądrowy: import i export
Swobodny przepływ prze pory jądrowet dotyczy cząstek o wielkości 5-10x mniejszej od średnicy poru, tj. o średnicy do ok. 9 nm.:jonów, nukleotydów (ATP, GTP, cAMP).
import do jądra:
Dotyczy oprócz wspomnianych elementów (jany, ATP, nukleotydów), cząstek znacznie większych jakimi są białka:
histony - importowane są w fazie S cyklu komórkowego., po czym od razu są odpowiednio modyfikowane (acetylowane i deacetylowane) -. Najszybciej importowane są histony H3 i H4, później natomiast H2A i H2B.
białka zrębu jądra - białka szkieletu takie jak nukleofilamenty czy nukleofibrylle, etc.
Sam proces wchodzenia do jądra wymaga obecności odpowieniego odcinka sygnałowego NLS, w skład którego wchozą aminokwasy o cherakterze zasadowym. W samym transporcie uczestniczą następujące czynniki:
hsp 70* , zachowuje konformację właściwą dla transportu
NLS receptor (importyna ) wiąże się z odcinkiem NLS
importyna - pośredniczy w wiązaniu kompleksu NLS-importyna do poru
Ran** (GTP-aza), przełącznik skierowujący transportowany kompleks do dalszych etapów przemieszczenia
p10** (NTF2 ), może ułatwiać przejście kompleksu do miejsca dokowania do bramkowanego kanału
Mechanizm importu białek do jądra:
rozpoznanie sygnału NLS przez receptor cytoplazmatyczny NLSR (54/56 kD) lub importyna α przy udziale hsp 70
przyłączenie do cytoplazmatycznego pierścienia poru (fibrylli cytoplazmatycznych) p97, Ran-GTP
przesunięcie w pobliże kanału centralnego poru - odl. 50-100 nm (zmiana konformacji białka fibrylli (Tpr) - hydroliza GTP
przeniesienie do jądra po otwarciu kanału (30 nm) NTF2
uwolnienie do nukleoplazmy (ligand, NSLR, Ran-GDP)
powrót czynników transportujących
export z jądra:
Dotyczy: mRNA, tRNA, rRNA (w formie podjednostek rybosomów), splajsomowowego RNA, snRNA. Kwasy transportowane są rzaem z białkami, które zawierają Sygnał Eksportu Jądrowego ( Nuclear Export Signal - NES bogaty w leucynę) :
Mechanizm eksportu białek z jądra:
rozpoznanie przez receptor (w kompleksie poru)
- kilkustopniowe przemieszczanie się rybonukleoproteidu zależne od energii
- uwolnienie RNA w cytoplaźmie
- recyrkulacja białka
* - nie jest niezbędne
** - docierają do jądra razem z kompleksem
Cytobiologia Medyczna
5