Elektroforeza białek na żelu poliakrylamidowym w układzie Laemmli'ego.
Cel ćwiczenia:
Zastosowanie elektroforezy w warunkach denaturujących i redukujących do wyznaczania masy cząsteczkowej białek.
WYKONANIE:
Przygotowanie żelu rozdzielającego (12% dla białek o masach od 10-100 kDa). APS i TEMED dodać tuż przed wlaniem roztworu między szklane płytki [proporcje na 2 żele w systemie MINI-PROTEAN BioRad]. Nawarstwić na powierzchnię żelu trochę dH2O i pozostawić do spolimeryzowania.
dH2O |
3,35 ml |
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 |
2,50 ml |
10% SDS |
0,10 ml |
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml) |
4,00 ml |
10% APS (nadsiarczan amonu) |
50 μl |
TEMED |
5 μl |
Żel zagęszczający 4%
dH2O |
3,06 ml |
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 |
1,26 ml |
10% SDS |
50 μl |
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml) |
0,76 ml |
10% APS (nadsiarczan amonu) |
30 μl |
TEMED |
3 μl |
Powierzchnię żelu rozdzielającego należy osuszyć z wody, a następnie na tak przygotowany żel wylać roztwór żelu zagęszczonego, włożyć grzebienie i pozostawić do spolimeryzowania.
Bufor do próbek
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 |
0,25 ml |
10% SDS |
0,4 ml |
glicerol |
0,2 ml |
2-merkaptoetanol |
0,1 ml |
Bromophenol Blue |
Do lekko niebieskiego zabarwiena |
Bufor elektrodowy: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, 0,1% SDS.
Przygotowanie próbek: próbki zmieszać w stosunku 1:3 z buforem próbkowym i wstawić je do termobloku (100°C) na 5 minut. Identycznie należy postąpić z markerami mas cząsteczkowych białek. Płytki z gotowym spolimeryzowanym żelem zamontować z aparacie do elektroforezy. Do aparatu wlać bufor elektrodowy i wyciągnąć grzebienie, przepłukać studienki buforem elektrodowym. Do studzienek nałożyć wszystkie przygotowane próbki.
Elektroforeza: 100 V (do czasu, aż barwnik nie osiągnie żelu rozdzielającego), a następnie 180 V (do czasu aż barwnik nie osiągnie końca żelu).
Barwienie żeli:
I./
Żel utrwalić 30 min. w 50 % metanolu + 10 % kwas octowy.
Barwienie 2 godz. w 0.025 % CBB R-250 w 10 % kwasie octowym.
Odbarwianie w 10% kwasie octowym.
II./
Barwienie: 0,2% CBB-R250; 0,05 G-250 w 40% metanolu + 10% kwas octowy.
Odbarwianie w 40% metanolu + 10 % kwas octowy, a później w 7% kwasie octowym.
OPRACOWANIE WYNIKÓW - wyznaczanie masy cząsteczkowej białek
Zmierzyć odległość wędrówki barwnika, odległości wędrówek poszczególnych białek markerowych oraz próbki nieznanego białka.
Obliczyć względną ruchliwość elektroforetyczną (u) zidentyfikowanych białek.
Wykreślić zależność u od log M dla markerów. Na podstawie wykresu określić masę cząsteczkową nieznanego białka.
Analiza instrumentalna - ćwiczenia [BM]
1