Laboratorium z biochemii
Białka
Wykonały
XXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXX
Cel ćwiczenia:
Naszym zadaniem było zapoznanie się z budową, funkcjami i właściwościami białek.
Wstęp teoretyczny:
Białka (proteiny, z gr. Proteios - oznacza pierwszorzędny) to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Odgrywają one wiodącą rolę w czynnościach i budowie komórki.
Do ich funkcji należą m.in.:
- kataliza enzymatyczna
- transport i magazynowanie wielu cząsteczek i jonów
- czynności mechaniczno-strukturalne (np. budowa mięśni)
- ochrona immunologiczna
- wytwarzanie i przewodzenie impulsów nerwowych
- kontrola wzrostu komórek i organizmów
Podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek są L-aminokwasy. Grupa karboksylowa jednej cząsteczki łączy się z grupa aminową drugiej poprzez tzw. wiązanie peptydowe. Związane w ten sposób tworzą strukturę łańcucha polipeptydowego.
Naturalne białka zawierają od ok. 50 do 2000 reszt aminokwasowych, których przeciętna masa wynosi około 110.
Masy cząsteczkowe łańcuchów polipeptydowych wahają się w granicach od 5500 do 220 000 jednostek masy atomowej. Jednakże masę protein wyraża się na ogół w Daltonach.
1 Dalton odpowiada 1 jednostce masy atomowej.
1 kDa = 1000 Daltonów
W budowie białek uwzględniamy cztery poziomy ich struktury.
Struktura I rzędowa - określająca sekwencję aminokwasów.
Struktura II rzędowa - opisująca wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej przykładem tego może być postać helisy α.
Struktura III rzędowa - odnosząca się do przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych , oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz lokalizacji mostków disiarczkowych.
Struktura IV rzędowa - określa białka składające się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego. Wtedy taki łańcuch nazywamy podjednostką, a struktura ta opisuje ich wzajemne położenie i rodzaj kontaktu między nimi.
Klasyfikacja białek jest trudna i możemy ją przeprowadzić biorąc pod uwagę różne cechy protein.
I tak, ze względu na rozpuszczalność wyróżniamy:
- albuminy - dobrze rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach kwasów i zasad.
- globuliny - rozpuszczalne w wodzie dopiero po dodaniu dobrze dysocjującej na jony soli (proces wsalania).
- prolaminy - rozpuszczalne tylko w stężonym etanolu.
- gluteiny - rozpuszczalne tylko w rozcieńczonych roztworach kwasów i zasad.
Klasyfikacja na podstawie kształtów przeprowadzona na podstawie stosunku osiowego(długości do szerokości)
- białka globularne - łańcuchy polipeptydowe są pofałdowane i zwinięte.
- białka włókienkowe - zawierające odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo lub heliakalnie.
Klasyfikacja na podstawie czynności:
- strukturalne
- katalityczne
- transportowe
A także podział na :
- białka proste - zbudowane tylko z reszt aminokwasów
- białka złożone - zawierające w cząsteczce składnik niebiałkowy
Proteiny posiadają właściwości takie jak:
- zbliżony skład pierwiastkowy
- są związkami optycznie czynnymi
- są hydrofilowymi układami koloidalnymi
- są amfoterami
- ulegają denaturacji
- ulegają wysalaniu i wytrącaniu
Cztery ostatnie z właściwości zostały przez nas zaobserwowane podczas wykonywania omawianego ćwiczenia.
Przebieg doświadczenia:
Izolowanie białek roślinnych
A)Ekstrahowanie albumin i globulin.
W 25 ml. 0.5 molowego roztworu KCl przeprowadziłyśmy ekstrakcję 1g. mączki grochowej. Otrzymany poprzez wirowanie supernatant analizowałyśmy w dwóch próbach.
a) w pierwszej wykazywałyśmy białko za pomocą reakcji biuretowej.
b) w drugiej należało rozlać do dwóch probówek po 1ml. ekstraktu mączki. Następnie dodać do pierwszej 8ml. wody, a do kolejnej taką samą ilość 0.5 molowego roztworu KCl.
W zadaniu a) po przeprowadzeniu reakcji Piotrowskiego otrzymałyśmy roztwór o zabarwieniu fiołkowym (podobnie w przeprowadzonym równolegle oznaczeniu białka jaja kurzego)
Obserwacje i wnioski:
a)W środowisku zasadowym nastąpiło zawiązanie kompleksu białka z jonami miedzi, czego barwny efekt mogliśmy zaobserwować. W probówce zawierającej tylko wodę reakcja nie nastąpiła.
b)W tej próbie po dodaniu do ekstraktu wody powstało białe zmętnienie, następnie po dolaniu KCl powrócił do bezbarwnego roztworu. W drugiej próbie po dodaniu KCl najpierw otrzymałyśmy bezbarwny roztwór,a osad pojawił się dopiero po dodaniu kolejnej porcji soli.
B)wydzielenie glutenu:
Przygotowałyśmy ciasto z 30g. mąki pszennej i wody. Odstawiłyśmy je na pół godziny, by nastąpiło uwodnienie i spęcznienie białka. Następnie wygniatając ciasto pod strumieniem zimnej wody wypłukałyśmy skrobię. Otrzymaną w ten sposób substancję o gumowatej i ciągnącej konsystencji rozpuściłyśmy w 30ml. roztworu NaOH o stężeniu 0.2 mola.
Na koniec przeprowadziłyśmy reakcję Piotrowskiego, by sprawdzić obecność białka.
Obserwacje i wnioski:
Wynikiem próby była fiołkowa barwa roztworu, co świadczy o obecności białka.
Dane zadanie pozwala zaobserwować, iż by rozpuścić białko najlepiej wykorzystać roztwór soli kwasów lub zasad. Jeżeli mamy do czynienia tylko z albuminami wystarczy nam jako rozpuszczalnik woda, jednakże jeśli w danej próbie znajdują się również globuliny, do ich rozpuszczenia konieczna jest obecność jonów soli.
Wysalanie białek
Do objętości = 10ml roztworu białka jaja kurzego dodałyśmy stały siarczan amonu, aż do momentu uzyskania roztworu nasyconego. Powstały osad będący efektem dehydratacji cząsteczek białka rozpuściłyśmy w roztworze KCl i przeprowadziłyśmy próbę biuretową.
Obserwacje i wnioski:
Wynikiem reakcji jest roztwór o zabarwieniu fiołkowym co świadczy o obecności protein. Ta sama próba przeprowadzona dla przesączu pozostaje bez efektu, co świadczy o całkowitym wysoleniu białka.
W podanym zadaniu przeprowadziłyśmy proces całkowitego wysolenia białka. Ilość dodanej soli (siarczanu amonu) była duża, co wskazuje na obecność w białku albumin. Posiadają one wiele grup hydrofilowych, a ich płaszcz wodny jest niewielki w porównaniu do otoczki wodnej globulin. W efekcie ich wysalanie następuje w roztworach soli o wyższym stężeniu.
Dehydratacja przeprowadzona za pomocą soli metali lekkich jest procesem odwracalnym. Dodanie wody do roztworu sprawi, że białko wróci do swojej poprzedniej postaci.
Białka jako koloidy.
Do probówek zawierających: w pierwszej - 1 ml wody i w drugiej taką samą ilość wody dodawałyśmy po 1ml azotanu srebra. Wymieszałyśmy i następnie dodałyśmy niewielką ilość chlorku sodu.
Obserwacje: i wnioski:
Początkowo w probówce zawierającej białko z solą sodową nastąpiło zmętnienie, które po dodaniu soli sodowej zniknęło.
W probówce z wodą początkowo roztwór był klarowny, a zmętnienie nastąpiło dopiero po dodaniu NaCl.
W tym ćwiczeniu możemy zaobserwować właściwości białka jako koloidu hydrofobowego. W roztworze soli AgNO3 z białkiem układ wytworzył koloidalną zawiesinę hydrofobową, która traci swój charakter dopiero po dodaniu soli mocnego elektrolitu. Woda nie posiada takich właściwości, dlatego efekt zaobserwowaliśmy dopiero po dodaniu NaCl.
Amfoteryczność białek
A)Strącanie białek za pomocą kationów i anionów.
Do probówek odmierzyłyśmy kolejno po 2 ml białka jaja kurzego o pH = 3,0; 4.7; 8.0, następnie dodałyśmy niewielkie ilości roztworów soli: siarczanu miedzi, octanu ołowiu i wolframianu sodu.
Odczynnik |
1 % roztwór białka jaja kurzego |
||
|
pH = 8.0 |
pH = 4.7 |
pH = 3.0 |
10% siarczan miedzi |
+ |
- |
- |
10% octan ołowiu II |
- |
- |
- |
10% wolframian sodu |
- |
- |
+ |
Obserwacje i wnioski:
Jak zaobserwowałyśmy w powyższym zadaniu w probówce zawierającej białko o pH = 4.7 żadna z reakcji nie dała produktu. Przyczyną tego jest to, iż przy takim pH występuje pI, czyli tzw. punkt izoelektryczny danego białka, będący jego własnością charakterystyczną.
Podobnie jak aminokwasy, z których proteiny są zbudowane, znajdują się one w stenie „obojętnym”.
Białko o pH = 8.0 przyjęło charakter wieloanionowej zasady i w reakcji z siarczanem miedzi oraz octanem ołowiu, wytrąciło osad ( zostały wytworzone sole z kationami miedzi i ołowiu).
Natomiast przy pH = 3.0 białko przyjęło charakter kwasowyi zareagowało z solą wolframianu, która jest pochodna mocnej zasady.
B)Wpływ kwasów organicznych na białka.
Kwas
|
Obserwacje
|
6% kwas sulfosalicylowy
|
zmętnienie |
10% kwas trójchlorooctowy
|
zmętnienie
|
5% kwas octowy
|
brak reakcji
|
Do trzech probówek dodałyśmy po 1 ml roztworu białka kurzego i następnie dolałyśmy taką samą ilość kwasu.
Obserwacje i wnioski:
W danej próbie mogłyśmy zauważyć, że największa ilość osadu wytrąciła się w reakcji z kwasem trójchlorooctowym, zaś w probówce zawierającej kwas octowy nie nastąpiło wytrącenie.
Wskazuje to na fakt, iż białko uległo reakcji z mocnymi kwasami dając sole - białczany.
Kwas THC zawiera trzy atomy chloru, które charakteryzują się dużą elektroujemnością, zaś kwas sulfosalicylowy zawiera siarkę, która także należy do bardzo aktywnych atomów. Ponieważ są to mocne kwasy może dojść do denaturacji białka.
Kwas octowy jest słabym kwasem, nie jest więc w stanie wytrącić soli w reakcji z białkiem.
Denaturacja białka
Do trzech probówek dodałyśmy po 2 ml białka jaja kurzego o pH = 8.0; 4.7; 3.0. Umieściłyśmy je w łaźni wodnej o temp ok. 100 C. Po 15 minutach schłodziłyśmy probówki i dodałyśmy do roztworów o pH = 8.0 i 3.0 po 5 ml buforu octanowego.
Obserwacje i wnioski:
Po ogrzaniu białka następuje jego denaturacja, jest to spowodowane uszkodzeniem uporządkowanej struktury protein. Zniszczone zostają mostki wodorowe i disiarczkowe oraz wiązania jonowe.
W probówce o pH = pI nastąpiło wytrącenie białka, co świadczy o tym, iż punkt izoelektryczny nie zmienił swojej wartości. Nastąpiła natomiast koagulacja białka.
W probówce zawierającej białko o pH = 8.0 nastąpiło wytrącenie niewielkiego osadu, natomiast w probówce zawierającej proteiny o pH = 3.0 nie wytrącił się osad. Świadczy to o tym, iż nie nastąpiła duża zmiana pI, a także o fakcie, że białko denaturowane nie zawsze może wytrącić osad.
6