21.04.2009r.
Laboratorium z biotechnologii
Ćwiczenie nr 7
Temat:
Uwalnianie produktów wewnątrzkomórkowych.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wydzielanie wewnątrzkomórkowej lipazy z pleśni z Mucor circinelloides różnymi metodami dezintegracji komórek.
Wykonanie ćwiczenia i opracowanie wyników
Do ćwiczenia wykorzystano szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej, hodowany na wytrząsarce w czasie 72h w temperaturze 30°C na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy.
Wydzielano enzym z komórki Mucor circinelloides różnymi metodami:
Metoda I
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i następnie dodano 5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Metoda II
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i następnie dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7 i 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Metoda III
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do moździerza i roztarto używając kulek ze szkła bezołowiowego z 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7. Następnie całość przeniesiono do szklanego naczynia i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Metoda IV
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7. Następnie homogenizowano przez 2 minuty homogenizerem mechanicznym. Całość przeniesiono do naczynia szklanego i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Metoda V
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7
i 2-krotnie zamrożono do temperatury -20°C i rozmrożono. Całość przenieść do naczynia szklanego i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Metoda VI
Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do erlenmayerki i zalano 5ml acetonu. Zawartość mieszano przez 5 min i odsączono na sączku bibułowym. Przemywanie 3ml acetonu powtórzono jeszcze 2-krotnie. Odwodnioną grzybnię suszono pod wyciągiem na sączku przez 15min. Całość przenieść do naczynia szklanego i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7 i 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.
Otrzymane przesącze zbadano na aktywność esterazową lipazy:
Jako substrat wykorzystano 50 μmol/cm3 roztwór octanu p-nitrofenolu, przed użyciem 5-krotnie rozcieńczonego, który pod wpływem esteraz oraz lipaz jest hydrolizowany z wydzieleniem
p-nitrofenolu, który wykazuje maksimum pochłaniania światła przy długości fali λ=399nm.
Oznaczenie wykonano w następujący sposób:
Do probówek wprowadzano po 0,1ml każdego z ekstraktu oraz 0,8ml 0,05M buforu fosforanowego o pH=7
Tabela nr 1 - zestawienie otrzymanych wyników:
Metoda/Grupa |
I |
II |
III |
IV |
aktywność |
MI - bufor |
0,180 |
0,222 |
0,112 |
0,14 |
|
MII - cholan |
0,216 |
0,244 |
0,145 |
0,237 |
|
MIII - rozcieranie |
0,557 |
1,898 |
0,433 |
1,138 |
|
MIV - homogenizer |
0,242 |
1,054 |
0,580 |
1,184 |
|
MV - wymrażanie |
0,208 |
0,773 |
0,167 |
0,401 |
|
MVI - aceton |
0,894 |
1,333 |
0,500 |
1,084 |
|
K=0,076 [jA*ml/μmol]
A=K*c => c=A/K
c1=0,18/0,076=2,37μmol/ml
Tabela nr2 - zestawienie otrzymanych stężeń p-nitrofenolu:
Metoda/Grupa |
I [μmol/ml] |
II [μmol/ml] |
III [μmol/ml] |
IV [μmol/ml] |
aktywność |
MI - bufor |
2,37 |
2,92 |
1,47 |
1,84 |
|
MII - cholan |
2,84 |
3,21 |
1,91 |
3,12 |
|
MIII - rozcieranie |
7,33 |
24,97 |
5,70 |
14,97 |
|
MIV - homogenizer |
3,18 |
13,87 |
7,63 |
15,58 |
|
MV - wymrażanie |
2,74 |
10,17 |
2,32 |
5,28 |
|
MVI - aceton |
11,76 |
17,54 |
6,58 |
14,26 |
|
Akt. = c*2*R*10-6 / t
t-czas reakcji enzymatycznej =15min R-rozcieńczenie =50 (wzięto 0,1ml z 5ml)
2-wzięto do reakcji 0,5g biomasy 10-6 - μmole
Akt.1 = 2,37*2*50*10-6 /15=1,58*10-5 mol/(g*min)
umol/ml*t
Metoda/Grupa |
*10-6 |
*10-6 |
*10-6 |
*10-6 |
aktywność *10-6 |
MI - bufor |
15,80 |
19,47 |
9,80 |
12,27 |
12,62 |
MII - cholan |
18,93 |
21,40 |
12,73 |
20,80 |
20,38 |
MIII - rozcieranie |
48,87 |
166,47 |
38,00 |
99,80 |
74,34 |
MIV - homogenizer |
21,20 |
92,47 |
50,87 |
103,87 |
71,67 |
MV - wymrażanie |
18,27 |
67,80 |
15,47 |
35,20 |
26,74 |
MVI - aceton |
78,40 |
116,93 |
43,87 |
95,07 |
86,76 |
Wnioski
Najbardziej efektywną z badanych metod uwalniania produktów wewnątrzkomórkowych jest przemywanie acetonem. Najmniej efektywną zaś, sączenie po samym inkubowaniu biomasy w buforze fosforanowym. Podobną aktywność wykazuje enzym wydzielony metodą rozcierania i homogenizacji.
enzym wewnątrzkomórkowy,
metoda nie jest specyficzna na lipazy
metoda oznaczenia esteraz
odczytujemy poziom esteraz
cholan sodu usuwa częściowo ze ściany komórkowej substancje lipidowosacharydowo - tworzą się kanały -
lipaza wypływa z komórki
dodanie cholanu do nasyconej wodą biomasy - nie ma sensu
jeżeli zastosujemy dezintegrację mechaniczną, a potem do komórki dodamy cholan sodu - dostęp duży do komórki - możemy wydzielić lipazę
użycie mechanicznych - kulki, homogenizer
dobra jest dezintegracja mechaniczna i cholan - dobra metoda (sulfaktanty)
zamrażanie i wymrażanie - w zależności jak bardzo zamrożono,
metoda - trwa długo - trzeba mieć pewność że woda zamarzła w komórce (potrzeba godzinę, albo dwie)
aceton -wymywa kompleksy polisacharydowolipidowe - ze ściany komórkowej, tworzą się naturalne kanały, gdzie wchodzi aceton i następuje wymienianie wody - woda wypływa na zewnątrz, pozostaje lipaza in situ na matrycach komórkowych,
bardzo łatwo wnika cholan sodu i wypływa kompleks cholan-enzym
dobra metoda do przygotowania większej ilości
nie mamy dobrych warunków żeby odróżnić
wszystkie metody prowadzą do dezintegracji ściany komórkowej
wszystkie są dobre do wydzielenia enzymu z komórki, pod warunkiem, że użyjemy cholanu
jak wyznaczyć aktywność
współczynnik kierunkowy prostej dla p-nitrofenolu K=0,067 [jA*ml/uM]
ze steżenia ilość p-nitrofenolu
c-steżęnie p-nitrofenolu wyznaczamy sobie ilość /g grzybni na minutę
drobnoustroje które równocześnie wytwarzają enzymy wewnątrzkomórkowe - lipazy i lipidy
badanie micelium do badań - tłuste - bo lipidy wydzielane przez grzyb nitkowaty, cenne lipidy, zawierające karotenoidy, (do kosmetyków? - doskonałe właściwości), zaleta - co tydzień można zbierać
lipazy - triacyloglicerolohydrolazy hydrolizują glicesterazy , esterazy specyficzne, działają na substancje nierozpuszczalne w wodzie
enzymy wytwarzane przez drobnoustroje, pozakomórkowe - wydzielane do środowiska,
interesujące właściwości - bardzo hydrofobowe, oczyszczone, rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych, termostabilne w rozpuszczalnikach organicznych, w eterze naftowym ogrzewanie długo, 100st. niewiele obniża aktywność,
synteza biodisel acydolizy metody chemiczne - duże zanieczyszczenie, u nas w kolumnie - odpowiednia forma lipazy - lepsze dla środowiska,
enzym silnie związany w komórce, prawdopodobnie z membranami, nie znajduje się w przestrzeni peryplazmatycznej, nie chce samoistnie wypłynąć z komórki, unikalne enzymy, tylko u nas na wydziale,
nie możemy stosować ultradźwięków,
rozmrażanie i zamrażanie - też zła metoda,
nie odważamy 1g, tylko 0,5g
badamy przesącz
czy rzeczywiście wypływa z buforu o pH=7 nasza lipaza najwyższa aktywności
pranie w pH ok.12
enzym modyfikowany genetyczne - stosowany w proszkach do prania,
nasz naturalny szczep - jak się nauczymy to
pH może być ujemne -2,2 do 16,5 - szerszy
dodajemy sulfaktanta - cholan sodu - dobry detergent na lipazy
enzymy dobrze związane z rejonami w komórce, żeby tłuszcz który zjemy zemulogwać i rozłożyć, wytwarzany w organizmie - naturalnie, działa tak - częściowo usuwa kompleksy polisacharydowo-białkowe, które są w ścianie komórkowej, enzym wypłynie poza komórkę,
dezyntegracja mechaniczna, może być więcej enzymy wydostającego się z komórki, moździeże, roztarto w moździerzu używając kulek ze szkła bezołowiowego, do wydobywania substancji wewnątrzkomórkowych, (ołów - inhibitor enzymów) 0,25-0,3mm wielkość kulek, odważono 0,5 g wsypać troszkę kulek - niewiele, na czubku, rozcierając tak żeby tłuczek toczył się po kulkach, przeniesiono do innego naczynia, dodano cholanu, inkubowano w temperaturze, odsączono na sączku biubłowym
dezintegracja mechaniczna - ostrze tnie biomasę, naczynka - po filmach fotograficznych, nie potrzeba chłodzić w łaźni, nowy homogenizator, po homogenizacji, dodać cholanu, wymieszać, inkubować,
micelium, 4,5ml buforu, do zamrażarki - po zamrożeniu wyjęto i rozmraża w dłoni i drugi raz zamrożono, w środku komórki - temperatura zamarzania - obniżona, po dwukrotnym rozmrożeniu i odmrożeniu dodano 0,5 ml cholanu sodu, przesączono - próba do analizy
odwodnienie próby acetonem w kolbie erlenmayerka 100ml, wlać 2-3 ml acetonu, bagietką rozprowadzono biomasę, aceton usuwa kompleksy lipopolisacharydowe, przez kanały aceton wpływa do komórki, na koniec jeśli 3 razy wymieszano, ugniatanie bagietką, przez lejek wylewa się aceton, biomasa - zawraca się do kolby i ponownie dodaje acetnu,
biomasę - na sączek , wyjmuje z lejka, pod wyciągiem ustawić, suchą biomasę - odwodnioną, ekstrakcja lipazy - 4,5ml buforu, 0,5ml cholanu
6 probówek z ekstrakcji +1 z wodą
0,1 ml pobrać 0,8ml buforu i z probówkami przyjść i pobrać - na końcu substrat 0,9ml - buforu i 0,1ml substratu -
aktywność lipazy względem octanu p-nitrofenolu
będziemy hydrolizować octan p-nitrofenolu (r-r bezbarwny) - metoda pośrednia
kwas octowy i p-nitrofenol (barwa żółta ) powstaje - badanie spektrofotometrem - przy długości fali 399
rozcieńczenie 5-krotnie wodą
zadania kalkulatory
kolokwium g.16
S-4
zadania
+teoria niezbędna
czasami ćwiczenie nie wychodzi - dowód na istnienie diabła , a jak diabła to i wyżej :P
1