Pożywki mikrobiologiczne służą do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych

POŻYWKI MIKROBIOLOGICZNE służą do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych. Stosuje się je do namnażania, izolacji, różnicowania i identyfikacji oraz oznaczania cech fizjologicznych i biochem. Każde podłoże powinno zawierać odpowiednią ilość subst odżywczych, czynników wzrostowych, wody, tlenu, muszą posiadać właściwe pH i temp.

PODZIAŁ POŻYWEK ZE WZGLĘDU NA:

-dobór składników, -zawartość skł odżywczych, -cel hodowli, -konsystencję

1. Podział ze względu na dobór składników

-naturalne - przygotowane ze skł nat, np. mleko, serwatka, bulion, brzeczka, wyciąg z ziemniaków, drożdży

-półsyntetyczne - wykonane z syntetycznych zw chem i skł nat, np. mleko z lakmusem, czy agar ziemniaczany z tiaminą

- syntetyczne - składające się z subst syntetycznych.

2. Ze wzgl na zawartość skł odżywczych podłoża dzielimy na:

-podstawowe - stanowią bazę do przygotowania wszystkich innych pożywek, np. bulion, brzeczka

-wzbogacone - z dodatkiem czynników wzrostowych, np. bulin z ekstraktem drożdżowym i glukozą.

-podłoża transportowe - do przenoszenia materiału mikrobiologicznego od pacjęta do laboratorium, jest to zbuforowane podłoże min

4. Zależnie od celów jakie mają spełniać określone pożywki, dzielimy je na:

- namnażające lub namnażająco-wybiórcze - które stosujemy wówczas gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka, np. podłoże płynne z czterotionianem sodu

-izolacyjne - zawierają składniki wybiórcze hamujące wzrost mikroflory niepożądanej, oraz składniki pozwalające na odróżnienie kolonii drobnoustrojów chorobotwórczych od saprofitycznych np. P. Baird-Parkera, Endo i In.

-identyfikacyjne - na które przesiewa się kolonie drobnoustrojów z podłoży izolacyjnych.

5. Pożywki pod względem konsystencji dzielimy na:

-płynne - służą do namnażania lub badania właściwości biochem mikroorganizmów, np. bulion odżywczy

-półpłynne - zawierające 0,1-0,7% agaru, badamy na nich ruch bakterii

-stałe - otrzymuje się je dodając czynnik zestalający, agar lub żelatynę

-zawartość zw będących źródłem węgla i energii: węglowodany (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia) zawartość cukru w pożywce 0,5-2%, alkohole i kw org

-zawartość zw będących źródłem azotu: zw nieorg (sole amonowe, azotany), zw org (pepton, żelatyna, krew, aminokwasy). Zawartość zw azotowych w pożywce waha się od 0,5-2%

- zawartość zw min - dodawane w małych ilościach stanowią źródło odpowiednich pierwiastków: fosforu, wapnia, magnezu, potasu

-zawartość innych subst wzrostowych, witamin, zasad purynowych i pirymidynowych.

-odpowiednie pH, żeby zachować odpowiednie stężenie jonów wodorowych do pożywek dodaje się takich zw buforujących jak fosforany, optymalny odczyn większości bakterii waha się od 7,0-7,2, a grzybów od 5,8-6,5

-hodowle statyczne - polegają na jednorazowym zaszczepieniu kulturą bakteryjną określonej ilości pożywki. Wzrost drobnoustrojów będzie występował do momentu wyczerpania się składników odżywczych, lub zatrucia drobnoustrojów produktami ich własnej przemiany materii

-hodowle ciągłe - polegają na stałym wprowadzeniu do hodowli określonej ilości nowej pożywki i odprowadzeniu takiej samej ilości pożywki zużytej, zapewniają ciągły rozwój drobnoustrojów

- hodowle synchronizowane - synchronizację osiąga się przez selekcję osobników znajdujących się w tym samym stadium rozwojowym.

METODY OTRZYMYWANIA CZYSTYCH KULTUR:

1.Metoda rozcieńczeń - polega na rozcieńczeniu badanej zawiesiny tak żeby w 1cm3 znajdowała się teoretycznie 1 komórka

2.Metoda płytkowa polega na wysiewie odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny drobnoustrojów na podłoże stałe, inkubacji i liczeniu wyrosłych koloni. Najlepsze jest także rozcieńczenie żeby w 1cm3 znajdowało się od 30-300 kolonii.

METODY PRZECHOWYWANIA CZYSTYCH KULTUR.

Hodowle drobnoustrojów należy przechowywać w warunkach utrzymujących je w pewnej żywotności i nie mających wpływu na zmiany ich cech charakterystycznych. Hodowle przechowuje się w temp 4C, bez dostępu światła.

Metoda, która pozwala na wieloletnie przechowywanie szczepów jest liofilizacja.

Liofilizacja - polega na wysuszeniu w próżni zamrożonych komórek drobnoustrojów

W zależności od konsystencji wysiewanego materiału oraz zaszczepionej pożywki wyróżnia się następujące metody przeszczepienia:

-na pożywkę płynną (przy użyciu pipety lub ezy)

-na pożywkę o stałej konsystencji w płytce, metoda wysiewu powierzchniowego oraz metodą wgłębną laną (z użyciem pipety)

2. z pożywki stałej przy użyciu ezy:

-na podłoże o stałej konsystencji umieszczonej na płytce

-celuloza jest podst skł materiału roślinnego

-składa się z łańcuchów utworzonych z jednostek B-D-glukopiranozy połączonych wiązaniem 1,4-glikozydowym

-liczba reszt glukozowych wacha się od 3500 u bakterii Acetobacter xylinum, 14000 u roślin, do 25000 u zielenicy Walonia

-podstawową jednostką celulozy jest disacharyd celobioza

-duża wytrzymałość mechaniczna oraz nierozpuszczalność celulozy wiąże się z obecnością między- i wewnątrzcząsteczkowych mostków wodnych

-celuloza jest katalizowana przez celulazę

-celuloza jest rozkładana w warunkach tlenowych i beztlenowych

-rozkład celulozy zachodzi szybciej w środowisku o pH obojętnym lub lekko kwaśnym, a także w obecności łatwo dostępnych zw azotu.

Rozkład celulozy w żwaczu zwierząt roślinożernych.:

Zwierzęta roślinożerne posiadają żołądek wielokomorowy (żwacz, czepiec, ksiągi, trawieniec)taka budowa żołądka umożliwia trawienie pokarmu roślinnego, który w prawie 50% składa się z trudno rozkładalnego błonnika. Drobnoustroje symbiotyczne bytujące w żwaczu tych zwierząt posiadają zdolność rozkładu celulozy do zw prostych.

GRUPY MIKROORGANIZMÓW SYMBIOTYCZNYCH:

Pierwotniaki: Diplodinium, Eutodinium

Grzyby: Neocallimastix, Frontalis

Bakterie: Ruminococcus albus, R. flavefaciens, Fibriobacter succinagenes

MIKROORG ROZKŁADAJĄCE CELULOZĘ:

- Grzyby (Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Rhizooctania solani, Trichoderma viride, Fusarium, Alternania, Penicillum

-bakterie właściwe: Cytophaga hutchinsoni, Cytophaga rubra, Cytophaga salmonicolor, Sporocytophaga myxococcoides, Sporocytophaga congregata, cellulomonas, Pseudomonas fluorescens vor cellulosa, Polyangium

-promieniowce - Streptomyces cellulosae, Streptomyces sporangium, Micromonaospora chalcea

znaczenie procesów rozkładu glukozy:

-dzięki aktywności różnych drobnoustrojów ulega zmineralizowaniu subst org, która jest trudno dostępna dla większości mikroorg

-z gosp pkt widzenia jest zarówno korzystna jak i niekorzystna

-w przypadku resztek pożniwnych, czy subst węglowodanowej w oborniku, czy kompoście jest to zjawisko b pożądane

- w skład paszy i żywności pochodzenia roślinnego, rozkład płótna, niszczenie obrazów jest zjawiskiem wysoko niepożądanym.

-Do hemiceluloza zalicza się wielocukrowce o różnej dł łańcuchów złożonych z cząsteczek pentoz i hektoz. Zalicza się tu ksylan, araban, mannan, glukan, itd.

-hemicelulozy stanowią znaczna część resztek roślinnych (ok. 30%)

-glukozy, pentozy mogą stanowić dł ścian kom u grzybów pleśniowych, a mangany u drożdży, hemicelulozy wchodzą w skład śluzów bakteryjnych, wytważanych często przy rozkładziebłonnika.

-drobnoustroje rozkładające hemicelulozy: Sporocytophaga myxococcoides, Clostridium ssp.

-skrobia stanowi gł subst zapasową roślin

-zw ten jest rozkładany zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych

-skrobia wywołuje w roślinach w postaci ziarenek o różnych kształtach i wielkościach. Ziarna te wykazują strukturę warstwową. Składają się z 2 glukanów: amylozy (15-27%) i amylopektyny (73-85%)

-amyloza nie pęcznieje rozpuszczając się w gorącej wodzie, a z jądrem barwi się na granatowo

-amylopektyna pęcznieje w wodzie i po ogrzaniu tworzy kleik skrobiowy, z jodem zabarwia się na purpurowo-brunatny

- są 3 typy enzymatycznego rozkładu skrobi: fosforoliza, hydroliza, transglikoliza

Mikroorg rozkładające skrobię:

-grzyby: Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Aspergillus wenti

-bakterie: bacillus macerans, bacillus polymyxa, Bacillussubtilis, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermosulfurogenes

- tłuszcze (lipidy) są estrami glicerolu i kw tłuszczowych

-hydrolizowane są przez drobnoustroje wytwarzające enzymy zwane lipazami

-enzymy te są wydzielane na zewn drobnoustr, gdzie katalizują rozkład tłuszczów do glicerolu i kw tłuszczowych. Glicerol metabolizowany jest następnie na drodze glikolizy, kw tłuszczowych, zaś rozkładane są w procesie B-oksydacji. Produkty obu szlaków wiązane są do cyklu Krebsa.

Drobnoustroje rozkładające tłuszcze: Staphylococcus ureus, Bacillus sp., Clostridium sp., Pseudomonas sp., Geotrichum sp.

AMONIFIKACJA - proces przekształcania zw org azotu i amoniaku

-może być procesem tlenowym i beztlenowym. Działają przy tym b różne enzymy uczestniczące w procesach dysymilacji

-w zależności od rodzaju enzymów i sposoby ich działania w warunkach tlenowych, oprócz amoniaku powstają jako produkty rozkładu ketokwasy, oksokwasy lub lotne kw tłuszczowe

- w warunkach beztlenowych pod wpływem dekarboksylaz produktami wyjściowymi mogą być aminy, CO2 i inne.

W glebie zależnie od warunków ekologicznych, amonifikacja może przebiegać z różnym nasileniem. Możemy tu wyróżnić:

-amonifikację brutto - taka ilość azotu amonowego, którą się otrzymuje z procesów min subst org

-amonifikacja netto - ilość amoniaku powstającego przy rozkładzie zw org z uwzględnieniem równoszceśnie zachodzących strat (nitryfikacja, utlenianie się, asymilacja)

-dezaminacja reduktywna (polega na przekształceniu aminokwasu do kw nasyconego

-dezaminacja desaturatywna - rozkład aminokwasu z wytworzeniem kw org nienasyconego

CH3 - CH - COOH + CH3 - CH - COOH CH3COCOOH + CH3COOH

HYDROLIZA MOCZNIKA jest uważana z przykład deaminacji hydrolitycznej. Wiele bakterii ma zdolność wykorzystania mocznika jako źródła azotu, a hydroliza tego zw jest katalizowana przez ureazę:

H2N - CO - NH2 +H2O H2N - CO - NH2

BAKTERIE MOCZNIKOWE: Urobacterium, Urobacillus, Bacillus pasteurii, Proteusz vulgaris, Sporosarcina ureae

AMONIFIKATORY: Clostridium sporogenes, C perfringens, C tetani, C botulinum

- względne beztlenowce: Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Proteusz vulgaris

- tlenowce: Bacillus subtilis, Bacillus cereus var Mycoides, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluarescens, P aeruginosa, Serratia marcescens, Halobacterium salinarium.

STABILIZACJA AZOTU ORG może zachodzić w następujący sposób:

-stabilizowanie skł białkowych poprzez reakcja z innymi org skł takimi jak: lignina, tanina, chinony

-tworzenie biol odpornych kompleksów azotowych w wyniku reakcji form min azotu z ligniną lub subst próchniczymi

-adsorbcja skł azotowych przez min ilaste

-formowanie kompleksu między org formami azotu a wielowartościowymi kationami (np. Fe³⁺), które są stabilne

IMMOBILIZACJA - proces włączania azotu min w biomasę mikroorg, a nast w zw próchnicowe. Procesowi temu ulega 20-30% azotu zastosowanego w nawozach min. Z tej ilości ok. 70% przechodzi w zw próchnicowe. Szczególnie silnie immobilizowane jest azot w glebach o szer stosunku C:N (nawożenie słomą). Najkorzystniej jest gdy stosunek C:N w glebie wnosi 12-15:1.

STOSUNEK C:N, A WŁAŚCIWOŚCI MIKROBIOL GLEBY.

-jeśli stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest szerszy niż 25:1, następuje immobilizacja azotu - mikroorg pobierają azot przyswajalny dla roślin (uwstecznienie, białczanie)

-gdy stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest zbyt szeroki (powyżej 32:1) następuje spowolnienie mineralizacji i immobilizacji azotu.

-jeśli stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest większe niż 25:1 immobilizacja azotu nie zachodzi. Następuje intensywna mineralizacja azotu, który nie jest wykorzystywany przez rośliny

-w glebach stosunek C:N jest różny w zależności od rodzaju gleby

-dla większości gleb stosunek C:N jest w poziomie próchniczym wynosi od8-15 (najczęściej 10-12)

-w glebach darniowych stosunek C:N jest większy niż w glebach leśnych

-w poziomach próchniczych profilu glebowego stosunek C:N jest zwykle szerszy niż w poziomach min

-wraz ze wzrostem głębokości w profilu stosunek C:N z reguły zwęża się.

-wielkość kom zależy nie tylko od gat bakterii, ale też od warunków wzrostu np. w glebie kom są małe, w hodowlach laboratoryjnych na bogatych pożywkach są znacznie większe.

-w obecności węglowodanów, zwłaszcza cukrów prostych. Azotobakter sp wytwarza otoczki i duże ilości śluzu. W obecności benzoesanu produkuje ciemny barwnik , zbliżony do melanin.

-kom Azotobakter sp izolowane z ryzosfery różnych roślin różnią się wyglądem.

- do rodz Azotobakter zalicza się gat reprezentatywne przez formy przystosowane bardziej do życia w wodzie lub w glebie. W glebie najczęściej spotyka się A chrococcum, natomiast gat A vinelandii występuje czasem w glebie, ale częściej żyje w glebie

-A sp jako bezwzględny tlenowiec jest b wrażliwy na natlenienie środowiska

-graniczna wartość pH dla tej bakterii w hodowli laboratoryjnej wynosi 5-8, ale optimum jego wzrostu i rozwoju nie przekracza 7,0-7,5.

-A sp jest b wymagający w stosunku do przyswajalnych form fosforu

-w obecności zw azotowych bakteria ta traci zdolność wiązania azotu z powietrza, może jedynie korzystać z azotanów, azotu amonowego i aminokwasów, nie ma jednak enzymów proteolitycznych,

W WARUNKACH BEZTLENOWYCH NAJBARDZIEJ WIĄŻE AZOT CLOSTRIDIUM PASTEURIANUM:

- jest to bakteria beztlenowa wytwarzająca przetrwalniki, może żyć jako mikroareofil w warunkach ograniczonego dostępu tlenu.

- występuje ona powszechnie w naszych glebach , jej liczebność w 1g gleby może wynosić 100 tys kom.

-mogą korzystać z różnych źródeł węgla

-od Azotobakter sp różnią się tym że nie przyswajają kw org, natomiast mogą asymilować pentozy, które są b słabo przyswajalne do Azotobakter sp

-Clostridium sp wymaga dodania do pożywki wyciągu z drożdży oraz peptonu.

- bakterie te wykazują dużą tolerancję hna pH środow, zakres pH 4,5-8,5

-bakterie fotosyntetyczne - są to zielone lub purpurowe bakterie siarkowe. Rosną na świetle w warunkach beztlenowych i w tych warunkach wiążą azot.

-wiązanie azotu przebiega przy udziale układu enzymatycznego zw kompleksem nitrogenazy, który składa się z nitrogenazy i reduktazy nitrogenazowej.

-do wiązania azotu są potrzebne 2 pierwsze molibden i nikiel. Molibden jest niezbędny do wiązania azotu i redukcji azotanu. Nikiel jest składnikiem hydrogenaz.

-organizmy wolnożyjące dostarczają od 1 do 3 kgN/ha/rok

-globalne wiązanie azotu 1,22x10⁸ ton z czego 70% trafia do gleb uprawnych

-wiązanie azotu przez wolnożyjące sinice na polach ryżowych 30-50 kg N/ha/rok

-na 1 mol wiązanego N2 bakterie potrzebują 16 moli ATP

-zespół kom sinicowych otoczonych śluzem noszą nazwę cenobii

-bytują w wodach słodkich, morskich, salankach, na powierzchni wilgotnych gleb, na korze gleb, w przestrzeniach międzykom glonów

-materiał zapasowy: kwas poli-beta-hydroksymasłowy, glikogen, lipidy, cyjanoficyna

-wiązanie wolnego azotu z powietrza zachodzi w heterotrofach

1.Gleocapsa minor - jednokom i kolonijna sinica żyjąca na wilgotnych podłożach i płytkich zbiornikach, gdzie tworzy śluzowate, kłaczkowate agregaty sinawej lub niebiesko-zielonej barwy. Kom są jajowate, kuliste lub pałeczkowate. Rozmnaża się przez podział kom.

2.Oscillatoria sp - ciało spłaszczone, wydłużone z szeregowo ułożonych kom dyskowatych. Rozmnażają się przez hormogonia. Przednia część ciała wykonuje wahadłowe ruchy.

Tylny koniec ciała jest wygięty. Drgalnica wytwarza osłonki śluzowe. Ma barwę niebiesko-ziel, żyje w wodach słodkich.

3.Nostoc sp (trzęsidło) - sinica nitkowata ze śluzowatymi otoczkami (pochewki), żyje w wodach słodkich i na wilgotnych podłożach. Tworzy heterocysty i śluzowe rozdzielacze fragmentujące nitkowate ciało na odcinki potomne (hormogonia)

-siarka w zw min: siarczany (Ca, Mg, K, Na), siarczki (siarczek żelaza FeS), piryt (FeS2), chalkopiryt (CuFeS)

-siarka w zw org: aminokwasy (cysteina, metionina, cystyna), kofaktory (biotyn, tiamina, koenzym A), kw limonowe, estry siarczanowe

-zawartość siarki w glebach waha się od 0,001 do 1,8, a nawet do 4%. Zazwyczaj nie przekracza 0,2%.

-Bakterie siarkowe - bakterie zróżnicowane pod względem morfologicznym i fizjologicznym, których cechą wspólną jest zdobywanie en przez zdobywanie min połączeń siarki. Są to org litotroficzne, wyst gł w wodach i w bagnach. Niektóre mogą występować w glebie.

-bezbarwne nitkowate, -bezbarwne nienitkowate -barwne nienitkowate.

BEZBARWNE NITKOWATE (siarkowodorowe)

wśród rodzaju Beggiatoa wyróżnia się gat: Beggiatoa alba o gr nitek 2,5-5um, Beggiatoa arachnoidea - 5-15um, Beggiatoa gigantea - 25-55um, Beggiatoaminima - 1um

-rodz Beggiatoa tworzy dł wielokom nici wolnopływające w środowisku wodnym. Mogą one także przemieszczać się po stałych przedmiotach ruchem pełzającym.

-rodz Thiotrix prowadzi życie osiadłe

- bakterie te utleniają siarkowodór do siarki, którą odkładają w swoich kom w postaci półpłynnych kropli

-aby pobrać 1 drobinkę węgla z CO2 muszą utlenić 8-19 drobin siarki tak więc stosunek S:C wynosi 8-19:1

BEZBARWNE NIENITKOWATE (Bakt tlenowe)

-utleniają wolną siarkę, siarkowodór i tiosiarczany

-Thiobacillus denieryficans (powoduje straty azotu do atmosfery)

-T. thiooxidans (optymalne pH 2-5, bezwzględnie tlenowy, ruchliwy)

-T. thioparus (rośnie najlepiej w temp 25-30C, opt pH 5-8

-ze wzgl na zaw w kom barwników, dzielimy je na:

-purpurowe (Chromatium okeni, Thiocapsa roseopersicina, Lampracystis roseporsicina

-zielona (Clathrochloris, Pelodictyon agregatum, Chlorobium limicola)

BAKTERIE REDUKUJĄCE MIN ZW SIARKI

-redukcja siarczanów odbywa się w warunkach beztlenowych w glebach zalewowych

-źródłem węgla dla tej bakterii są różne węglowodany, alkohole i kw org