1. Student przeprowadzał rozdział niehomogennego preparatu białkowego przy użyciu kolumny Superdex 75 10/300. W trakcie rozdziału zbierał 10 µl frakcje i mierzył ich absorbancję spektrofotometrycznie. Spośród zebranych frakcji wybrał 15, które zamierzał przeanalizować przy użyciu SDS-PAGE. Do wytypowanych frakcji należało dodać odpowiednią ilość buforu do próbek (ang. sample buffer, SB). Pomóż studentowi zaplanować eksperyment. Zaplanuj ile należy przygotować 2×SB, żeby w ostatecznej mieszaninie bufor ten był stężony 1×. Zaplanuj skład buforu do próbek wiedząc, że gotowy do użycia bufor 2×SB ma zawierać 10% β-merkaptoetanol (
   .

2. Student przeprowadzał rozdział niehomogennego preparatu białkowego przy użyciu kolumny Superdex 200 10/300. W trakcie rozdziału zbierał 30 µl frakcje i mierzył ich absorbancję spektrofotometrycznie. Spośród zebranych frakcji wybrał 15, które zamierzał przeanalizować przy użyciu SDS-PAGE. Do wytypowanych frakcji należało dodać odpowiednią ilość buforu do próbek. Pomóż studentowi zaplanować eksperyment. Zaplanuj ile należy przygotować 4×SB, żeby w ostatecznej mieszaninie bufor ten był stężony 1×. Zaplanuj skład buforu do próbek wiedząc, że gotowy do użycia bufor 4×SB ma zawierać 20% β-merkaptoetanol (
   .

3. Student zmierzył absorbancję otrzymanego roztworu aldolazy wykonując pomiar przy długości fali 280 nm. Wartość zanotowanej absorbancji A₂₈₀=0,9. Oblicz stężenie roztworu aldolazy, z którym pracuje student. Pomóż mu zaplanować rozcieńczenie roztworu aldolazy tak, żeby ostatecznie uzyskał 5ml r-u o stężeniu 2µM.

M_ald = 160 kDa

l = 1 cm

4. Aby oznaczyć ilość dostępnych grup SH w białku (metoda Ellmana), student przed wykonaniem pomiaru absorbancji przy 412 nm, musi dodać do badanego roztworu białka r-r DTNB. Wiedząc, że stok (wyjściowy r-r) DTNB jest 15-krotnie stężony, pomóż studentowi obliczyć ile DNTB powinien dodać do kuwety pomiarowej, do której napipetował już 2,5 ml badanego roztworu białka.

5. Studentka postanowiła przeprowadzić SDS-PAGE. W tym celu musiała m.in. przygotować bufor do elektroforezy. Wiedząc, że aparat do SDS-PAGE należy wypełnić 350 ml 1×buforu do elektroforezy, a wyjściowe stężenie tego buforu to 5×, pomóż studentce w zaplanowaniu rozcieńczenia buforu do elektroforezy.

6. Student otrzymał r-r p-nitrofenolu, aby sporządzić krzywą standardową. Do kolby miarowej, o pojemności 5 ml, powinien napipetować tyle µl p-nitrofenolu, aby po uzupełnieniu kolby buforem do 5 ml, rozcieńczyć p-nitrofenol 100-krotnie. Ile należy napipetować wyjściowego r-u p-nitrofenolu?

7. Po sporządzeniu odpowiedniego standardu (patrz zad. 6) student przystąpił do przygotowania poszczególnych roztworów, potrzebnych do sporządzenia krzywej standardowej. Jednym z punktów krzywej miał być odczyt A₄₁₀ dla r-u zawierającego:

V_buforu = 1,70 ml

V_standardu = 200 µl

V_NaOH = 2,0·10^-3 l

Oblicz:

1. Stężenie dodawanego standardu

2. Oblicz stężenie p-nitrofenolu w próbce ostatecznej

3. Oblicz ile razy został rozcieńczony ostatecznie p-nitrofenol w zadanej próbce, wiedząc, że r-r p-nitrofenolu, jaki student otrzymał do przygotowania standardu (zad. 6), był 10 mM.

8. Wyjściowe stężenie r-u fosfatazy kwaśnej z ziemniaka, używanej podczas wyznaczania K_M i V_max, wynosi 0,06
   . Wiedząc, że dla każdego punktu pomiarowego, do próbówek dodawano po 100 µl takiego preparatu enzymatycznego, oblicz jakie jest stężenie fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej, a jakie w mieszaninie, w której przeprowadza się pomiar A₄₁₀. Wynik podaj w jednostkach
   . Podaj także krotność rozcieńczenia fosfatazy w obu zadanych przypadkach.

1. V_buforu = 1600 µl

2. V_substratu = 0,2 ml

3. V_NaOH = 0,002 l

9. Oblicz stężenie masowe [mg/ml] użytego przez studentkę standardu glukozy, podczas badania aktywności inwertazy, wiedząc, że stężenie procentowe tego standardu wynosi 0,05% i zakładając, że jego gęstość jest równa gęstości wody.

10. Podczas wyznaczania optymalnego pH dla inwertazy drożdżowej, student postanowił obliczyć stężenie glukozy, powstałej w wyniku enzymatycznej hydrolizy. Skoro wiadomo, że do testu (metodą Nelsona) pobrał 200 µl analizowanej próbki, a następnie na podstawie odczytanej absorbancji A₆₆₀ i odpowiednio przygotowanej krzywej standardowej, odczytał masę glukozy równą 0,025 mg, jakie jest stężenie glukozy w próbce, z której student pobrał 200 µl r-u.

---