Używany sprzęt:
POMPY
Pompa jest ważnym elementem chromatografu cieczowego ponieważ powoduje przepływ fazy ruchomej przez kolumnę chromatograficzną. Cechami charakteryzującymi pompy jest zakres objętościowego wydatku cieczy ,maksymalne ciśnienie robocze, odtwarzalność wydatku objętościowego i zakres pulsacji wydatku. Pompy stosowane w chromatografii cieczowej można podzielić na stałociśnieniowe i stałoprzepływowe.
Pompy stałociśnieniowe dzielimy na pompy wyporowe i pompy z tłokami o różnej średnicy z napędem pneumatycznym. Bardziej rozpowszechnione są pompy z tłokami. Zaletą ich jest niska cena, prosta konstrukcja i brak pulsacji wydatku, co powoduje utrzymanie dobrej linii podstawowej chromatografu. Wadą może być niepożądana zmiana przepływu fazy ruchomej na skutek zmian jej lepkości przy wahaniach temperatury lub zmiany oporu wypełnienia kolumny. Uniemożliwia to analizę jakościową i ilościową.
W pompach wyporowych wytwarza się ciśnienie w zbiorniku eluentu za pośrednictwem gazu z butli ciśnieniowej. Powoduje to wypieranie cieczy ze zbiornika i jej przetłaczanie przez dozownik, kolumnę i detektor. Wada takiej pompy jest rozpuszczanie się gazu w rozpuszczalniku, co może przeszkadzać przy detekcji substancji opuszczającej kolumnę.
Pompy stałoprzepływowe dzielimy na tłokowe i strzykawkowe, zaleta ich jest utrzymanie stałego przepływu fazy ruchomej niezależnie od zmian jej lepkości i od oporu hydraulicznego kolumny. W wyniku tego można uzyskiwać odtwarzalne wyniki chromatografowania- zarówno ilościowe jak i jakościowe. Znacznie częściej używane są pompy tłokowe, ponieważ podczas ich używania nie ma konieczności napełniania ich lub uzupełniania pompowanej cieczy, która jest zasysana ze zbiornika niepołączonego trwale z pompą. Wadą jej może być natomiast pulsacja powodująca zakłócenia linii podstawowej chromatogramu i spadek czułości detektora. Podczas stosowania pomp strzykawkowych występuje konieczność przerywania chromatografowania w celu napełnienia cylindra rozpuszczalnikiem.
DOZOWNIKI
Przez dozownik chromatografu cieczowego wprowadza się próbki pod ciśnieniem atmosferycznym do kolumny, w której panuje ciśnienie kilkudziesięciu MPa. We
współczesnych chromatografach cieczowych do dozowania próbek analizowanych substancji
stosuje się najczęściej zawory dozujące zaopatrzone w pętlę dozowniczą. Kierunek przepływu fazy ruchomej zależy od położenia zaworu, w jednym położeniu dźwigni może omijać pętlę a w drugim- przechodzić przez nią. Do napełnienia pętli dozującej wykorzystuje się strzykawki szklane. Pojemność pętli dozowniczej może być różna i wynosić od kilku l do kilku ml.
KOLUMNY I ICH NAPEŁNIENIE
Kolumna wraz ze znajdującym się wypełnieniem jest częścią chromatografu cieczowego, w której zachodzi właściwy proces chromatograficzny. Wybór kolumny jest uwarunkowany wielkością chromatograficznej próbki, czasem rozdzielania jej składników oraz efektem rozdzielania, jaki chce się uzyskać.
Kolumna jest rurką zamkniętą z dwóch końców filtrami i wyposażoną w końcówki umożliwiające połączenie z dozownikiem i detektorem lub z inna kolumną. Kolumny wykonuje się najczęściej ze stali nierdzewnej, znacznie rzadziej ze szkła lub polimerów. Filtry na ogół są stalowe o średnicy porów 0,5-2 um. Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i z detektorem powinien być taki, żeby zminimalizować objętości martwe mogące powstawać przy takich połączeniach, zmniejszając tym samym udział objętości martwych w rozmyciu pików chromatograficznych.
Kolumny w chromatografii cieczowej można napełnić na sucho i na mokro. Przy napełnieniu na sucho dobre wyniki uzyskuje się wówczas, gdy ziarna wypełnienia kolumnowego (sorbentu) maja rozmiary większe niż 20 um. Do kolumny wypełnienie wsypuje się porcjami, stukając nią o drewniane podłoże z jednoczesnym stukaniem w ścianki kolumny lub wywoływaniem drgań w inny sposób. Sprawność kolumn napełnianych na sucho jest zwykle mniejsza niż napełnianych na mokro, ale większa jest ich pojemność względem chromatograficznych półek.
W wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosuje się zwykle wypełnienia o ziarnach mniejszych niż 20 um i dlatego kolumny napełnia się przede wszystkim na mokro. Dobre upakowanie kolumny zależy od jakości wypełnienia, rodzaju rozpuszczalnika użytego do przygotowania zawiesiny, stężenia zawiesiny, rodzaju rozpuszczalnika zastosowanego do dopakowania kolumny i jakości wewnętrznych powierzchni kolumny.
Zawiesina wypełniania kolumny powinna być trwała, co zależy przede wszystkim od rodzaju rozpuszczalnika użytego do jej sporządzenia. Zwykle stosuje się mieszaninę dwóch rozpuszczalników o gęstości zbliżonej do gęstości wypełnienia. Jednym rozpuszczalnikiem może być bromek lub jodek metylu albo inne o podobnej gęstości halogenowęglowodory. Drugi rozpuszczalnik musi mieć gęstość mniejszą, a stosunek rozpuszczalników dobiera się tak, żeby cząstki wypełnienia nie wypadały z zawiesiny w ciągu 10-15 min.
Napełniania kolumn o małych średnicach jest trudniejsze niż kolumn zwykłych. Oprócz wypełniania pod wysokim ciśnieniem stosuje się napełnienie elektrokinetyczne umożliwiające otrzymanie kolumn o wysokich sprawnościach.
Kolumny napełniane samodzielnie są zwykle gorsze niż przygotowane w laboratoriach, w których jest odpowiednie wyposażenie i kwalifikowany personel.
WYEŁNIANIE KOLUMN
W wysokosprawniej chromatografii cieczowej kolumnowej stosuje się najczęściej wypełnienia o rozmiarze ziaren 5-10 um. Cząstki mniejsze od 3 um są rzadko stosowane, gdyż powodują duże opory przepływu fazy ruchomej. Właściwości kinetyczne cząstek sorbentów s ą tym lepsze, im mniejsza jest ich grubość ich warstwy aktywnej. Można to uzyskać, stosują cząstki sorbentów o porowatej powierzchni nie porowatego wnętrza np. szklanego. Są to sorbenty powierzchniowo-porowate. Zaleta ich jest to, że można je otrzymać w postaci ziaren o kształcie zbliżonym do kulistego. Rozmiary cząstek takich ziaren są zwykle większe niż sorbentów porowatych w całej objętości, więc wypełnienie nimi kolumn jest stosunkowo łatwe, a ponadto stanowią one mały opór przepływowi fazy ruchomej. Kolumny wypełnione sorbentami powierzchniowo-porowatymi mają jednak małą pojemność sorpcyjną i małą sprawność. Dlatego też takie sorbenty są obecnie stosowane rzadko. Powszechnie natomiast są używane sorbenty objętościowo- porowate. Stanowią one dość duży opór przepływowi fazy ruchomej, ale nie stanowi to problemu przy zastosowaniu odpowiedniej pompy.
Napełnienie kolumn sorbentami objętościowo-porowatymi zapewnia ich wysoką sprawność i duzą pojemność sorpcyjną. Dlatego też kolumny wypełnione tymi sorbentami mogą być stosowane do rozdzielania preparatywnego.
W chromatografii adsorpcyjnej stosuje się przede wszystkim żel krzemionkowy. Jest on materiałem amforycznym, porowatym i jako wypełnienie kolumnowe ma dużo zalet. Jest on stosowany rzadko, natomiast powszechnie stosowane są wypełnienia na bazie żelu krzemionkowego. Takie wypełnienia mają uziarnienia o pożądanej wielkości i różnych rozmiarach porów, odpowiednich do rozdzielania różnych związków chemicznych.
DETEKTORY
W chromatografii cieczowej stosuje się różne rodzaje detektorów szczególnie przydatnych do wykrywanie poszczególnych związków lub ich grup. Są to przede wszystkim detektory spektrofotometryczne i elektrochemiczne. Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy pewnych właściwości samych eluentów i roztworów składników chromatografowanych mieszanin w tych eluentach, czyli eluatów.
Do wykrywania małych ilości agalitów stosuje się mikrodetektory, np. spektrometry optyczne, w których komórki przepływowe są kapilarami o małych pojemnościach. W mikrochromatogarfii , cieczowej przydatne są detektory elektrochemiczne. Są one selektywne, działają dobrze w postaci zminiaturyzowarnej i pozwalają uzyskać dobrą, np. femtomolową, wykrywalność niektórych związków chemicznych.
DETEKTOR FOTOMETRYCZNY ABSORPCJI NADFIOLETU
Detektory działające na zasadzie pomiaru absorbancji promieniowania nadfioletowego (UV) lub nadfioletowego i światła widzianego (UV/VIS) razem, są najlepsze i najbardziej rozpowszechnione spośród detektorów stosowanych w chromatografii cieczowej kolumnowej.
Detektory UV stosuje się do wykrywania substancji zawierających w cząsteczce wiązania nienasycone i grupy chromoforowi np. olefin, związków aromatycznych i barwników. Aby detektor UV dobrze działał użyty eluent nie powinien absorbować światła przy zastosowanej długości fali. Detektory te są niezwykle wrażliwe na zmiany przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury. Dlatego może być używany w chromatografii gradientowej. Wykrywalność analizowanych substancji przy doborze dobranej długości fali absorbowanego światła wynosi średnio ok. 1 ng w próbce.
DETEKTORY FLUŁORESCENCYJNE
Istota działania fluorescencji polega na pomiarze intensywności światła o określonej długości fali emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego pobudzenia. Pobudzenie odbywa się światłem o większej energii niż światło emitowane. Detektor fluorescencyjny jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów wykorzystywanych w chromatografii cieczowej.
Stosowanie detekcji z zatrzymaniem przepływu fazy ruchomej umożliwia otrzymanie widm fluorescencyjnych przydatnych do identyfikacji rozdzielonych składników mieszanin. Wykorzystuje się w tym celu właściwości fluorescencji polegającą na tym, że poszczególne związki mają zdolność pochłaniania światła o określonej charakterystycznej długości fali i emitują światło także o określonej, charakterystycznej długości fali. Substancję przepływającą przez komórkę detektora oświetla się światłem o określonej długości fali i jednocześnie rejestruje się długości fali światła emitowanego .
DETEKTOR REFRAKTOMETRYCZNY
Detektor refraktometryczny jest najbardziej uniwersalnym detektorem spośród stosowanych w chromatografii cieczowej. Detektorem tym mierzy się różnicę współczynnika załamania światła eluentu i roztworu substancji wymywanej z kolumny w tym eluencie, czyli eluatu.
Detektor refraktometryczny jest zbudowany w taki sposób, że przez jedna jego komorę przepływa eluent, a prze druga eluat. Im większa jest różnica w wartości współczynników załamani światła mierzonych w obu komórkach, tym lepsza jest wykrywalność chromatografowanych substancji. W próbce mogą jednak występować substancje, które w bardzo różny sposób zmieniają współczynniki załamania światła eluentu i dlatego ich wykrywalność jest różna.
Detektor refraktometryczny stosuje się do wykrywania węglowodanów, alkoholi, cukrów i kwasów alifatycznych. Możliwe jest również wykrywanie substancji wielocząsteczkowych chromatografowanych metodą chromatografii wykluczania i substancji powierzchniowo czynnych.
DETEKTORY ELEKTROCHEMICZNE
Spośród detektorów elektrochemicznych stosuje się detektory polarograficzne lub kulometryczne przydatne do wykrywania substancji nieorganicznych i organicznych podlegającym reakcjom elektrochemicznego utleniania i redukcji. Detektory te są bardzo użyteczne ze względu na ich selektywność i bardzo dobrą wykrywalność niektórych związków. Stosowane są zwłaszcza do analizy związków biologicznie czynnych- syntetycznych i naturalnych. Niektóre z tych związków są wykrywane na poziomie nanogramów. Ogólnie można stwierdzić, że detektory elektrochemiczne mają największe zastosowanie w analizie klinicznej i analizie produktów spożywczych.
DETEKTOR ZEROZOLOWY PROMIENIOWANIA ROZPROSZONEGO
W aerozolowym detektorze promieniowania rozproszonego aerozol substancji opuszczającej kolumnę chromatograficzną powoduje rozproszenie promieniowania laserowego. Zasada działania detektora polega na tym, że eluat z kolumny rozproszony jest ditlenkiem węgla w nebulizatorze podgrzanym do temperatury 40 C. Wskutek tego eluent ulega odparowaniu, a nielotne składniki chromatografowanej próbki tworzą aerozol. Aerozol w strumieniu ditlenku węgla i par eluentu jest przenoszony przez rurke dyfuzyjną i komórkę pomiarową przez detektor. W komórce pomiarowej aerozol rozprasza promień światła emitowany z lasera. Rozproszone promieniowanie jest doprowadzane przez światłowód do fotopowielacza, a prąd fotopowielacza po wzmocnieniu w elektrometrze rejestruje się w postaci chromatogramu.
FAZA RUCHOMA
Fazy ruchome w chromatografii cieczowej stanowią pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- lub więcej składnikowe mieszaniny. Faza ruchoma, którą wprowadza się do kolumny nosi nazwę eluentu. W kolumnie w skład fazy ruchomej oprócz eluentu mogą wchodzic także składniki rozdzielanej mieszaniny. Po rozdzieleniu te składniki są obecne w wycieku z kolumny, który nosi nazwę eluatu. Skład eluentu może być jednakowy lub może się zmieniać w trakcie chromatografowania próbki.
Faza ruchoma w chromatografii cieczowej jest czynnikiem aktywnym w procesie chromatografowania. Czasem niewielki dodatek drugiego rozpuszczalnika do rozpuszczalnika będącego eluentem wywiera duży wpływ na jakość rozdzielania składników mieszaniny. Dokonując wyboru eluentu, należy kierować się tym, że nie powinien on działać szkodliwie na rozdzielane związki, wypełnienie kolumny i przyrząd, natomiast powinien dobrze rozpuszczać analizowaną mieszaninę i umożliwić detekcję jej składników.
Używane w chromatografii rozpuszczalniki powinny być bardzo czyste. Od czystości i składu fazy ruchomej zależy m.in. wykrywalność i rozdzielanie analitów oraz działanie detektora. W fazie ruchomej nie może być nawet najdrobniejszych cząstek. Konieczne jest odgazowywanie rozpuszczalników stosowanych jako eluenty, co zapobiega powstawaniu w cieczy pęcherzyków gazu, które mogłyby przeszkadzać przy detekcji.
Przy doborze eluentu do rozwiązania konkretnego zadania analitycznego należy wziąć pod uwagę jego siłę elucyjną. Jest to związane z tym, że cząsteczki eluentu „rywalizują” o miejsce na powierzchni fazy stacjonarnej z cząstkami substancji chromatogarfowanych. Im oddziaływanie cząstek eluentu w powierzchnia fazy nieruchomej jest silniejsze, tym łatwiej wypierają one z tej powierzchni cząsteczki substancji chromatogafowanje. Dlatego siłę eucji eluentu można charakteryzować wielkością siły oddziaływania jego cząsteczek z powierzchnią adsorbentu. Siłą elucyjna eluentu zależy od rodzju fazy stacjonarnej.
CHROMATOGRAFI A W NORMOALNYM I ODWRÓCONYM UKŁADZIE FAZ
Na przebieg i efekty rozdzielania chromatograficznego analizowanej mieszaniny wpływaj właściwości układu faza stacjonarna- faza ruchoma. W przypadku stosowania polarnych faz stacjonarnych jako fazy ruchome są używane rozpuszczalniki mające mniejszą od nich polarność. Jest to normalny układ faz, w którym jako fazę stacjonarną stosuje się najczęściej żel krzemionkowy. W normalnym układzie faz stosuje się rozpuszczalniki organiczne zarówno niepolarne, jak i polarne. Zaleca się jednak stosowanie rozpuszczalników o małej polarności i niskich temperaturach wrzenia. Fazę ruchomą należy dobrać tak, aby była ona mniej polarna niż składniki chromatografowanej mieszaniny. Najczęściej jako fazę ruchoma stosuje się heksan, pentan, izooktan, chloroform, chlorek metylu. W normalnym układzie faz kolejność Lucji aliantów jest związana z ich polarnością w taki sposób,że najpierw eluowane są alianty mało polarne, następnie coraz bardziej polarne.
Chromatografia w normalnym układzie faz jest wykorzystywana do analizy substancji trudno rozpuszczalnych w wodzie, różniących się liczbą lub rodzajem grup funkcyjnych albo będących izomerami.
Chromatografie w odwróconym układzie faz stosuje się do analizy substancji chemicznych o różnej polarności, przy ewentualnym zastosowaniu właściwego dla danej substancji pH fazy ruchomej i stosunku jej składnika organicznego do wodnego, takiego aby można było uzyskać retencję i selektywność zapewniające dobre rozdzielenie składników analizowanej mieszaniny. Kolejność eucji analitów w chromatografii w odwróconym układzie faz jest związana głównie z ich hydrofobowością,a pośrednio z ich polarnością.
Chromatografia kolumnowa w odwróconym układzie faz jest obecnie stosowana znacznie częściej niż w normalnym układzie faz. Jest to spowodowane tym, że polarne (hydrofolowe) adsorbenty używane w normalnym układzie faz silniej adsorbują wodę obecną w rozpuszczalnikach, nawet w ilościach śladowych, wskutek czego aktywność adsorbentu maleje i kolumna traci swoje początkowe właściwości rozdzielcze
WPŁYWANIE NA CZAS RETENCJI
Wybierając eluent do rozdzielania mieszaniny o nieznanym składzie w normalnym układzie faz, najpierw stosuje się rozpuszczalnik ze środkowego szeregu eluotropowego. Następnie obserwując czas wychodzenia składników próbki z kolumny i wyniki rozdzielania, stosuje się rozpuszczalnik albo mieszaninę rozpuszczalników o mniejszej lub większej sile eluownia. Uwzględniając, że chromatografowanie jest wykonywane na fazie stacjonarnej polarnej, zbyt długie czasy retencji substancji chromatografowanych można skrócić przez zastosowanie eluentu o większej sile Lucji- bardziej polarnego. Zbyt krótki czas Lucji można wydłużyć przez zastosowanie eluentu o mniejszej sile Lucji- mniej polarnego.
W przypadku chromatografowanie w odwróconym układzie faz zbyt długie czasy retencji substancji chromatografowanych można skrócić przez zastosowanie eluentu mniej polarnego, który w tym przypadku ma mniejszą siłę Lucji. Natomiast zbyt krótkie czasy retencji substancji chromatografowanych wydłuża się stosując eluent bardziej polarny o mniejszej sile eucji.
Jeżeli składniki analizowanej mieszaniny są polarne, ta na polarnym wypełnieniu kolumny należy stosować fazę ruchomą bardziej polarną niż wtedy, gdy składniki mieszaniny są słabo polarne lub niepolarne. Natomiast jeżeli składniki analizowanej mieszaniny są niepolarne, ta na niepolarnym wypełnieniu kolumny należy stosować fazę ruchomą mniej polarną niż w przypadku składników mieszaniny słabo polarnych lub polarnych. Optymalny czas retencji uzyskuje się wtedy, gdy polarność chromatograficznej substancji jest średnia w stosunku do polarności fazy ruchomej i fazy stacjonarnej.