Laboratorium 14 F I Z Y C Z N E I C H E M I C Z N E W Ł A Ś C I W O Ś C I

K W A S Ó W N U K L E I N O W Y C H

Ćwiczenie 1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Do 1 mL roztworu DNA dodaj kroplę stężonego roztworu HCl. Zaobserwuj zmętnienie wynikające z wytrącenia kwasu nukleinowego. Następnie dodaj do próby kilka kropel roztworu amoniaku - kwas ulega ponownemu rozpuszczeniu. Sformułuj wnioski.

Ćwiczenie 2. Reakcje odróżniające RNA od DNA.

1. wykrywanie RNA - próba Biala

Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 1 mL roztworu FeCl₃ i 0,4 mL roztworu orcyny. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności rybozy powstaje zielone zabarwienie o natężeniu około 10 razy większym niż w obecności deoksyrybozy). Sformułuj wnioski.

2. wykrywanie DNA - próba Dischego

Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 2 mL roztworu difenyloaminy. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności deoksyrybozy powstaje niebieskie zabarwienie). Sformułuj wnioski.

3. wykrywanie DNA - reakcja Feulgena

Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 4 krople 2 M roztworu HCl. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Następnie ostudź zawartość probówek pod bieżącą wodą. Do obu probówek dodaj po 1 mL 1 M roztworu NaOH i po 2 mL odczynnika Schiffa. Odczekaj około 10 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności deoksyrybozy powstaje czerwono-fioletowe zabarwienie). Sformułuj wnioski.

Ćwiczenie 3. Jakościowa analiza DNA.

1. kwaśna hydroliza DNA

Do probówki dodaj 3 mL roztworu DNA oraz 3 mL 72% roztworu HClO₄. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut. Uzyskany hydrolizat po ostudzeniu służy do jakościowej analizy DNA.

2. wykrywanie pentozy w hydrolizacie DNA

Do 1 mL hydrolizatu DNA dodaj 2 mL stężonego roztworu HCl oraz 2 krople roztworu floroglucyny. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 1 minutę. Zaobserwuj powstającą barwę i sformułuj wniosek.

3. wykrywanie kwasu fosforowego w hydrolizacie DNA

Zobojętnij 0,5 mL hydrolizatu DNA przy użyciu 1,5 mL roztworu amoniaku. Następnie dodaj 1 mL stężonego roztworu HNO₃ i 2 mL 5% roztworu molibdenianu amonu. Zawartość probówki ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Zaobserwuj powstający osad i sformułuj wniosek.

4. wykrywanie puryn

Do jednej probówki dodaj 1 mL hydrolizatu DNA, a do drugiej 1 mL roztworu adeniny. Następnie do obu probówek dodaj po 2-3 krople stężonego roztworu amoniaku. Wymieszaj i do obu probówek dodaj po 4-5 kropli amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra. Zaobserwuj tworzenie się zmętnienia/osadu. Sformułuj wniosek.

Ćwiczenie 4. Jakościowa analiza RNA.

1. kwaśna hydroliza RNA

Do probówki dodaj 3 mL roztworu RNA oraz 3 mL 72% roztworu HClO₄. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut. Uzyskany hydrolizat po ostudzeniu służy do jakościowej analizy RNA.

2. wykrywanie pentozy w hydrolizacie RNA

Do 1 mL hydrolizatu RNA dodaj 2 mL stężonego roztworu HCl oraz 2 krople roztworu floroglucyny. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 1 minutę. Zaobserwuj powstającą barwę i sformułuj wniosek.

3. wykrywanie kwasu fosforowego w hydrolizacie RNA

Zobojętnij 0,5 mL hydrolizatu RNA przy użyciu roztworu amoniaku (ok. 1,5 mL). Następnie dodaj 1 mL stężonego roztworu HNO₃ i 2 mL 5% roztworu molibdenianu amonu. Zawartość probówki ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Zaobserwuj powstający osad i sformułuj wniosek.

4. wykrywanie puryn w hydrolizacie RNA

Do jednej probówki dodaj 1 mL hydrolizatu RNA, a do drugiej 1 mL roztworu adeniny. Następnie do obu probówek dodaj po 2-3 krople stężonego roztworu amoniaku. Wymieszaj i do obu probówek dodaj po 4-5 kropli amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra. Zaobserwuj tworzenie się zmętnienia/osadu. Sformułuj wniosek.

Ćwiczenie 4. Widmo absorpcyjne kwasów nukleinowych.

Zasada:

Wszystkie związki zawierające układ purynowy lub pirymidynowy pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal o długości 250 - 280 nm. Wynika to z obecności wiązań podwójnych i heteroatomów w pierścieniu purynowym i pirymidynowym. Dlatego dla kwasów nukleinowych oraz budujących je nukleotydów i zasad azotowych charakterystyczne są widma absorpcyjne o maksimach absorpcji w zakresie 250 - 280 nm. Ponieważ reszty cukrowa i fosforanowa nie mają większego wpływu na pochłanianie światła w tym zakresie fal, widma absorpcji nukleotydów, nukleozydów i zasad azotowych są podobne.

Wykonanie:

Dokonaj pomiaru widma absorpcji dla następujacych roztworów: adeniny, adenozyny, hipoksantyny, inozyny, ksantyny i guaniny. Pomiary należy przeprowadzić na spektrofotometrze z ciągłą rejestracją widma względem próby ślepej (H₂O) w kuwetach 1-cm w zakresie fal 200 - 350 nm. Zaobserwuj przebieg widm absorpcji dla badanych roztworów. Odczytaj i zanotuj maksima i minima absorpcji dla badanych związków w badanym zakresie fal.