-Można stosować AUTOLIZĘ (przez
kilka h w 0,1M NaHCO3 w 40oC)
-Rozbicie kom.homogenizat. ostrz.
-Ucieranie drożdży z piaskiem
w obecności eteru i extrakcja B wodą.
Do oczyszczania inwertazy można
wykorzystać jej małą podatność na
strącanie kwasem pikrynowym.
Wytrącanie enzymu przeprowadza
się acetonem w niskiej temp
(ochrona przed denaturacją).
2. Inwertaza (sacharaza) według
obowiązującej nomenklatury enz.
jest b-D-fruktozydazą EC 3.2.1.26.
Należy do gr hydrolaz. Hydrolizuje
wiązania glikozydowe utworzone
z udziałem gr hydroksylowej w
położeniu b, związanej z węglem
anomerycznym C2 pierścienia
fruktofuranozy. INW powoduje
hydrolizę dwucukru sacharozy
do GLU i FRU, trójcukru
rafinozy do FRU i melibiozy.
INW występ.w bakt./innych
mikroorg./ścianie kom.roś.
wyższych i u zwierząt.
Vmax i Km:
Pozwala na wnioskowanie o liczbie
i kolejności przyłączania cząsteczek
substratu do enz. i odłączania
cz.produk.z komplexu akt.o liczbie
komplexów pośr.
i izomeryzujących form enzymu.
1.Różne stęż.r-rów sach.w buf.oct-4,7
2. Dodać r-ru INW o optym.stęż.
3. Wymieszać, w 0’ i po 5’…30’
+ mieszaniny inkubac. Do byf.glic.-10
4. Dodać miesz. Somoygi (4:1)
5. 15’ ogrzewać w łaź.wod.
6. Ostudzić+Nelson, Mix+woda, mix.
7. Pomiar absorb =520
8. Z krzywej kalibracyjnej odczytać
stęż monosachar. I obliczyć ilość
powstałych produktów = A520*f (yg/
/ml)*1ml*30x rozcieńcz.miesz.inkub.
9. K.progresji (ilość prod/czas reakc)
10. Wyznaczyć Vpocz. Recka
(tg a-nachylenie stycznej do krz.prog.)
11. Krz.Michaelisa-Menten (V/C)
12. Wykr.Lineveawera-Burka Km i Vmax
*Rodzaj bu.
*Ilość buf.
*Siła jonowa (rozpuszcz.B.enzym.,
ich konformacja zależą od…,
a więc od C i wartościowości
występujących w nim jonów)
*Pojemność buf. (wzrasta ze C r-ru/
/maleje z rozcieńcz. choć
nie zmienia pH, to (-) wpływa na …
>Uwzględnić typ buf, bo niektóre
składniki mogą wiązać się
z enzymem i zmieniać jego aktyw.
1. 0,02-0,4
1 - … J/ml (Aktywn.r-ru enzymu)
2. 20/1000 *100% = 2%