TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Ćwiczenie1

Komórki kompetencyjne-zdolne do przyjęcia DNA

transformacja,-czyli wprowadzenie DNA do komórek bakterii.

MgCl2 i Cacl2- (metoda chemiczna)czynniki umożliwiające kompetencje komórki. DNA ma ładunek ujemny, nadawanym przez grupy fosforanowe przez, co nie może przejść przez błonę komórkową, ponieważ błonaa komórkowa również ma ładunek ujemny, przez fosfolipidy. Jony magnezu i wapnia wiąża się do grup ujemnych i neutralizują ich ładunk. Dodatkowo szok temperaturowy wspomaga ten proces, ponieważ powoduje, że błona staje się bardziej „miękka” , dzięki czemu DNA może przez nią przejść.

Glicerol - zwiększa gęstość, żeby roztwór nie zamarzł, białka były stabilne (glicerol zabezpiecza oddziaływania między białkami i chroni je przed lizą).(do przechowywania enzymów używamy 50% r-r, natomiast do mieszaniny restrykcyjnej używamy 5% r-r-ponieważ duże stężenie powoduje, że jest więcej niespecyficznych oddziaływań-czyli niskie stężenie podobnie jak fikol zagęszcza próbkę,a wysokie ją ochrania przed zamrożeniem )

Selekcja biało niebieska

Tylko niebieskie są transformowane, na płytce z tetracykliną nie urosną komórki, które nie są odporne na tetracyklinę.

X-gal pochodna laktozy

Transfekcja-wprowadzenie DNA z zewnątrz do kom. Eukariotycznej

Inne metody transformacji DNA:

Elektroporacja-poddawanie komórki eukariotycznej napięciu pola elektrycznego, które uszkadza błonę komórkową („robi w niej pory”)

Mikroiniekcja-bombardowanie błony kom.

Liposomy - fuzja liposomu zaw. DNA z błoną komórki(?)

Działanie dekstranami: fosforany wapnia

Transdukcja- bakreriofagii, wprowadzanie DNA za pomocą wirusów

Ćwiczenie 2

Fosfataza alkaliczna-defosrorylacja na końcu 5’-przygotowanie plazmidu do klonowania

Mg 2+- niezbędny do aktywności enzymu

BSA-stabilizacja enzymów białkowych, zapobiega adhezji enzymu do nośników(BSA jako białko neutralne stabilizuje enzym)

SDS-detergent inaktywujący enzym, inaktywujemy enzym(białko) także przez temperaturę , EDTA, mocznik, chlorowodorek guanidyny. SDS denaturuje, rozwija białko, niweluje się przez to ładunek wypadkowy białka i SDS nadaję cząsteczce białka ładunek ujemny. SDS się pieni, więc napowietrza układ, co grozi utl. i powstaniem cystyny-czyli mostków di siarczkowych, które normalnie nie występują w naszym białku – B-merkaptoetanol je redukuje. SDS odgrywa również ogromną role w lizie błony komórkowej poprzez usuwanie lipodów.

Triton X100—detergent (niejonowy) (SDS-to detergent jonowy-powoduje uszkodzenie chromosomów), - indukowana liza komórki. Po potraktowaniu Tritonem sferoplastu komórki powstaje ekstrakt komórkowy.

TRIS-HCl- bufor tris, który miareczkowany jest HCl w celu uzyskania odpowiedniego pH

KCl/NaCl-odpowiednia siła jonowa

Fikol- zagęszcza próbkę, próbka musi być zagęszczona by opadła na dno studzienki zamiast wyjść z żelu

????kwas borny

błękit bromofenylowy- barwnik do określenia czy elektroforeza zachodzi(niebieska kreska na zelu), ruchliwość jak ssDNA o długości 300 bp

ksylenocyjanol - barwnik do określania, czy zachodzi elektroforeza - ruchliwość jak ss DNA o długości 4 kbp

TRIS - amina pierwszorzędowa, pozwala uzyskać bufor utrzymujący lekko zasadowe pH (między 7-9),

Comasi blue- służy do uwidocznienia białka w żelu, porusza się w żelu jak białko rozwinięte o masie podobnej jak lizozym.

Defincje:

Enzymy restrykcyjne (restryktazy, endonukleazy restrykcyjne, enzymy trawienne) są białkami o aktywności enzymatycznej, które wyizolowano z bakterii. Endonukleazy restrykcyjne rozpoznają i przecinają specyficzne sekwencje w dwuniciowej cząsteczce DNA, w rezultacie czego otrzymuje się tzw. tępe i lepkie końce.

Enzymy restrykcyjne - izoschizomery

Izoschizomery są enzymami restrykcyjnymi, rozpoznającymi tę samą sekwencję DNA. Przyjmuje się, że pierwszy zidentyfikowany enzym restrykcyjny jest prototypem rodziny, a każdy kolejny jest jego izoschizomerem. Do izoschizomerów zaliczyć można wiele przykładów enzymów. Izoschizomerem enzymu AanI jest enzym restrykcyjny PsiI. Oba rozpoznają i tną sekwencję 5'-TTA/TAA-3'. Izoschizomery izolowane są zazwyczaj z różnych szczepów bakterii, w związku z czym mogą wymagać różnych warunków reakcji, różnych temperatur, stężenia soli czy czasu reakcji.

Enzymy restrykcyjne - neoschizomery

Poza izoschizomerami w przyrodzie występują także neoschizomery. O ile izoschizomery rozpoznają i tną daną sekwencję w identycznym miejscu, to w przypadku neoschizomerów jest trochę inaczej. Neoschizomer rozpoznaje tę sama sekwencję co tzw. prototyp (enzym restrykcyjny o określonych parametrach cięcia, wyizolowany jako pierwszy), jednak tnie ją w różnych miejscach. Neoschizomery zaliczane są do specyficznego podtypu izoschizomerów.
Na przykład enzym AatII rozpoznaje i przecina sekwencje w następującym miejscu GACGT/C), przy czym jego neoschizomer ZraI rozpoznaje również tę samą sekwencję, jednak miejsce cięcia jest inne – GAC/GTC).

Izokaudomery-rozpoznają różne sekwencje, generują takie same lepkie końce

Aktywność gwiezdna- enzym może stracić swoją aktywność, zacząć ciąć w miejscach niespecyficznych dla niego, może stać się DNAzą degradującą DNA. Aktywność gwiezdną wywołuje źle dobrany bufor, glicerol, chloroform, rtęć, zbyt długi czas reakcji, zbyt niska siła jonowa, zbyt wysokie pH, gdy jony magnezu zostają zastąpione innymi

E.restrykcyjne parametry krytyczne:

• Czas inkubacji

• pH, temp., siła jonowa

• stężenie DNA

• czystość enzymu, DNA

• dobór buforu

Bufory przechowuje się w temp – 20C w stęż. 10X

Metylacja chroni bakterie przed degradacją własnego DNA (metylazy)-metylują cytozynę albo guaninę. DNA fagowe nie jest ,etylowane.

U Eucariota –metylowane DNA jest nieaktywne-metylacja służy do wybierania DNA, które ma być czynne transkrypcyjnie.

Denaturacja- niszczenie oddziaływań wodorowych pomiędzy bocznymi resztami aminokwasowymi.

Redukcja białka- (B-merkaptoetanol) niszczenie mostków di siarczkowych

Podstawowa kontrola-próba bez enzymu, kolejna próba sam enzym

Ukierunkowane klonowanie-wybiera się dwa różne miejsca klonowania, ponieważ narzucają ramkę odczytu. Wtedy jest pewność, że insert wklonował się w odpowiedniej orientacji do wektora.

Fosforylację wektora wykonuje się po to, aby po ligacji wektor nie odtworzył ise do formy kolistej; grupy fosforanowe dostarczamy w insercie –wtedy na pewno insert po ligacji będzie w wektorze.

Jednostka aktywności- jest to taka ilość enzymu, która trawi całkowicie 1 µg charakterystycznego substratu testowego przez 1h w optymalnych warunkach podanych przez producenta

Po ligacji otrzymujemy:

• superskręcone DNA

• wektor z insertem –nas produkt

• wektor bez insertu

• liniowy DNA

kontrola jest kolista będzie się poruszała szybciej w żelu, ponieważ łatwiej będzie przenikać przez pory w żelu

Próbki są liniowe

Elektroforeza-technika służąca do rozdziału molekuł w polu elektrycz. Na podstawowe ich wielkości, na podstawie ich kształtu, wielkości i ładunku. DNA porusza się w polu elektrycz. od ujemnej katody do dodatniej anody.

Czynniki wpływające na rychliwość DNA:

• długość cząteczki DNA

• konformacja bromek etydyny(liniowe DNA spowalnia o 10-15%, ujemnie supeskręcone DNA zmienia się w dodatnie superskręcone DNA)

• napięcie

• stęż. agarozy

• bufor(siła jonowa)

sole haotrppowe- wprowadzają nieład, aby wymusić pewne działania, które w normalnych warunkach mogłyby nie nastąpić np. mocznik, SDS, chlorek guanidyny

stężone r-ry alkoholi (powyżej 90%) wytrącają DNA z roztworu.

Ćwiczenie3

sole chaotropowe- powodują powstanie otoczki solwatacyjnej, zaburzaja oddziaływania wodorowewprowadzają nieład, aby wymusić pewne działania, które w normalnych warunkach mogłyby nie nastąpić np. mocznik, SDS, chlorek guanidyny

stężone r-ry alkoholi (powyżej 90%) wytrącają DNA z roztworu.

Izopropanol- obniza przepuszczalność DNA, powoduje strącanie DNA

R7s- służy do rozpuszczania agarozy, podnosi siłę jonową roztworu; przygotowywuje DNA do związania z kolumną .

A1- roztwór płuczący z zestawu do oczyszczania DNA

Ćwiczenie 4

Etapy PCR:

• denaturacja

• hybrydyzacja starterów

• elongacja

denaturacja- nie tylko rodziela obie nici,ale pomaga także w odbiałczaniu DNA (94-98 C)

temp. Syntezy zalezy od polimerazy

czas syntezy- ulotka polimerazy, jak napisane 30 s to bierze,y ok. 15sekund

Obniżamy temp o 2 stopnie- zwiekszamy specyficzność hybrydyzacji stratera z matrycą. Temperatura straterów powinna być wyższa niż 50 stopnie, ale niższa niż temp. synezy DNA

Olej parafinowy-zapobiega parowaniu r-ru.

Po co KCl w buforze dla polimerazy? Odpowiedznia siła jonowa.

Jak sprawdzić czy insert jest wklonowany poprawnie:

• Western-bloting

• Sekwencjonowanie

• Kontrolne cięcie 2-3 enzymami

Ćwiczenie 5

Kontrola-bez insertu

ATP - źródło energii dla ligazy

ditiotreitol ditiotreitol (DTT)- Zapobiega degradacji DNA dezaktywując nukleazy poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych (?)

Ćwiczenie 6

IPTG-induktor

ZnCl- badane białko, jest białkiem eukariotycznym,, a bakterie nie posdiają białek czaperonowych np. białka szoku cieplnego(białka opiekuńcze otaczające łacuch polipeptydowy i pomagające w nabyciu odpowiedniej struktury, białko musi być odpowiednio fałdowane.

Ćwiczene7

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym –odpowiedni stosunek bisakryloamidu do akryloamidu daje odpowiednie usieciowanie żelu i jego parametry rozdzielcze

Żel zagęszczajacy- zagęszczamy próbkę ,żeby w jednym momencie wszystkie próbki zaczęły się rozdzielać

SDS-nadaje ujemny ładunek Białką

Glicyna brak grup bocznych

pI=6,7

w żel zagęszczajacy służy jako gradient , który ma za zadanie pociągać biłaka; gdy zaczyna przyśpieszać wraz z jonami Cl- zaczyna popychac białka, a gdy wejdzie w żel rozdzielajacy staje się anionem i przestaje popychać białka, dzięki czemu mogą się rozdzielać.

Cl- najszybciej porusza się w żelu zagęszczającym

IPTG- syntetyczny analog glukozy/galaktozy wywołujący ekspresję genu pod operonu lac w E.coli

APS-nadsiarczan amonu-od niego tworza się w żelu wolne rodniki

TEMED- przyśpiesza polimeryzację

Metanol + kwas octowy+ Comassie blue - roztwór do wybarwiania białek w żelu,