Ćwiczenie nr 4

BARWIENIE ZRĘBU ŁĄCZNOTKANKOWEGO

met.”AZAN” wg Heidenheina i met. Van Gieson

Tkanka łączna zawiera 3 rodzaje włókien: kolagenowe, sprężyste i retikulinowe.

Włókna sprężyste zbudowane z elastyny barwią się orceiną na kolor czerwono-brązowy, występują w dużych ilościach w ścianach naczyń krwionośnych, w więzadłach żółtych kręgosłupa, w chrząstce sprężystej małżowiny usznej, trąbce Eustachiusza.

Włókna retikulinowe budują rusztowanie dla narządów krwiotwórczych(szpik kostny czerwony, węzły chłonne, śledziona), występują w tkance nabłonkowej naczyń, wątroby, są zbudowane z białka retikuliny i barwią się solami srebra na czarno. Najczęściej do tego celu wykorzystujemy metodę Gomoriego.

Włókna klejodajne zbudowane z białka kolagenu(typu I,II,III,IV) występują w postaci pęczków i występują najczęściej. Tworzą błony śluzowe, podśluzowe, przydanki, otaczają narządy,tworzą pochewki mięśniowe.

Tkanka łączna stanowi w warunkach prawidłowych zrąb dla narządów miąższowych, buduje przegrody łącznotkankowe, otacza zraziki, tworzy torebki i powięzie łącznotkankowe, nadaje kształt narządom. W patologii tkanka łączna zastępuje tkankę czynną biologicznie prowadząc do zwłóknień(włókniste zwyrodnienia narządów).

W badaniach histopatologicznych badanie zrębu łącznotkankowego polega na wykorzystaniu powinowactwa kolagenu do barwników anilinowych - niebieskich(met. Azan, Mallory´ego) i trójfenylometanowych - czerwonych(met. Van Gieson).

W pierwszej metodzie kolagen barwi się na kolor niebieski błękitem anilinowym, w drugiej na różowo - czerwony pikrofuksyną (mieszaniną Van Gieson).

UWAGI DO BARWIENIA

Metoda „AZAN”

1. Barwienie azokarminem B odbywa się na gorąco(60⁰C w termostacie) i jest barwieniem regresywnym, wymaga różnicowania w alkoholu anilinowym(kontrolować pod mikroskopem)

2. Różnicowanie trwa do momentu, aż cały preparat odbarwi się, a tylko jadra pozostaną czerwone.

3. W alkoholu zakwaszonym(alk. 70% z dodatkiem HCl) utrwalamy barwę jądra

4. Bejcowanie w 5% kwasie fosforomolibdenowym przygotowuje tkankę do barwienia w mieszaninie AZAN(błękit aniliny + oranż G), przed włożeniem do kwasu zdjąć spinacze( redukują kwas!)

5. Po mieszaninie AZAN różnicować w alk. 96% do momentu, aż z preparatu przestaną spływać niebieskie obłoczki barwnika.

Niepowodzenia i zapobieganie

1. Słabe zabarwienie jąder

- za krótko w azokarminie lub niska temperatura inkubacji

2. Rozlane różowe zabarwienie preparatu

- różnicowanie zbyt krótkie w alk. anilinowym

3. Słabe zabarwienie tkanki łącznej

- za krótko w mieszaninie AZAN lub zbyt długie różnicowanie w alkoholu 96%

Metoda Van Gieson

1. Hematoksylina wg Weigerta jest trwała tylko 8 dni (potem trzeba ją wymienić)

2. Barwienie w pikrofuksynie przeprowadzamy w pozycji poziomej w wanience do barwienia rozmazów nakrapiając barwnik na skrawek(barwnik jednokrotnego użycia)

3. Preparaty po zlaniu pikrofuksyny bardzo dokładnie opłukać w wodzie, aby nie zanieczyszczać alkoholi w odwadnianiu(szczególnie alk. 90%).

4. Odwodnione i prześwietlone preparaty zamykać w balsamie salicylowanym lub w Cedaxie (w innych mediach szybko ulegają odbarwieniu)

Niepowodzenia i zapobieganie

1.Jądra blade, słabo widoczne

- za krótko w hematoksylinie lub zredukowana hematoksylina(stary barwnik), wymienić barwnik

2. Jądra czarne, nieczytelne

- za długo w hematoksylinie, przedłużyć płukanie w wodzie

3. Słabe zabarwienie tkanki łącznej

- za krótko w pikrofuksynie lub zbyt długo przetrzymano w wodzie lub za długo w alkoholach.

KONSERWACJA PREPARATÓW HISTOLOGICZNYCH

Preparaty po zabarwieniu muszą być odpowiednio zabezpieczone, ponieważ są nietrwałe(wysychają, pękają, odpadają od szkiełka, odbarwiają się). W tym celu zamykamy je w odpowiednim medium.

Preparaty parafinowe zamykamy po dokładnym odwodnieniu i prześwietleniu w żywicach naturalnych lub syntetycznych. Należą do nich: balsam kanadyjski, cedax, DPX, montex i inne. Wszystkie muszą spełniać następujące warunki:

- muszą być przejrzyste, bezbarwne

- nie mogą krystalizować

- muszą być płynne w zamkniętym preparacie

- muszą mieć współczynnik załamania światła zbliżony do szkła aby uniknąć w czasie oglądania uginania promieni świetlnych(ok.1.34-1,5)

- nie powinny odbarwiać preparatu

Wybór środka konserwującego zależy od: techniki histologicznej, wykrywanych składników, np. skrawki żelatynowe uwodnione zamykamy glicerożelatyną wg Kaisera lub syropem Apathy´ego(wykrywanie lipidów), skrawki parafinowe konserwujemy balsamem kanadyjskim i żywicami syntetycznymi.

Preparat po zabarwieniu musi być natychmiast zamknięty, nie można dopuścić do całkowitego odparowania ksylenu, ponieważ preparat pęka, odbarwia się i zamknie się z pęcherzykami powietrza, pod którymi powstają odbarwienia. Maksymalnie czas od wyjęcia preparatu z ksylenu do zamknięcia balsamem wynosi 25 -30 sek.

Do zamykania preparatów najlepiej używać zobojętnionego balsamu kanadyjskiego lub salicylowanego o konsystencji ciepłego płynnego miodu. Gęściejszy balsam powoduje powstanie grubej warstwy zamykającej, co utrudnia obserwację preparatu, zbyt rzadki balsam powoduje powstawanie pęcherzyków.

KOLEJNOŚĆ CZYNNOŚCI

1. Szkiełko nakrywkowe wytrzeć z pyłu szklanego bawełnianą ściereczką

2. Nanieść na szkiełko nakrywkowe kroplę balsamu kanadyjskiego lub innego medium o konsystencji ciepłego, płynnego miodu

3. Wyjąć preparat z ksylenu I , sprawdzić pod lampą(obserwacja cienia) i natychmiast przystąpić do zamykania

4. Odwrócić preparat i dotknąć do kropli balsamu(nie dociskać) i natychmiast odwrócić. Balsam rozprowadza się wzdłuż powierzchni szkiełka nakrywkowego siłami włosowatości.

5. Preparat wytrzeć od spodu i wzdłuż powierzchni szkiełka nakrywkowego unikając jego przesunięcia(uszkodzenie preparatu)

6. Preparat histologiczny umieścić w odpowiedniej kasetce w termostacie do wyschnięcia.

1