MIKRO KOŁO II

1. Podłoża

1. Endo

• Z siarczanem sodu i fuksyną -> hamowanie wzrostu G(+)

• Ciemnoczerwone kolonie laktozododatnich bakterii (kompleks fuksyna-siarczan)

• E.coli – zielono-złoty, metaliczny połysk (krystalizacja fuksyny na powierzchni)

• Kolonie laktozoujemnych – bezbarwne, przezroczyste

1. Z certymidem

• Do różnicowania bakterii Pseudomonas

• Certymid -> hamowanie wzrostu mikroflory towarzyszącej

• Z chlorkiem magnezu i siarczanu potasu -> wytwarzanie barwników przez komórki bakterii

• P. aeruginosa i P.fluorescens - kolonie okrągłe, przezroczyste, barwią się na żółto-zielony kolor

• P.fluorescens – w temp. > 35 C – drobne kolonie

1. TSI

• Trójcukrowe (glukoza, laktoza, sacharoza) w postaci słupkoskosów

• czerwone

• Z cytrynianem żelaza

• Do hodowli Enterobacteriaceae

• Fermentacja glukozy – żółty słupek

• Wytworzenie siarkowodoru – barwa czarna

• Pęcherzyki gazu lub porozrywany słupek – wytworzenie gazu z glukozy

• Fermentacja laktozy i/lub sacharozy – żółty skos

1. Simmsona

• Do różnicowania bakterii wg ich zdolności do asymilowania cytrynianu jako jedynego źródła węgla

• Skos

• Zmiana barwy z zielonej na niebieską – wynik dodatni, zmiana pH

1. Clarka (VP i MR)

• Żółte

• Substrat glukoza

• Bakterie z rodziny Enterobakteriaceae

• Próba Vogues-Proskauera (VP) - po hodowli na pożywce Clarka dodaje się 2 krople KOH i roztworu keratyny oraz 3 krople roztworu 1-naftolu.

• Wytworzenie różowego zabarwienia świadczy o obecności acetoniny

• Próba Methyl-Red (MR) – sprawdzenie stopnia zakwaszenia podłoża (określenie typu fermentacji) – do hodowli dodaje się kilka kropli roztworu czerwieni metylowej

- jeśli pH <4,5 – kolor czerwony (odczyn +),

- jeśli pH >4,5 – barwa pozostaje żółta (odczyn -)

1. Z tryptofanem

• Do badania obecności indolu w pożywce

• Płynna, do różnicowanie bakterii z rodziny Enterobakteriaceae

• Bakterie posiadające enzym tryptofanazę rozkładają ten związek z wytworzeniem indolu,

• Obecność indolu bada się za pom. Odczynnika Kovacsa

• Obecność indolu – czerwona obrączka

1. Christensena

• Podłoże z mocznikiem wg Christensena służy do różnicowania drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wykazujących zdolność hydrolizy mocznika. Źródłem składników odżywczych jest pepton. Fosforany utrzymują pH pożywki podczas wzrostu badanych szczepów. Substratem różnicującym jest mocznik. Podczas hydrolizy mocznika wytwarzany jest amoniak alkalizujący podłoże. Wskaźnik pH czerwień fenolowa w środowisku alkalicznym zmienia barwę z żółtej na intensywnie czerwoną .

• podłoże zawiera ekstrakt drożdżowy, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, mocznik, czerwień fenolową.

• Jeżeli po 24godz. hodowli nastąpiła zmiana barwy na amarantowy świadczy to o rozkładzie mocznika (obecność NH₄OH)

1. Pożywka Giolitti-Cantoni

• Giolitti Cantoni jest selektywną pożywką do wykrywania obecności i oznaczania liczby metodą NPL Staphylococcus aureus z próbek żywności i innych. Źródłem składników odżywczych są enzymatyczny hydrolizat kazeiny, ekstrakt wołowy oraz drożdżowy. Ponadto obecność mannitolu i pirogronianu sodu stymuluje wzrost S. aureus co umożliwia wykrycie ich obecności nawet przy nieznacznym zanieczyszczeniu . Wzrost bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich jest hamowany przez obecne w podłożu glicynę oraz telluryn potasu.

• Do wykrywania obecności gronkowców koagulazo-dodatnich

• Zaw. Telluryn (IV) potasu

• Zaczernienie pożywki – wynik dodatni

1. Podłoże Baird-Parkera

• Wybiórczo-różnicujące

• Wzrost mikroflory towarzyszącej jest hamowany przez chlorek litu i telluryn (IV) potasu

• Zawiera emulsję żółtka jaja

• Wymaga wykonania próby na koagulazę

• Do potwierdzania obecności gronkowców po pożywce Giolitti-Cantoni

1. Podłoże RPF

• To modyfikacja podłoża Baird-Parkera

• Wzbogacone o plazmę krwi króliczej, fibrynogen, inhibitor trypsyny

• Uzyskuje się od razu informację, czy wyrosłe kolonie gronkowców są koagulazo- dodatnie czy ujemne

• Kolonie małe, czarne lub szare (zaczernienie – skutek redukcji tellurynu potasu)

1. Podłoże Mossela (MYP)

• Do Bacillus cereus

• Zawiera mannitol, czerwień fenolową, polimyksynę, emulsję żółtka jaja

• Kolonie duże, różowe (brak fermentacji mannitolu), otoczone strefą zmętnienia

• Potwierdzanie: podłoże agarowe z glukozą i purpurą bromokrezolową (zmiana barwy na żółtą), pożywka Clarka (VP) (czerwona obrączka) i pożywka z KNO₃ (kolor czerwony) – wszystkie testy muszą dać wynik dodatni

1. Podłoże agarowe z glukozą i purpurą bromokrezolową

• Do potwierdzania obecności B.cereus po podłożu Mossela

• Zmiana barwy na żółtą – zdolność do fermentacji glukozy

1. Pożywka azotanowa (z KNO₃)

• Określenie zdolności do redukcji azotanów

• Po dodaniu odczynnika Griessa – czerwone zabarwienie

1. Izolacja bakterii

• Należy pobrać reprezentatywną próbę (homogenizacja, mieszanie, rozcieńczanie) i wykonać posiewy

1. Gronkowce koagulazo-dodatnie, np. Staphylococcus

• Za pomocą namnażania selektywnego – płynna pożywka Giolitti-Cantoni:

- posiew wybranego rozcieńczenia (obecność) lub rozcieńczenia (NPL) w 3 powtórzeniach

- inkubacja 37 C/ 24-48h , warunki beztlenowe

- z każdej probówki, w której nastąpi zaczernienie wykonuje się posiewy potwierdzające

• Posiewy potwierdzające:

- posiew metodą izolacyjną na podłoże agarowe RPF lub Baird-Parkera

- inkubacja 37 C/24-48h

• Wyniki:

- RPF – obecność co najmniej jednej charakterystycznej kolonii – kolonie małe, czarne lub szare otoczone mlecznobiałą strefą zmętnienia

- Baird-Parkera

• kolonie typowe (szare lub czarne otoczone przejrzystą opalizującą strefą – Egg-Yolk (+) ) i kolonie nietypowe (szare lub czarne bez strefy) przesiać na bulion mózgowo-sercowy ,

• inkubować 37 C/18-24h,

• dalej wykonać próbę na obecność koagulazy (przenieść do jałowej probówki 0,1cm³ hodowli i dodać 0,3cm³ plazmy krwi króliczej)

• inkubacja 37 C/4-6h – ścinanie się plazmy

• wynik ujemny – inkubacja jeszcze przez 24h

• wynik dodatni – co najmniej jedna kolonia potwierdzona jako koagulazo-dodatnia

1. Bacillus cereus

• Oznaczanie liczby - podłoże MYP (Mossela) :

- posiew met. Powierzchniową

- inkubacja 37-55 C/18-24h lub przez 48h, jeśli kolonie nie są wyraźnie widoczne

- kolonie duże, różowe, zwykle otoczone strefą zmętnienia

• Badania potwierdzające:

- z każdej płytki wziętej do liczenia wybrać po 5 charakterystycznych kolonii (z lub bez strefy zmętnienia)

- każdą z nich posiać za pom. Jałowego drucika na zestalone w probówkach podłoże agarowe z glukozą i purpurą bromokrezolową, do pożywki Clarka (VP) i pożywki z KNO₃

- inkubacja 30 C/24-48h

• Wyniki:

- pożywka agarowa – zdolność do fermentacji glukozy – zmiana barwy na żółtą

- pożywka Clarka – zdolność do tworzenia acetylometylokarbinolu – różowa obrączka w reakcji VP

- pożywka azotanowa – zdolność do redukcji azotanów – po dodaniu odczynnika Griessa powstaje czerwone zabarwienie

c) Przetrwalnikujące, beztlenowe, laseczki proteolityczne (redukujące siarczany (IV) )

– Clostridium

• Wykrywanie obecności w 1ml lub 0,1ml badanego materiału

- pasteryzacja 80 C/15min materiału

- chłodzenie materiału

- posiać materiał lub rozcieńczenie 1:10 po 1ml do 3 probówek

- posiewy zalać upłynnionym i ostudzonym (45 C) podłożem zaw. Siarczyn sodu, cytrynian żelazowo-amonowy i nadmanganian potasu

- wymieszać, a po zestaleniu zalać warstwą agaru wodnego

- inkubacja 37 C/1-4 dni

- kontrola wzrostu co 24h

- wzrost w 2 lub 3 powtórzeniach – obecność przetrwalników beztlenowców redukujących siarczany

- zaczernienie w wyniku redukcji cytrynianu – wynik dodatni

1. Charakterystyka grup mikroorganizmów

1. Bakterie G(-)

• Rodzaj Escherichia

- rodzina Enterobacteriaceae

- niektóre peritrichalnie urzęsione

- na agarze odżywczym tworzą kolonie o śr. 2-3mm, okrągłe, gładkie, lekko wypukłe, błyszczące, o gładkim brzegu, szaro-białe, łatwo dają się zawiesić w płynie fizjologicznym

- mogą też tworzyć kolonie szorstkie o suchej powierzchni i nie dające się zawiesić

- tlenowe i względnie beztlenowe

- laktozododatnie, katalazododatnie

- np. Escherichia coli, E. vulneris, E.hermannii

• Rodzaj Enterobacter

• Rodzina Enterobacteriaceae

• Urzęsienie peritrichalne

• Nieprzetrwalnikujące

• Wytwarzają otoczki

• Tlenowe I względnie beztlenowe

• Laktozo- i katalazododatnie

• Na agarze odżywczym tworzą kolonie o śr. 3-4mm, okrągłe, gładkie, wypukłe, błyszczące o gładkim brzegu, śluzowate, szaro-białe lub żółte

• Rodzaj Proteus

- rodzina Enterobacteriaceae

- urzęsione peritrichalnie

- nieprzetrwalnikujące

- tlenowe i względnie beztlenowe

- katalazododatnie

- laktozoujemne

- na agarze tworzą przejrzyste kolonie, rozprzestrzeniający, rozlany wzrost

- np. P.mirabilis, P.vulgaris

• Rodzaj Pseudomonas

- tlenowe pałeczki

- ruchliwe

- nieprzetrwalnikujące

- mezofilne lub psychrofilne

- o dużej aktywności biochemicznej

- niefermentujące

- na agarze tworzą kolonie okrągłe, czasem z nieregularnym brzegiem, przejrzyste, o charakterystycznym zabarwieniu (niektóre gatunki wytwarzają rozpuszczalne w wodzie barwniki dyfundujące do podłoża, np. fluoresceina żółto-zielona, piocjanina niebiesko-zielona, melanina brązowa, piorubryna czerwona

- kolonie mają zapach słodkawo-miodowy

- np. P.aeruginosa, P.fluorescens

1. Bakterie chorobotwórcze

• Staphylococcus

- ziarniaki G(+)

- kulisty kształt, tworzą skupiska przypominające grona

- śr. Komórek 0,5-1,5µm

- nieprzetrwalnikujące

- nieruchliwe,

- względnie beztlenowe

- lepiej rosną w obecności tlenu (mikroaerofilne)

- katalazododatnie

- tworzą pigmenty od szarych przez białe do ciemnożółtych

- rosną w 15-46 C (opt. 32-37 C) i pH 4,5-9,3

- 38 gatunków w tym gronkowce koagulazododatnie i koagulazoujemne

- np. S.aureus, S.epidermidis, S.xylosus, S.schleiferi

- występowanie: gleba, woda, skóra, jama nosowo-gardłowa, błony śluzowe ludzi i zwierząt stałocieplnych

- stwierdza się ich obecność w mleku surowym, przetworach mlecznych, kremach, sałatkach, ugotowanych makaronach

- szczepy chorobotwórcze mogą wywoływać stany zapalne narządów, anginę, ropowicę, posocznicę, zatrucia pokarmowe (intoksykacje), u bydła mastitis

- wytwarzają enterotoksyny (7 rodzajów A, B, C1,C2,C3,D,E)

- wydzielają enzymy (hemolizyny, leukocydyny, hialuronidaza fibrynolizyny, fosfatazy, lipazy, deoksyrybonukleazy

• Bacillus cereus

- G(+), przetrwalnikujące

- występują w glebie, wodzie, przetrwalniki wykrywane są w powietrzu

- przetrwalniki są odporne na ogrzewanie, wysychanie, dezynfekanty, promieniowanie jonizujące i UV

- żródłem B.cereus w żywności są ziarna zbóż, mąka, ryż, mleko i produkty mleczne, desery, budynie zagęszczane skrobią lub mąką

- to oportnistyczne patogen człowieka

- mogą być przyczyną bakteriemii, posocznicy, zapalenia wsierdzia, trąbki słuchowej, infekcji skórnych, oczu, zapalenia pluc, opon mózgowych

- wprowadzone z pokarmem komórki wegetatywne i przetrwalniki mogą produkować toksyny

• Przetrwalnikujące beztlenowe laseczki proteolityczne redukujące siarczany IV

- rodzaj Clostridium

- G(+) laseczki beztlenowe

- Występują w glebie, przewodzie pokarmowym ssaków

- szkodliwe w żywności

- zdolność do głębokiego rozkładu białek i redukcji siarczanów IV

• C.botulinum

- laseczka jadu kiełbasianego

- powoduje zatrucia pokarmowe wywołane neurotoksynami typów A,B,E,F,G

- zatrucia gł. Po spożyciu konserw warzywnych i mięsnych , typu E po spożyciu

ryb, konserw rybnych, ryb wędzonych, sałatek rybnych

• C.perfringens

- powoduje toksykoinfekcje pokarmowe wywołane tworzeniem

ciepłochwiejnej, białkowej enterotoksyny.

4) Toksykoinfekcje i intoksykacje

TOKSYKOINFEKCJE - są następstwem spożycia wraz z pokarmem drobnoustrojów zdolnych do wywołania zatrucia. Mogą się one również namnażać w przewodzie pokarmowym, w którym wydzielają toksyny. Do wystąpienia toksykoinfekcji jest konieczne wtargnięcie do organizmu bakterii w stanie żywym. Od liczby komórek które dostały się do organizmu człowieka zależy czy objawy chorobowe w ogóle wystąpią, jak również ostrość przebiegu schorzenia. W związku z tym wprowadzono pojęcie najmniejszej dawki zakaźnej (Minimal Infectious Dose - MID), wyrażonej liczbą komórek danego gatunku bakterii, która jest konieczna do wywołania objawowego przebiegu choroby u człowieka.

Bakterie: Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Clostridium perfringens typ A i C, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes,

INTOKSYKACJE - Zatrucie typu intoksykacji jest wynikiem działania toksyny wytworzonej w żywności przed jej spożyciem, a drobnoustroje praktycznie nie rozmnażają się w przewodzie pokarmowym człowieka i udział żywych komórek nie jest nawet konieczny. Przykładem intoksykacji jest zatrucie jadem kiełbasianym — toksyną wytwarzaną przez laseczkę beztlenową Clostridium botulinum lub enterotoksyną gronkowcową. Bakterie uwalniają te egzotoksyny do żywności i mogą zaistnieć sytuacje, kiedy drobnoustrój, który je wytworzył zginie na skutek różnych zabiegów technologicznych i jego wyizolowanie będzie niemożliwe, natomiast toksyna znajdująca się w produktach, wykazująca zwykle wyższą ciepłooporność będzie nadal szkodliwa dla organizmu.

Bakterie: C.botulinum, S.aureus