Genom- jest to całość DNA zawarta zespole chromosomów znajdującym się w jądrze komórkowym.

Genom człowieka -składa się z 22 diploidalnych autosomów, 2 allosomów oraz MtDNA. Chromosomalny genom zawarty jest w jądrze w 23 parach chromosomów.

Locus– określony obszar chromosomu zajmowany przez daną sekwencje DNA

Allel- są to różne warianty sekwencji DNA związanej z locus (różniące się sekwencją nukleotydów w DNA)

Pozagenowy DNA

Około 30% genomu jądrowego człowieka stanowią sekwencje ulegające transkrypcji i sekwencje związane z genami (eksony, introny, pseudogeny, fragmenty genów, sekwencje regulatorowe, sekwencje początkowe i końcowe genów). Pozostałą część stanowi pozagenowy DNA obejmujący sekwencje unikatowe oraz sekwencje powtórzone (repetytywne).

Sekwencje unikatowe w genomie człowieka stanowią ok. 80% pozagenowego DNA. Występują w genomie głównie w postaci jednej kopii.

Sekwencje powtórzone

W genomie Eukaryota występuje dużo powtórzonych sekwencji zasad. Ponad 20% DNA stanowią sekwencje powtórzone co najmniej dwadzieścia razy.

Sekwencje powtórzone w genomie człowieka można ogólnie podzielić na dwa typy: sekwencje rozproszone, gdzie powtórzone elementy są oddzielone od siebie innymi sekwencjami, oraz sekwencje powtórzone tandemowo, w których fragmenty powtórzone ułożone są obok siebie i łączą się jak „głowa do ogona”

Polimorfizm

Oznacza występowanie różnic w DNA populacji. Polimorfizmem nie określa się jednak zmian rzadkich. Kryterium zaliczenia do tej kategorii jest, aby dana zmiana była częstsza niż 1% .

Może odnosić się do sekwencji kodujących lub niekodujących. Polimorfizm genowy oznacza występowanie różnorodnych odmian danego genu, co w konsekwencji może prowadzić do różnic w budowie i działaniu białka kodowanego przez ten gen.

Polimorfizm można podzielić na:

• SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism) – polimorfizm pojedynczego nukleotydu; Zjawisko zmienności sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu (A, T, C lub G) pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danego osobnika

• polimorfizm sekwencji minisatelitarnych, są to sekwencje zawierające zmienną liczbę tandemowych powtórzeń kilkunasto- lub kilkudziesięciu nukleotydowego motywu. W zależności od ilości powtórzeń fragment taki ma charakterystyczną długość. Liczba powtórzeń decyduje o długości fragmentu, co z kolei wpływa na szybkości jego przemieszczania się podczas elektroforezy.

• polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych, są to proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami. Najczęściej są to jednak dwunukleotydowe motywy powtórzeń. Często motyw taki może być, regularnie przerywany inną sekwencją. Jako odcinki niekodujące ulokowane są zazwyczaj w intronach jednak czasami znajdujemy je również eksonach w postaci mniejszej liczby powtórzeń. Dzięki dużemu zróżnicowaniu ilości powtórzeń motywu podstawowego jego polimorfizm jest ogromny.

Szczególnym rodzajem ministalitarnego DNA są powtórzenia telomerowe, których rozmiary sięgają 10 - 15 tysięcy nukleotydów. Składają się one zawsze z powtórzeń tego samego fragmentu sześciozasadowego i mieszczą na końcach chromosomów zabezpieczając przed ich skracaniem się w trakcie kolejnych podziałów komórkowych.

Wykrywanie mutacji i polimorfizmów metodą analizy restrykcyjnej RFLP (restriction fragment lenght polymorphism): enzymy restrykcyjne, analiza RFLP

Mutacje są to zmiany właściwej sekwencji DNA organizmu spowodowane działaniem czynników chemicznych i fizycznych lub błędami w replikacji DNA. Mutacje są utrwalane w wyniku podziałów komórkowych. Rodzaj mutacji i skutek jej działania są określone przez genotyp i fenotyp.

Mutacje punktowe

• Mutacje missensowne

• Mutacje nonsensowne

• Mutacje powodujące przesunięcie ramki odczytu

• Mutacje ciche

Mutacje większe

• Delecje

• Insercje

• Rearanżacje

Enzymy restrykcyjne

• enzymy należące do klasy hydrolaz, które działając na DNA i RNA doprowadzają do ich rozkładu do oligonukleotydów przez rozerwanie wiązań fosfodiestrowych wewnątrz łańcucha kwasu nukleinowego.

• Podstawowym narzędziem w badaniu RFLP są endonukleazy restrykcyjne. Rozcinają DNA w rozpoznawanym miejscu lub innym, w zależności od typu enzymu

E. Restrykcyjne klasy I

• Kompleks złożony z trzech podjednostek, z których każda ma osobną aktywność rozpoznawania endonukleazy i metylazy

• Rozcinają obie nici w miejscu niespecyficznym, odległym o ok. 1000 pz od miejsca rozpoznania

• Ich aktywność zależy od Mg²⁺ i ATP

E. Restrykcyjne klasy II

• Najważniejsza klasa endonukleaz restrykcyjnych

• Endonukleaza i metylaza występują jako osobne enzymy.

• Rozcinają obie nici w rozpoznawanym specyficznym i rozcina dwie nici (4-8 pz), rozpoznaje sekwencje palindromowe.

E. Restrykcyjne klasy III

• Endonukleaza i metylaza są oddzielnymi kompleksami zbudowanymi z dwóch podjednostek.

• Rozcinają tylko jedną nić w miejscu oddalonym o 24-26 nt poniżej końca 3’ rozpoznawanego miejsca

Analiza RFLP

• przedstawia mapę markerów polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych genomu człowieka.

• Pozwoliła ona na wykrycie pewnych wzorców RFLP, które powstają w wyniku substytucji pojedynczej pary zasad.

• RLFP może być markerem chorób genetycznych

Metoda analizy VNTR i STR

• Bada się tutaj zmienność długości fragmentów DNA, ale wynikające z długości, a nie z sekwencji nukleotydowej powtórzeń minisatelitarnych

• Powtórzenia VNTR są rozproszone po całym genomie, ale najbardziej widoczne w pobliżu telomerów

Analiza STR

• Stwarza większe możliwości różnicowania niż analiza minisatelitarna, a także wymaga mniejszej ilości DNA jako materiału do badań

• Analizę STR przeprowadza się zazwyczaj, stosując PCR multikompleksowy (PCR multiplex), Podczas rekacji PCR, do fragmentów DNA są włączane trzy różne barwniki fluorescyjne. Loci STR są rozdzielane podczas elektroforezy i wykrywane ujawnieniem koloru po wzbudzaniu barwników

VNTR – czyli profile genetyczne

• Do celów sądowniczych używa się zwykle zestawu pojedynczych loci o zmiennej długości, preferowane są powtórzenia czteronukleotydowe. DNA zostaje strawione przez restryktaze, ale nie rozcina samej sekwencji tandemowej, np. HaeIII lub HinII. W dalszych etapach analizy VNTR wykorzystuje się metodę Southerna w celu sporządzenia mapy genów. Zastosowana metoda nie dostarcza jednak żadnych informacji o cechach genotypowych danej osoby.

Analiza polimorfizmu DNA w medycynie sądowej.
Ustalanie ojcostwa

Historia zastosowania RFLP

Inne zastosowania profilowania DNA

• Badania dot. ewolucji

• Wykrywanie kłusownictwa

• Testowanie kawioru (bieługa)

Ustalanie ojcostwa

• Pobranie próbki materiału genetycznego

• Izolacja DNA

• Namnożenie pozyskanego DNA - reakcja PCR

• Sekwencjonowanie DNA (sekwentator)

• Analiza statystyczna

• Wyniki

Identyfikacja ofiar zamachów, katastrof górniczych, lotniczych np. (WTC) oraz identyfikacja osób na podstawie badań DNA szczątków wydobytych z anonimowych grobów masowych