Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

Wydział Nauk o śywności i Rybactwa

Zakład Opakowalnictwa i Biopolimerów

I N S T R U K C J A

Ć W I C Z E N I E 7

Aminokwasy, peptydy, białka

(podstawowe właściwości i wybrane reakcje charakterystyczne)

Białka

Aminokwasy

Aminokwasy są to związki dwufunkcyjne, których cząsteczki zawierają grupy

karboksylowe i aminowe:

grupa aminowa:

H

N

H

grupa karboksylowa:

O

C

O

H

Nomenklatura aminokwasów:

Naturalne aminokwasy posiadają nazwy zwyczajowe tworzone poprzez dodanie do nazwy

macierzystej przedrostka amino−:

np. NH −

−

2 CH2 COOH kwas aminooctowy (glicyna)

Nazewnictwo zwyczajowe tworzy się podobnie jak fluorowco− lub hydroksokwasów; np.

NH −

−

2 CH2 COOH kwas aminoetanowy, kwas α−aminooctowy

Podział

Ze względu na skład chemiczny

•

obojętne (zawierają jedną grupę karboksylową i jedną aminową)

np.:

C H

C O O H

2

NH 2

glicyna (Gly)

H

C H

C

C O O H

2

3

NH 2

Alanina (Ala)

H C

3

CH

CH

COOH

2

H C

3

NH

2

Walina (Val)

HC

3

CH

CH

CH

COOH

2

2

HC

3

NH2

Leucyna (Leu)

H C

3

H C

CH

H

C

CH

COOH

2

3

2

NH2

Izoleucyna (Ile)

•

obojętne, ale zawierające jeszcze inne grupy funkcyjne;

HO

H

C

CH

COOH

2

NH2

Tyrozyna (Tyr)

HO

H

C

CH

COOH

2

NH2

Seryna (Ser)

CH

HC

C

C

CH2

CH

COOH

NH2

HC

C

CH

CH

N

H

Tryptofan (Trp)

HSCH 

2

CHCOOH Cysteina (Cys)



NH2

H2N

C

CH2

CH

COOH

O

NH2

Asparagina (Asn)

H2N

C

CH

CH

2

2

CH

COOH

O

NH2

Glutamina (Gln)

•

kwasowe charakteryzują się dodatkową grupą karboksylową

HO

C

CH2

CH

COOH

O

NH2

Kwas asparaginowy (Asp)

HO

C

CH

CH

2

2

CH

COOH

O

NH2

Kwas glutaminowy (Glu)

•

zasadowe charakteryzują się dodatkową grupą aminową

H N

(CH )

2

2 4

CH

COOH

NH2

Lizyna (Lys)

H

C

NH

(CH )

2N

2 3

CH

COOH

NH

NH2

Arginina (Arg)

N

C

CH2

CH

COOH

HC

CH

NH2

N

H

Histydyna (His)

Podział w zaleŜności od ustawienia grupy aminowej w stosunku do grupy karboksylowej;

•

aminokwas α CH 



3

CH2

CHCOOH kwas α−aminomasłowy



NH2

•

aminokwas β CH 



3

CHCH2

COOH kwas β−aminomasłowy



NH2

•

aminokwas γ CH 





2

CH2

CH2

COOH kwas γ−aminomasłowy



NH2

Podział aminokwasów w zaleŜności od moŜliwości syntezy aminokwasu w organizmie na:

•

endogenne (organizm potrafi je syntetyzować)

•

egzogenne (muszą być dostarczane z zewnątrz wraz z poŜywieniem),

naleŜą do nich: fenyloalanina, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina,

tryptofan, treonina, walina.

Metody otrzymywania aminokwasów

1) Hydrolityczny rozkład białka:

• enzymatyczny −przy uŜyciu enzymów proteolitycznych

• hydroliza kwasowa − działanie wyŜszej temperatury na preparaty białkowe

znajdujące się w 6M HCl lub 25% H2SO4. Rozkładowi ulegają tryptofan i

treonina.

• hydroliza zasadowa − w obecności stęŜonego NaOH lub Ba(OH)2. Rozkładowi

ulegają cysteina i arginina

2) Reakcja fluorowcokwasów z amoniakiem

+Br2, T

+2NH

CH

3

3

COOH

Br

CH

COOH

2

NH

-HBr

-NH Br

2

CH2

COOH

4

3)

Reakcja aldehydów z cyjankiem amonowym ( reakcja cyjanohydrynowa)

+NH , +HCN

+2H O

2

CH

3

CH

CH

CN

CH

CH

COOH

3CHO

3

3

-H O

-NH

2

3

NH

NH

2

2

Właściwości fizyczne

Aminokwasy występują przede wszystkim jako substancje stałe, krystaliczne. Posiadają słodki smak. Rozpuszczalność w wodzie jest dobra, posiadają wysokie temperatury topnienia,

natomiast nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych.

Właściwości chemiczne

1) Aminokwasy jako substancje amfoteryczne

W roztworach wodnych aminokwasy wykazują odczyn prawie obojętny a w wyniku

dysocjacji powstaja jony:

H O

2

+

-

+

R

R

CH

COOH

NH

R

COO-

CH

COO

3

+ H

+

NH

NH

3

2

Jon obojnaczy to wewnątrzcząsteczkowe zobojętnienie grupy aminowej (−NH2)

resztą karboksylową co powoduje utworzenie wewnętrznej soli amoniowej. Taka sól posiada

jednocześnie ładunek dodatni jak i ujemny, ilości tych jonów równowaŜą się. W zaleŜności od

środowiska w jakim znajduje się aminokwas ( środowisko kwaśne H+ lub środowisko

−

zasadowe OH ) moŜe występować w formie kationu bądź anionu.

Gdy będzie to środowisko kwaśne wówczas grupa ujemna aminokwasu przyjmuje H+ co

powoduje cofnięcie dysocjacji grupy karboksylowej i wówczas dany aminokwas posiada ładunek dodatni.

W przypadku odwrotnym (środowisko zasadowe) następuje przesunięcie reakcji w

kierunku powstawania anionu (odłączenie koordynacyjnie związanego protonu i przyłączenie

−

z jonem OH − powstanie wody).

+

-

+ [

H ]

+ [

O

H ]

R

CH

COOH

-

R

CH

COO

-

R

CH

COO

+

+

+

-

NH

- [

H ]

- [

O

H ]

3

NH 3

NH2

Punkt izoelektryczny − pI:

Dla kaŜdego aminokwasu istnieje takie pH, w którym nie obserwuje się wędrówki jonów w polu elektrycznym. W punkcie izoelektrycznym aminokwas występuje jako jon obojnaczy.

Aminokwasy ze względu na swoją amfoteryczność ( występowanie jonu obojnaczego) dają jonowo zbudowane sole pod wpływem kwasów jak i zasad.

+ -

NH2

R

COOH +HCl

[NH

R

COOH] Cl

3

-

+

NH2

R

COOH + NaOH

NH

R

COO + Na + H O

2

2

2) Tworzenie wiązań peptydowych

COOH

O

COOH

CH2

COOH + H

CH

CH

HN

CH

2N

2

C

-H2O

NH2

CH

NH

3

2

CH3

3) Reakcje grupy karboksylowej:

• reakcja estryfikacji− polega ona na reakcji aminokwasu wraz z alkoholem powstają wówczas estry ( nie posiadaja one właściwości amfoterycznych), a wykazują właściwości

aminy.

+ H+

R

CH

COOH + HOC

[R

2H5 -H O

CH

COOC

2

2H5]+

NH2

NH2

-

+ OH

R

CH

COC

-H O

2H5

2

NH2

• dekarboksylacja − aminokwasy mogą przekształcić się w aminy gdy na nie zadziałamy podczas ogrzewania roztworem Ba(OH)2

R

T

CH

COOH

R

CH

NH + CO

2

2

2

Ba(OH)2

NH2

• tworzenie kompleksów − α−aminokwasy tworzą kompleksy z kationami metali (głównie

miedzi). Powstają wówczas barwne sole kompleksowe.

4) Reakcje grupy aminowej:

• Deaminacja − aminokwasy posiadające I−rzędową grupę aminową pod wpływem kwasu

azotowego (III) utleniają się do hydrokwasu i uwalniają grupę aminową w postaci azotu.

R

CH

COOH + HONO

R

CH

COOH + N2 + H2O

NH2

OH

Są róŜne rodzaje deaminacji:

hydrolityczna

hydrolityczna z dekarboksylacją

przez redukcję

desaturatywna

• Utlenianie

Utlenianie aminokwasów prowadzi do powstawania ketokwasów.

+ [

O ]

+ H O

2

R

CH

COOH

R

C

COOH

R

C

COOH + NH3

- [

2

H ]

NH2

NH

O

• Zasady Schiffa

Aminokwasy, które są powiązane w postaci zasady Schiffa mogą ulegać róŜnym

przemianom biochemicznym tj. transaminacja, dekarboksylacja.

O

R

CH

COOH +

C

R

R

CH

N

CH

R + H O

2

NH2

H

COOH

Wykrywanie aminokwasów

1.

Reakcja ninhydrynowa

Aminokwasy w tej reakcji wraz z ninhydryną dają fiołkowoniebieskie zabarwienie.

O

OH

Zasada

OH + R

CH

COOH

2

O

NH2

O

O

O

N

+ Zasada. H + 3 H2O + R

C

O O

H

2.

Reakcja ksantoproteinowa

Reakcja te słuŜy do wykrywania aminokwasów aromatycznych (fenyloalanina,

tyrozyna, tryptofan). Dodanie stęŜonego kwasu azotowego (V) powoduje

występowanie Ŝółtego zabarwienia, spowodowanego powstaniem pochodnych

nitrowych aminokwasów.

Peptydy

Są to związki powstające w wyniku kondensacji aminokwasów. Wiązanie peptydowe

wygląda następująco:

O

C

NH

Podział peptydów:

1.

Dipeptydy

COOH

O

COOH

CH2

COOH + H

CH

CH

HN

CH

2N

2

C

-H2O

NH2

CH

NH

3

2

CH3

2.

Tripeptydy np.: glutation

3.

Tetrapeptydy

4.

Polipeptydy: polimery aminokwasów o masie cząsteczkowej do 10000.

Glutation:

Zbudowany jest z trzech aminokwasów: kwasu glutaminowego, cysteiny

i glicyny. Glutation pełni rolę układu odpowiadającego za utrzymanie na odpowiednim poziomie potencjału oksydoredukcyjnego komórek. W postaci zredukowanej zawiera grupę tiolową −SH, a w postaci utlenionej ditiogrupę −S−S−.

Niektóre hormony są peptydami np.: wazopresyna (zbudowana z 9 aminokwasów

i jednego mostka disiarczkowego), oksytocyna (zbudowana równieŜ z 9 aminokwasów).

Białka

Białka są to polimery aminokwasów białkowych połączone wiązaniami peptydowymi.

Są to polipeptydy zbudowane z więcej niŜ 100 reszt aminokwasowych, posiadające masę cząsteczkową wyŜszą niŜ 10000.

Budowa białek

Budowa białek jest złoŜona. W celu jej określenia podaje się tzw. struktury:

1. Struktura I−rzędowa określa ona sekwencję aminokwasów w cząsteczce białka czyli kolejne ułoŜenie aminokwasów w białku.

2. Struktura II−rzędowa mówi nam o układzie przestrzennym wynikającym z obecności wiązań wodorowych. Są dwie konformację łańcucha polipeptydowego. Pierwsza z nich

mówi o kształcie łańcucha w formie prawoskretnej linii śrubowej tzw. α−heliks. Druga nazywana jest strukturą β−harmonijką, mówimy o niej wówczas, gdy łańcuchy

peptydowe układają się równolegle do siebie i łączą się wiązaniami wodorowymi.

Konformację α−heliksu posiadają białka globularne a β białka budulcowe.

3. Struktura

III−rzędowa

charakteryzuje

pofałdowanie

łańcuchów

peptydowych

w przestrzeni ( skręcenie łańcucha polipeptydowego). Bardzo waŜną rolę odgrywają tutaj

wiązania siarczkowe −S−S− tworzące się między resztami cysteiny. Dzieki tym

wiazaniom białka sa bardziej odporne na czynniki denaturujące. Innymi waŜnymi

połączeniami wewnątrz białka są siły Wan der Waalsa.

4. Struktura IV−rzędowa, określa ilość i wzajemne ułoŜenie podjednostek cząsteczkowych (pojedyńczych łańcuchów) białek. Są to struktury bardzo złoŜone.

Właściwości fizyko−chemiczne białek

Białka są na ogół rozpuszczalne w wodzie, niektóre rozpuszczają się w rozcieńczonych roztworach kwasów i zasad a inne w rozpuszczalnikach organicznych. Ulegaja hydratacji poprzez wykazanie zdolności do wiązania cząsteczek wody. Początkowo pęcznieją

a następnie się rozpuszczają. Tworzą cząstki koloidalne. Na ich rozpuszczalność ma teŜ

wpływ stęŜenie soli nierganicznych. Niewielkie stęŜenie wpływają dodatnio, ale

przekroczenie pewnego stęŜenia powoduje oddzielenie wody i wypadanie ich z roztworu (wysalanie)−jest to proces odwracalny i nie narusza ich struktury, niszczy jedynie ich otoczkę solwatacyjną. Białka ulegają procesowi koagulacji i procesowi odwrotnemu - peptyzacji.

Koagulacja jest to przejście zolu w Ŝel, a peptyzacja jest to przejście Ŝelu w zol.

Denaturacja białka − jest to zniszczenie struktury II, III, IV −rzędowej bez naruszenia struktury I−rzędowej. Czynikami deneturującymi są:

mocne kwasy i zasady

wysoka temperatura

sole metali cięŜkich

alkohole,aldehydy

promieniowanie UV i X

Dzięki obecności w cząsteczce białka ładunków elektrycznych posiadają one właściwość poruszania się w polu elektrycznym. Przy warunkach sprzyjających tworzeniu ładunków (+)

białko przesuwa się w stronę katody, natomiast w odwrotnych warunkach przesuwa się w stronę anody. Wykorzystano tą właściwość do rozdzielenie miesznin białek na drodze elektoforezy.

Podział białek

Podstawowy podział białek:

1.

Białka proste − proteiny, które po hydrolizie dają wyłącznie aminokwasy

2.

Białka złoŜone − proteidy, zawierają one oprócz aminokwasów inne niebiałkowe

składniki np.: grupę prostetyczną

Białka proste:

1.

Protaminy

2.

Histony

3.

Albuminy

4.

Globuliny

5.

Prolaminy

6.

Gluteiny

7.

Skleroproteiny

Białka złoŜone:

1.

Fosfoproteidy

2.

Nukleoproteidy

3.

Chromoproteidy

4.

Metaloproteidy

5.

Glikoproteidy

6.

Lipoproteidy

Zagadnienia do przygotowania:

Aminokwasy − wzory, definicja, nazewnictwo, klasyfikacja, wykrywanie.

Właściwości chemiczne aminokwasów − reakcje charakterystyczne.

Klasyfikacja i budowa peptydów.

Właściwości fizyko − chemiczne białek.

Napisać reakcje alaniny z:

a) HNO2

b) HCl

c) H2O

d) CH3OH

e) KOH

Podaj równania reakcji dla powyŜszych syntez:

a) etan−alanina

b) metan−glicyna

c) etan−glicyloalanina

Podać zawartość procentową azotu w kwasie α−aminopropinowym.

Związek organiczny zawiera 48,6% węgla, 8,1% wodoru, 43,3% tlenu. W reakcji z bromowodorem daje on bromopochodną o masie molowej większej o 79 g/mol od

związku wyjściowego. Bromopochodna ta reaguje z amoniakiem tworząc aminokwas.

Podaj nazwę aminokwasu i związku.

Podać strukturalny wzór związku zawierającego 77,4% węgla, 7,5% wodoru i 15,1%

azotu. Masa cząsteczkowa związku wynosi 93 g.

Ćwiczenie 1. Badanie właściwości kwasu aminooctowego.

Kwas aminooctowy (glicyna) to biała krystaliczna substancja stała, która dość dobrze rozpuszcza się w wodzie. Odczyn powstałego roztworu jest obojętny.

Przebieg ćwiczenia:

a) Część pierwsza doświadczenia

1. Przygotować roztwór glicyny !

0,5g

glicyny

(odwaŜyć

na

wadze

w

naczyńku

wagowym)

rozpuścić

w 3 cm3 H2O destylowanej (czynność wykonać w probówce ).

2. Do małej kolbki stoŜkowej wlać niewielką ilość 5% NaOH, wkroplić kroplę

fenoloftaleiny.

3. Do probówki z roztworem glicyny dodawać kroplami 5% roztwór NaOH zabarwiony

fenoloftaleiną (znajdujący się w kolbce stoŜkowej).

Barwa w środowisku

Ilość kropli

Nazwa

Zakres pH

dodawana do

wskaźnika

kwaśnym

zasadowym

zmiany barwy

roztworu

czerwono -

fenoloftaleina

-

8,2 – 10,0

1

fioletowa

b) Część druga doświadczenia

1. Przygotować roztwór glicyny !

0,5g

glicyny

(odwaŜyć

na

wadze

w

naczyńku

wagowym)

rozpuścić

w 3 cm3 H2O destylowanej (czynność wykonać w probówce).

2. Do drugiej probówki wlać 3 cm3 H2O destylowanej.

3. Do kaŜdej z nich dodać po 0,5 cm3 5% HCl.

4. Zbadać odczyn w próbówkach papierkiem uniwersalnym.

Zadania i pytania:

1. Opisać obserwacje i spostrzeŜenia z przeprowadzonego doświadczenia.

Ćwiczenie 2. Wykrywanie aminokwasów

Alfa−aminokwasy tworzą z ninhydryną barwne połączenia. Wykorzystuje się to

w chromatografii bibułowej, aby rozdzielić składniki mieszaniny aminokwasów.

Po „rozwinięciu” chromatogram suszy się i spryskuje odczynnikiem ninhydrynowym.

Przebieg ćwiczenia:

1. OdwaŜyć w naczyńku wagowym na wadze analitycznej 0,2g α−aminokwasu.

2. Zawartość przesypać do probówki następnie dodać 2 cm3 wody.

3. Zawartość probówki wymieszać.

4. Następnie dodać 3−5 kropli roztworu ninhydryny.

5. Mieszaninę ogrzewać nad palnikiem gazowym do wrzenia.

6. Powstanie niebieskiego zabarwienia świadczy o obecności α−aminokwasu.

Zadania i pytania

1. Opisać obserwacje i spostrzeŜenia z przeprowadzonego doświadczenia.

Ćwiczenie 3. Badanie właściwości fizycznych białek

Białko jaja kurzego (albumina) rozpuszcza się wodzie tworząc roztwór koloidalny. DuŜe cząsteczki białek z uwagi na obecność silnie polarnych grup: −COOH, −NH2, −OH ulegają solwatacji. Dodanie mocnego elektrolitu niszczy otoczkę solwatacyjną. Wówczas nastąpi wytrącenie białka z roztworu zwane wysoleniem. Jest to proces odwracalny. Pod wpływem soli metali cięŜkich, mocnych kwasów, formaliny itp. zachodzi wytrącenie białka

z roztworów w sposób nieodwracalny − denaturacja.

Przebieg ćwiczenia:

Przygotowanie roztworu białka !

1. 5g białka jaja (oddzielić białko od Ŝółtka, odwaŜyć 5g białka na wadze analitycznej w naczyńku wagowym)

2. Przelać białko do kolby miarowej na 200 cm3 (przy uŜyciu lejka) dodać

195 cm3 wody destylowanej (odmierzyć cylindrem miarowym) dodać do kolby miarowej

zamknąć korkiem i wymieszać.

Wysalanie białka

1.

Do probówki wlać 2 cm3 roztworu białka

2.

Następnie do probówki dodać 2 cm3 nasyconego roztworu (NH4)2SO4.

3.

Dodać do probówki 10 cm3 wody destylowanej i wstrzasnąć.

Denaturacja białka

1. Przygotować 5 próbówek,

2. Do kaŜdej probówki dodać 2 cm3 roztworu białka,

3. Do pierwszej dodać kilka kropli 5% Pb(NO3)2,

4. Do drugiej dodać kilka kropli 5% HgCl2,

5. Do trzeciej dodać kilka kropli stęŜonego H2SO4,

6. Do czwartej dodać kilka kropli formaliny,

7. Ostatnią probówkę wstawić do wrzacej łaźni wodnej i ogrzewać do wrzenia,

8. Na koniec do kaŜdej z probówek dodać 10 cm3 wody destylowanej i wstrząsnąć.

Zadania i pytania:

1. Opisać obserwacje i spostrzeŜenia z przeprowadzonego doświadczenia.

Ćwiczenie 4. Wykrywanie białek

Do wykrywania białek stosuje się poniŜsze reakcje:

− reakcja biuretowa, polega ona na powstawaniu fioletowoniebieskiego kompleksu

białka z wodorotlenkiem miedzi (II). Reakcja ta daje pozytywne efekty w przypadku białek (od tetrapeptydów), dają ją równieŜ niektóre substancje niebiałkowe np.:biuret,

− reakcja ksantoproteinowa − jest to nitrowanie (działanie stęŜonych kwasem azotowym (V) związków posiadajacych pierścień aromatyczny występujących w białkach

np.: fenyloalanina i tworzeniu Ŝółtego zabarwienia,

− reakcja cystynowa − wykrywa ona białka zawierające związki siarki. Po zasadowej

hydrolizie tworzy się siarczek (II) sodu, który reaguje z solami ołowiu (II), tworząc czarny osad siarczku ołowiu,

− reakcja ninhydrynowa − aminokwasy reagują z ninhydryną tworząc barwne

związki.

Przebieg ćwiczenia:

Reakcja biuretowa

1. Przygotować dwie probówki

2. Do pierwszej probówki dodać 2 cm3 mleka

3. Do drugiej probówki dodać 2 cm3 roztworu białka (wcześniej przygotowanego patrz ćwiczenie 3).

4. Do obu probówek dodać po 2 cm3 stęŜonego NaOH oraz kilka kropli CuSO4.

Reakcja ksantoproteinowa

1. Przygotować dwie probówki

2. Do pierwszej probówki dodać 2 cm3 mleka

3. Do drugiej probówki dodać 2 cm3 roztworu białka (wcześniej przygotowanego patrz ćwiczenie 3).

4. Do obu probówek wlać po 1 cm3 stęŜonego HNO3.

5. Probówki ogrzewać w łaźni wodnej przez 3 minuty aŜ roztwór zabarwi się na Ŝółto.

6. Probówki ochłodzić pod zimną wodą.

7. Do

kaŜdej

probówki

dodać

1

cm3

stęŜonego

roztworu

NaOH

[ OSTROśNIE! Dodaje prowadzący!!! ]

Reakcja ninhydrynowa

1. Do probówki wlać 1 cm3 mleka i 1 cm3 0,1% roztworu ninhydryny .

2. Probówkę ogrzać w łaŜni wodnej.

Zadania i pytania:

1. Opisać obserwacje i spostrzeŜenia z przeprowadzonego doświadczenia