Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Wykorzystanie elektroforezy w warunkach denaturujących do

analizy stopnia oczyszczenia białek i wyznaczania ich masy

cząsteczkowej

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest ocena skuteczności wstępnych etapów oczyszczania

dehydrogenazy glutaminianowej z siewek pszenżyta i wyznaczenie masy cząsteczkowej

handlowego preparatu białka drogą elektroforezy w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)

sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli 1970, Nature 227:

680-685).

Wprowadzenie

Elektroforeza denaturująca jest powszechnie używana w laboratoriach do separacji

białek w zależności od ich masy cząsteczkowej, w oparciu o różną szybkość migracji białek

przez sito (pory żelu) pod wpływem pola elektrycznego. Białka natywne o tej samej masie

cząsteczkowej będą migrować z różną szybkością w polu elektrycznym uzależnioną zarówno

od ładunku jak i kształtu. Zatem, żeby szybkość migracji była zależna tylko od masy

cząsteczkowej białek, należy zniszczyć ich trójwymiarową strukturę sprowadzając kształt

cząsteczki do liniowego i zamaskować ładunek elektryczny łańcuchów bocznych

aminokwasów. Dzieje się to za pośrednictwem SDS. SDS razem z krótkotrwałym działaniem

wysokiej temperatury i niszczącym mostki dwusiarczkowe merkaptoetanolem, sprawiają, że

białka o strukturze czwartorzędowej dysocjują na podjednostki, a redukcja mostków

dwusiarczkowych do grup SH powoduje, że łańcuchy polipeptydowe przyjmują kształt

pałeczkowaty. SDS wiąże się dość równomiernie do zlinearyzowanych łańcuchów

białkowych (ok 1,4 g SDS/1g białka) co sprawia, że ładunek białka jest w przybliżeniu

proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej. Ponieważ SDS jest detergentem anionowym

więc nadaje ładunek ujemny wszystkim białkom. W polu elektrycznym białka opłaszczone

ujemnie naładowanym SDS będą poruszać się w kierunku elektrody naładowanej dodatnio (w

elektroforezie anody) z różną szybkością zależną już tylko od masy cząsteczkowej. Pole

elektryczne oddziałuje silniej na większe cząsteczki obdarzone większym ładunkiem niż na

mniejsze cząsteczki, ale większe cząsteczki napotykają znacznie większy opór porów żelu

poliakryloamidowego. Ostatecznie białka rozdzielają się w żelu w taki sposób, że im niższa

masa cząsteczkowa tym szybciej migruje białko.

Poliakryloamid jest chemicznie inertny i co ważniejsze, łatwo przygotować żele o

różnych wielkościach porów dobierając odpowiednio procentowość żelu i stosunek ilości

akryloamidu do bisakryloamidu. Zastosowanie do elektroforezy dwóch rodzajów żeli

(zagęszczającego i rozdzielającego) różniących się zarówno pH jak i wielkością porów

pozwala na dobry rozdział białek. Typ elektroforezy, w której bufor w żelu i bufor

elektrodowy (rozwijający) różnią się pH, nosi nazwę elektroforezy nieciągłej ang.

discontinuous. Stosuje się ją częściej do rozdziału białek w przeciwieństwie do elektroforezy

ciągłej ang. continous, w której bufor w żelu i bufor elektrodowy mają takie samo pH.

Znaczenie żelu zagęszczającego. Po włączeniu dopływu prądu, naładowana ujemnie

glicyna w buforze rozwijającym (pH 8,3) „ucieka” od ujemnie naładowanej elektrody w

kierunku żelu zagęszczającego i prób. Jednak panujące tu znacznie niższe pH (6,8) sprawia,

że cząsteczki glicyny tracą większość swoich ujemnych ładunków, co zmniejsza ich

ruchliwość. Jony chlorkowe znajdujące się w żelu zagęszczającym i w próbach także

przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej. Zachowanie obu rodzajów jonów

powoduje, że tworzy się wąski obszar o małym przewodnictwie (czyli bardzo wysokiej

1

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

oporności) na początku żelu zagęszczającego. Ponieważ z prawa Ohma V = i · R to prawie

całe napięcie przyłożone do żelu jest ograniczone do tego wąskiego obszaru. Bardzo wysokie

natężenie pola elektrycznego powoduje, że ujemnie naładowane białka przemieszczają się do

przodu. Są one poprzedzane przez jony chlorkowe, a za białkami wędrują powolne jony

glicyny. W rezultacie przemieszczania się tego wąskiego obszaru o wysokim napięciu,

wszystkie białka przesuwają się w żelu zagęszczającym w zwartym prążku i docierają do żelu

rozdzielającego w tym samym czasie niezależnie od ich masy cząsteczkowej. W żelu

rozdzielającym wszystko się zmienia, panuje tu wyższe pH (8,8) i glicyna staje się

naładowana bardziej ujemnie, co powoduje, że zwiększa się jej ruchliwość, natomiast

ruchliwość białek zmniejsza się dzięki działaniu żelu jako sita. W rezultacie glicyna nie

utrzymuje już białek w wąskim obszarze o wysokiej oporności i dużym natężeniu pola

elektrycznego. Teraz białka znajdują się w jednorodnym polu elektrycznym i poruszają się we

własnym tempie; następuje ich rozdział według masy cząsteczkowej.

Elektroforeza denaturująca jest stosowana obok sączenia molekularnego, do

wyznaczania masy cząsteczkowej białek. Obydwie metody uzupełniają się, bo technika

sączenia molekularnego pozwala na wyznaczenie masy cząsteczkowej białek natywnych, a

dzięki SDS-PAGE możemy dowiedzieć się, czy badane białko jest monomerem, czy

przeciwnie jest zbudowane z podjednostek i jaka jest liczba tych podjednostek.

Odczynniki.

1. Gotowy do użycia 30% w/o roztwór mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu – w

proporcji odpowiednio 29,2% : 0,8%

2. 1,5 M bufor Tris-HCl pH 8,8

3. 0,5 M bufor Tris-HCl pH 6,8

4. TEMED – N,N,N’,N’-tertrametyloetylenodiamina,

5. APS- nadsiarczan amonowy - 10% roztwór w/o

6. Woda dejonizowana,

7. Bufor rozwijający – Tris-glicyna-SDS (0,025 M Tris) pH 8,3 zawierający 0,1% SDS

8. Bufor do prób zawierający 1% błękit bromofenolowy, 25% glicerol, 2% SDS, 0,7 M

merkaptoetanol i 0,05 M bufor Tris-Gly pH 6.8.

9. 10% SDS

10. 0,1% błękit Comassi brillant blue R-250 w 40% metanolu i 10% kwasie octowym

11. Roztwór odbarwiający: 40% metanol w 10% kwasie octowym.

Wykonanie.

Przygotowanie aparatu

Do wszystkich prac zaleca się stosowanie rękawiczek jednorazowych. Aparat do

elektroforezy (np. wyprodukowany przez Firmę Bio-Rad) przygotować zgodnie z zaleceniami

prowadzącego ćwiczenia, zwykle należy upewnić się czy mamy do dyspozycji wszystkie

ruchome elementy aparatu oraz odtłuścić szybki przy pomocy stężonego etanolu lub acetonu.

Kolejnym etapem jest złożenie szybek w statywie, aby powstały komory do wylania płytek z

żelem poliakryloamidowym. W komorach umieścić grzebienie i w odległości około 1 cm

poniżej zębów grzebienia zaznaczyć pisakiem poziom napełnienia komór żelem

rozdzielającym. Wyjąć grzebienie.

Przygotowanie 12% żelu rozdzielającego

Do czystej probówki typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć

następujące odczynniki (objętość całkowita wynosić będzie 16,0 ml): 6.4 ml 30% roztworu

mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 4,0 ml 1,5 M buforu Tris-HCl (pH 8,8), 0,16 ml

10% SDS, 5,36 ml wody dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować

2

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

pipetę do nakładania żelu wyskalowaną na 3,75 ml z czysta końcówką. Następnie dodać 8 µl

TEMEDù (inicjuje reakcję polimeryzacji) oraz 80 µl 10% nadsiarczanu amonu (APS,

katalizuje proces polimeryzacji), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść do komór

formujących żel po 7,5 ml do każdej (2 x 3,75 ml pipetą automatyczną na 5 ml). Na koniec,

na wylane między szybkami żele nawarstwić 0,5 ml dejonizowanej wody w celu odcięcia

dopływu powietrza i pozostawić bez ruchu, możliwie nie narażając polimeryzujących żeli na

szybkie zmiany temperatur (np. otwarte okno), na 45 minut do polimeryzacji.

Przygotowanie 4% żelu zagęszczającego

Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, zlać ostrożnie nawarstwioną wcześniej

wodę do zlewu – przechylając ostrożnie zablokowane w statywie komory do formowania żelu

(wcześniej przechylając delikatnie przekonać się, czy zaszła polimeryzacja). Do komór

włożyć pod kątem ok. 30-45 stopni grzebienie, tak aby po wlaniu żelu można było łatwo

wcisnąć je do komory – czynność tą przećwiczyć „na sucho”. Następnie do czystej probówki

typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość

całkowita wynosić będzie 10,0 ml): 1,33 ml 30% roztworu mieszaniny akryloamidu i

bisakryolamidu, 2,5 ml 0,5 M buforu Tris-HCl (pH 6.8), 6,1 ml wody dejonizowanej.

Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę wyskalowaną np. na 4,0 ml z

czysta końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMEDù oraz 100 µl 10% nadsiarczanu amonu.

Wszystkie składniki szybko wymieszać i nanieść na żel rozdzielający poniżej 1-2 mm górnej

krawędzi niższej płytki. Płynnie wcisnąć grzebień, począwszy od końca niżej zanurzonego w

żelu, tak aby pod krawędziami grzebienia nie zebrały się pęcherzyki powietrza, nadmiar żelu

powinien wypłynąć z komory. Tak przygotowane płytki pozostawić na 45 minut do

polimeryzacji.

Przygotowanie prób do nanoszenia na żel

Na każdy żel zostaną nałożone następujące preparaty: wzorzec białek o znanych

masach cząsteczkowych, roztwór białka do oznaczenia masy cząsteczkowej i próby z

kolejnych etapów oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej. Jeśli oprócz homogenatów z

liści były także oczyszczane homogenaty z korzeni to koniecznie trzeba je nałożyć na żel.

Zamrożone próby z kolejnych etapów oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej

rozmrozić na stole laboratoryjnym. Dokładnie wymieszać i wstawić do lodu. Przygotować

naważki albuminy i trypsyny każda o zawartości białka 1mg/ml i rozpuścić w 0.5 M buforze

Tris-HCl pH 6,8. Do 80 µl każdej z prób i roztworów albuminy i trypsyny dodać 20 µl buforu

do przygotowania prób ( stosunek 4:1). Wzorzec białek ogrzać w termobloku w 70º C przez

30-60 sek. Wszystkie próby ogrzać w 95º C przez 5-7 min. Obliczyć objętość prób jaką trzeba

nałożyć na żel, tak żeby do każdej studzienki odpipetować 30-40 µg białka. Albuminę i

trypsynę nałożyć w ilości 10-20 µg na studzienkę. Wzorzec białek w ilości 5 µl na studzienkę.

Rozdział elektroforetyczny ekstraktów

Upewniwszy się że nastąpiła polimeryzacja żelu wyciągnąć grzebienie, na podstawie

wskazówek prowadzącego ćwiczenia umieścić płytki z żelem w aparacie do elektroforezy

zaznaczając, która płytka należy do której grupy studentów. Przepłukać studzienki buforem

rozwijającym, wlać bufor rozwijający do takiego poziomu aby zakrył studzienki. Nanieść do

studzienek odpowiednie objętości wzorca białkowego, albuminy lub trypsyny i preparatów

pochodzących z oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej. Tak samo postąpić z drugim

żelem. Wstawić aparat do pojemnika na bufor, wlać bufor do poziomu przykrywającego

3

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

dolną elektrodę. Aparat przykryć pokrywą i podłączyć do zasilacza. Włączyć zasilacz.

Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 150 V do momentu gdy barwnik znajdzie się

około 5 mm od końca żelu. Następnie wyłączyć zasilacz, zdjąć pokrywę i wylać bufor

rozwijający. Wyjąć płytki i delikatnie podważając zdjąć jedną z nich z powierzchni żelu. Żel

zsunąć do szalki z barwnikiem i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 12 godz.

Następnie odbarwić tło wymieniając kilkakrotnie roztwór odbarwiający.

Opracowanie wyników

Wyznaczenie masy cząsteczkowej. Obliczyć wartość Rf czyli stosunek odległości na

jaką przesunęły się od początku żelu rozdzielającego poszczególne prążki białek wzorca do

odległości na jaką przemieścił się barwnik. Na tej podstawie sporządzić krzywą kalibracyjną

odkładając na osi rzędnych logarytmy mas cząsteczkowych wzorców białek, a na osi

odciętych odpowiadające im wartości Rf. Następnie na podstawie wyznaczonych wartości Rf

dla albuminy i trypsyny odczytać dla nich logarytmy mas cząsteczkowych i przeliczyć je na

masy cząsteczkowe.

Analiza oczyszczenia dehydrogenazy glutaminianowej. Porównać liczbę i

intensywność prążków na poszczególnych etapach oczyszczania enzymu. Na podstawie masy

cząsteczkowej monomeru dehydrogenazy glutaminianowej z pszenżyta (44 kD) wskazać

prawdopodobne położenie prążka pochodzącego od oczyszczanego enzymu. Sprawdzić czy

intensywność tego prążka zwiększa się w miarę puryfikacji. Porównać obraz rozdziału

elektroforetycznego preparatów z korzeni i części nadziemnych pszenżyta, czy widać różnice

we wzorach prążków?

4