UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
WĘGLOWODANY
(identyfikacja nieznanego cukrowca)
Zadanie 1
Celem zadania jest przeprowadzenie szeregu reakcji charakterystycz-
nych na obecność wybranych węglowodanów. Wyniki reakcji ze znanymi cu-krami naleŜy zanotować i wykorzystać w zadaniu 2.
Wykonanie oznaczenia
1. Próba Molischa.
Jest to ogólna próba na węglowodany. Wynik ujemny tej próby niesie znacznie więcej informacji niŜ wynik dodatni, poniewaŜ wynik ujemny świadczy, Ŝe w badanej próbce absolutnie nie ma Ŝadnego węglowodanu, zarówno w formie wolnej jak i związanej (np. jako glikoproteid, lub ja-ko glikolipid). Wynik dodatni próby nie daje tej pewności, Ŝe w otrzymanej próbce znajduje się rzeczywiście węglowodan, poniewaŜ i inne związki chemiczne nie mające nic wspólnego z węglowodanami (np. aceton, kwas mrówkowy, mlekowy, szczawiowy, cytrynowy) ulegają teŜ reakcji kondensacji z alfa-naftolem, dając identycznie zabarwione produkty reakcji
– jest to tak zwany fałszywy wynik dodatni.
Wykonanie próby:
Do 1 cm3 badanego roztworu cukru dodać 2 - 3 krople alkoholowego roztworu alfa-naftolu (odczynnik Molischa) i wymieszać. Następnie bardzo ostroŜnie! wprowadzić z dozownika po pochylonej ściance probówki około 1cm3 stęŜonego kwasu siarkowego, tak by na dnie probówki powstała warstwa kwasu. Ten sposób dodawania odczynnika nazywa się podwarstwie-niem. Odczekać kilka minut. Na granicy stęŜonego H2SO4 i odczynnika Molisha tworzy się stopniowo czerwono-fioletowa obrączka.
StęŜonego kwasu, ani stęŜonej zasady
absolutnie nigdy nie moŜna pipetować
ustami! StęŜony odczynnik z pojemnika,
w którym się on znajduje, naleŜy pobrać
za pomocą odpowiedniego dozownika.
2. Próba Biala.
Jest to próba na pentozy. Wykorzystuje reakcję kondensacji orcyny z furfuralem który powstaje z pentozy pod wpływem stęŜonego, gorącego kwasu solnego.
09-11-19 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 1.19.11.09
- 1 z 4 -
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
Wykonanie próby:
Do 1cm3 odczynnika Biala dodać 1— 2 krople roztworu pentozy (rybo-zy). Ogrzewać ostroŜnie nad palnikiem do wrzenia i utrzymywać wrzenie roztworu przez kilkanaście sekund. W czasie ogrzewania nie dopuścić do przegrzewania się roztworu poprzez silne wstrząsanie ogrzewanej probów-ki. Produkt kondensacji furfuralu z orcyną ma intensywnie zielony kolor.
3. Próba Seliwanowa.
Jest to próba na ketozy. Pod wpływem gorącego, 12% kwasu solnego tylko ketozy przekształcają się w 5-hydroksymetylenofurfural. Aldozy zaś
pozostają
w
tych
warunkach
nie
zmienione.
Powstały
5-
hydroksymetylenofurfural
reaguje
(kondensuje)
z
rezorcyną
( m-
dihydroksybenzem) na produkt o wiśniowo-czerwonym zabarwieniu.
Wykonanie próby:
Do 1 cm3 odczynnika Seliwanowa (roztwór rezorcyny w HCI) dodać 1– 2
krople roztworu ketozy (fruktozy). Zmieszać i ostroŜnie ogrzewać nad palnikiem. Próba, po około 30 sek. Ogrzewania, zabarwia się na kolor wiśniowo-czerwony. (Niekiedy trzeba ogrzewać próbkę trochę dłuŜej).
UWAGA: W tej próbie równieŜ i sacharoza daje wynik pozytywny, poniewaŜ sacharoza w swojej cząsteczce zawiera fruktozę, a gorący 12% HCI hydrolizuje ten disacharyd na glukozę i fruktozę.
4. Próba Benedicta.
Próba Benedicta jest najbardziej swoistą i najczulszą próbą redukcyjną na cukry.
O d c z y n n i k B e n e d i c t a s k ł a d a s i ę z C u S O 4 , cy t ryni anu sod u or az N a 2C O3. W p rób ie tej jon y miedzi na plus drugim stopniu utlenienia (o barwie niebieskiej) ulegają redukcji do czerwonego, nierozpuszczalnego Cu2O, gdzie miedź jest na plus pierwszym stopniu utlenienia. Niestety, dodatni wynik próby Benedicta dają równieŜ i ketozy (fruktoza). Spowodo-wane jest to zjawiskiem enolizacji zachodzącej w środowisku zasadowym, a takie środowisko panuje w odczynniku Benedicta.
Wykonanie próby:
Do 1 cm3 odczynnika Benedicta dodać kilka kropel roztworu badanego cukru. Probówkę z węglowodanem i odczynnikiem redukującym ogrzać do wrzenia nad palnikiem. Obserwować czy wytrąca się pomarańczowy lub czerwony osad tlenku miedziawego Cu20.
5. Próba Barfoeda.
Jest to próba umoŜliwiająca odróŜnienie disacharydów (o własnościach redukujących) od monosacharydów. Reakcje redukcji w chemii organicznej 09-11-19 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 1.19.11.09
- 2 z 4 -
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
zachodzą najłatwiej w środowisku zasadowym. W miarę zwiększania się kwa-sowości środowiska zdolność redukcyjna cukrów spada i właśnie ta wła-
ściwość została wykorzystana do zróŜnicowania cukrów prostych (monosacharydów) od dwucukrów redukujących.
Wykonanie próby:
Do 3 probówek odmierzyć po 1 cm3 odczynnika Barfoeda. Do pierwszej dodać 1 cm3 roztworu glukozy, do drugiej 1 cm3 laktozy (maltozy), a do trzeciej lcm3 sacharozy. Po zamieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 3 minuty. Odczytać wynik. Wszystkie trzy probówki ponownie umieścić we wrzącej łaźni wodnej w celu dalszego ogrzewania. Po 15 minu-tach probówki wyjąć i ponownie odczytać wynik. Przeprowadzić interpreta-cję otrzymanych wyników.
6. Identyfikacja polisacharydu.
Identyfikacja polisacharydów (amyloza, amylopektyna, glikogen) anali-
tycznie jest bardzo prosta. Wykorzystuje się specyficzną i bardzo czułą, reakcję z jodem: amyloza z I2 daje barwę niebieską, amylopektyna fiołko-wą a glikogen brunatną.
Wykonanie próby:
Do 3 probówek odmierzyć po 1 cm3 amyloza, amylopektyna, glikogen a następnie do kaŜdej dodać 10 kropli roztworu J2 w KJ. Zinterpretować wyniki.
Zadanie 2
Celem zadania jest identyfikacja nieznanego węglowodanu. Aby okre-
ślić pozytywny lub negatywny rezultat próby naleŜy wykorzystać wyniki z zadania 1. Rezultaty dla wszystkich moŜliwych cukrów uŜytych w doświad-czeniu przedstawiono w tabeli.
ryboza
glukoza fruktoza laktoza sacharoza
próba Benedicta
+
+
+
+
-
próba Barfoeda
-
-
-
+
-
próba Biala
+
-
-
-
(+)
próba Seliwanowa
-
-
+
-
+
+ próba dodatnia, - próba ujemna
Wykonanie oznaczenia
Pobrać próbę nieznanego węglowodanu od prowadzącego ćwiczenia.
1. Przeprowadzić próbę Molisha, aby uzyskać pewność, Ŝe otrzymana prób-ka do analizy zawiera węglowodan.
09-11-19 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 1.19.11.09
- 3 z 4 -
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
2. Przeprowadzić próbę z I2 (jod w jodku potasu), aby stwierdzić ewentu-alną obecność polisacharydów w otrzymanej próbce.
3. Wykonać wszystkie podane w tabeli specyficzne próby na węglowodany.
Wynik zanotować w tabeli. Odpowiedzieć na pytanie: Jaki węglowodan znajdował się w badanej próbie?
badana próba
próba Molischa
próba z jodem
próba Benedicta
próba Barfoeda
próba Biala
próba Seliwanowa
09-11-19 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 1.19.11.09
- 4 z 4 -