Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii
• PodłoŜe mineralne AB
sole A + sole B + czerwień fenolowa + sole Tuovinena + agaroid fosforany tiosiarczan mikroelementy sodu
podłoŜe stałe, selekcyjne dla chemolitoautotrofów
źródło energii – tiosiarczan sodu Na2S2O3
źródło węgla – CO2
czerwień fenolowa znacznik dla zmiany pH (z lekko zasadowej na kwasową), tj.
obecności bakterii, które utleniają tiosiarczan do SO 2-
4 (barwa czerwona zmienia się
na Ŝółtą)
obligatoryjne chemolitoatotrofy rosną tylko na tym podłoŜu
Np. Halothiobacillus neapolitanus
(pałeczka gram-, bezwzględny chemolitoautotrof, bezwzględny tlenowiec, uzyskuje energię z utleniania siarki i jej zredukowanych związków nieorganicznych)
fakultatywne chemolitoautotrofy rosną na tym podłoŜu i na podłoŜu dla heterotrofów
Np. Paracoccus versutus
(pałeczka gram-, względny chemolitoautotrof, zdolny do wzrostu autotroficznego na poŜywkach tiosiarczanem; prototrof, rośnie heterotroficznie na licznych związkach organicznych, które wykorzystuje jako jedyne źródło C i energii)
Wzrost bakterii na podłoŜu AB – bardzo słaby, ale zauwaŜalny (Ŝółknie), gdyŜ
utlenianie związków nieorganicznych zapewnia tylko nieznaczny wzrost Chemoorganoheterotrofy nie rosną na poŜywce AB
Np. Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
• Agar odŜywczy
Bulion odŜywczy + agar-agar + woda
podłoŜe stałe, pełne, dla heterotrofów lub fakultatywnych autotrofów źródło węgla – pepton
rosną bakterie chemoorganoheterotroficzne, dla których źródłami C i energii są związki zawarte w podłoŜu
Np. Bacillus subtilis
(laseczka gram+, chemoorganotrof, prototrof)
1
(ziarniak gram+, tlenowiec, chemoorganotrof, auksotrof)
rosną teŜ fakultatywne chemolitoautotrofy, które w obecności organicznych związków węgla przestawiają się na tryb heterotroficzny
Np. Paracoccus versutus
Obligatoryjne chemolitoautotrofy nie rosną na tym podłoŜu, ze względu na brak związków nieorganicznych, z utlenienia których mogłyby czerpać energię do asymilacji CO2 (nawet jeśli miałyby związek nieorg. to ich wzrost byłby tak znikomy w porównaniu ze wzrostem bakterii heterotroficznych, Ŝe nie byłyby one zauwaŜalne)
Np. Halothiobacillus neapolitanus
Pełne podłoŜe zawiera wszystkie potrzebne czynniki wzrostu dla róŜnych szczepów E.
coli
Escherichia coli WT
Escherichia coli MG1693 thr, leu, pro, his, arg, tiamina
Escherichia coli AB1157 tymina
(pałeczka gramm - , rodzina enterobacteriaceae, względny beztlenowiec, chemoorganotrof, WT
prototropf)
• PodłoŜe dla nitryfikatorów
Woda + sole mineralne
(NH4)2SO4, MgSO4, FeSO4, K2HPO4, NaCl, CaCO3
podłoŜe płynne, mineralne, selekcyjne
źródło węgla – CO2
źródło energii – związki nieorganiczne
brak związków organicznych
obecne źródło S, P, NH +
4
NH +
4 -najbardziej zredukowana forma azotu, łatwo dostępna dla bakterii bakterie nitryfikacyjne – obligatoryjne chemolitoautotrofy
hodowane w czystych roztworach soli rosną bardzo powoli (czas generacji – ok. 10
godz), dlatego nie obserwujemy zmętnienia
I faza: NH +
-
4 NH2OH NO2 (Nitroso- )
II faza: NO -
-
2 NO3 (Nitro- )
dodajemy grudkę gleby, inkubujemy przez tydzień
wykrywamy obecność jonów azotynowych NO -
2 przez dodanie kropli mieszaniny
α-naftyloaminy z kwasem sulfanilowym.
Powstanie róŜowego zabarwienia świadczy o obecności w glebie bakterii Nitrosomonas
• Agar odŜywczy + skrobia (1%)
2
Źródło energii – związek organiczny
Źródło węgla – pepton + skrobia
Wyrosną bakterię heterotroficzne:
Escherichia coli (dziki)
Bacillus subtilis
Wykorzystywanie skrobi jako dodatkowego źródła węgla wykrywamy przez dodanie płynu Lugola, brak zabarwienia w miejscach gdzie skrobia została rozłoŜona świadczy o właściwościach amfolitycznych
Bacillus subtilis
Fioletowe zabarwienie w miejscach gdzie skrobia nadal znajduje się w podłoŜu: Escherichia coli (dziki)
• Agar odŜywczy + mleko(4%)
jałowe, odtłuszczone
PodłoŜe stałe, półprzezroczyste (mleczny wygląd nadawany przez kazeinę), źródło węgla – pepton + kazeina
wykorzystywane do wielu testów, na ćwiczeniach badamy zdolności proteolityczne bakterii – rozkładanie kazeiny (zanika zmętnienie)
Na poŜywce rosną bakterie heterotroficzne:
Escherichia coli
Bacillus subtilis (dziki)
Zanik zmętnienia, świadczący o zdolnościach proteolitycznych (wykorzystywanie kazeiny jako dodatkowego źródła węgla) obserwujemy wokół posiewu: Bacillus subtilis
Nie obserwujemy wokół posiewu:
Escherichia coli (dziki)
• Agar odŜywczy + tłuszcz(3%)
wrząca margaryna
podłoŜe stałe, róŜnicujące
źródło węgla – pepton + tłuszcze
bakterie wykorzystują tłuszcz jako dodatkowe źródło węgla rozkładają tłuszcz do glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych
3
KT reagują z siarczanem miedzi (20% roztwór CuSO4) powstaje szmaragdowe zabarwienie
Na wzbogaconej poŜywce agarowej rosną oba posiane szczepy heterotroficzne: Escherichia coli
Pseudomonas fluorescens
(pałeczka gramm -, orzęsione, tlenowce, chemoorganotrof, prototrof, heterotrof, denitryfikator) Po zalaniu roztworem CuSO4 powstaje szmaragdowe zabarwienie, świadczące o zdolności do wykorzystywania tłuszczu wokół posiewu:
Pseudomonas fluorescenscens
Zabarwienia nie obserwujemy wokół posiewu:
Escherichia coli
• śelatyna odŜywcza
Woda + Ŝelatyna + pepton
PoŜywka stała, wylewana w słupki
Źródło węgla – pepton + Ŝelatyna
śelatyna – białko, bakterie posiadające zdolności proteolityczne będą ją rozkładać (te same, które rozkładają kazeinę)
Obserwujemy rozrzedzenie poŜywki, świadczące o zdolnościach proteolitycznych i rozłoŜeniu Ŝelatyny – zestalacza:
Bacillus subtilis
Na nie rozrzedzonej poŜywce rośną bakterie nie mające zdolności proteolitycznych: Escherichia coli
• EMB z laktozą
Ekstrakt droŜdŜowy + hydrolizat kazeiny + K2HPO4 +NaCl + woda + agar-agar +
laktoza
i eozyna + błękit metylenowy – rozkładające laktozę charakteryzują się bordowym zabarwieniem wzrostu (powstanie kwasu mlekowego)
Escherichia coli lac+
Escherichia coli lac- (jasne zabarwienie wzrostu)
Skrypt: lac+ zabarwienie fioletowe z metalicznym połyskiem; lac- kolonie zabarwione na róŜ owo
Źródło węgla – laktoza + hydrolizat kazeiny ?
Źródło energii –
• PodłoŜe Davisa dla prototrofów
Davis – K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, woda
+ agaroid +glukoza 20%
4
Escherichia coli WT wyrośnie jako jedyna bo nie potrzebuje dodatkowych czynników wzrostu
Escherichia coli AB1157 thr, leu, pro, his, arg, tiamina
Escherichia coli MG1693 tymina
Źródło węgla – glukoza
Źródło energii –
• PodłoŜe Davisa dla auksotrofów
Davis + glukoza +agaroid
+kazeina +tiamina
Escherichia coli WT
Escherichia coli AB1157 w podłoŜu znajdują się potrzebne czynniki wzrostu Escherichia coli MG1693
Źródło węgla – glukoza + kazeina?
Źródło energii –
• PodłoŜe dla bakterii wiąŜących azot
Woda+ mannitol +K2HPO4 + KH2PO4 +MgSO4 + NaCl + CaCO3 + FeCl2
+Na2MoO4
PodłoŜe płynne, brak azotu w podłoŜu
Źródło węgla - mannitol
Źródło energii – związki nieorganiczne
Bakterie izolujemy z gleby – te wolnoŜyjące nie związane z korzeniami Warunki tlenowe - kolba
Azotobacter sp.
śluzowaty koŜuch (w obecności mannitolu w podłoŜu)
Warunki beztlenowe – probówka „z górką” + sacharoza
Clostridium pasteurianum
(laseczka gramm +, bezwzględny beztlenowiec, chemoorganotrof, prototrof, zdolny do wiązania azotu cząsteczkowego, gromadzi granulozę)
fermentacja masłowa – zapach
+ pęcherzyki gazu z dna probówki
oraz obserwacje pod mikroskopem
• PodłoŜe Davisa z róŜnymi źródłami azotu
Davis + glukoza (20%) + akaroid
5
- 10% NH4Cl –bardzo dobre uniwersalne źródło azotu – juŜ zredukowane Escherichia coli
Bacillus subtilis
- 10% KNO3 – by azotany były źródłem azotu do syntez muszą być zredukowane do formy NH3
Escherichia coli – nie potrafi redukować azotanów – brak reduktazy azotanowej asymilacyjnej (hamowana przez sole amonowe obecne w cytoplazmie) Bacillus subtilis
- 20% hydrolizat kazeiny
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Źródło węgla – glukoza
Źródło energii -
6