plik

TEN ROZDZIAŁ NIE JEST JESZCZE GOTOWY

GEETYKA MOLEKULARA BAKTERII I WIRUSÓW

Organizacja materiału genetycznego bakterii

Pojedynczy   chromosom   prokariotyczny   zawiera   praktycznie   całą   informację
genetyczną. Zdecydowana  większość  bakterii ma  chromosom kolisty  i nie  posiada
błony   oddzielającej  go   od   cytoplazmy   co   daje   możliwość   bliskiego   występowania
procesu   produkcji

mRNA

na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za

biosyntezę białek.

W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodzą
jednocześnie do tego stopnia, że możliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu

mRNA

zanim zostanie zakończona transkrypcja na drugim końcu.

Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesiąt pętli, które mają
końce unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występujące w
chromosomach bakteryjnych tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA
w chromosomie pełnią jeszcze pewne dodatkowe funkcje przypominając działaniem
czynniki transkrypcyjne w komórkach eukariotycznych.

Mapa  chromosomu  bakteryjnego  daje   pewne   wiadomości  o  jego  organizacji.  Poza
niektórymi   grupami   genów   skupionymi   w   operony,   nie   da   się   zaobserwować
konkretnego   wzorca,   według   którego   następowałaby   lokalizacja   genów   w
chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja operonów może zachodzić dla niektórych w
jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.

Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ściśle określone tzw.ori (origin of
replication)   dla   każdego   typu   bakterii,   ponadto   podobna   jest   aranżacja   genów
zarówno   w   ori  jak   i  w   miejscu   terminacji  syntezy   DNA.   Poza   tym  w   niektórych
bakteriach   wydaje   się   ważne,   aby   w   przypadku   pewnych   regionów   kierunek
transkrypcji był taki sam jak kierunek poruszania się widełkek replikacyjnych DNA.
(FIG7.33bomicroorg.)

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

1 z 21

2010-04-04 13:29

Replikacja DA

W replikacji DNA głównym problemem jest precyzyjna duplikacja sekwencji
nukleotydowych, co zachodzi dzięki parowaniu komplementarnemu. Proces replikacji
jest semikonserwatywny, co oznacza, że wyprodukowane podwójne helisy zawierają
jedną nić rodzicielską i jedną nowoutworzoną.

Replikacja zachodzi od 5' do 3' końca dzięki polimerazom DNA. Enzymy te nie mogą
rozpocząć syntezy nowej nici bez primera (zwykle krótka cząsteczka RNA).

Dobrze poznany jest mechanizm replikacji u E. coli. Proces ten zaczyna się w ori
(origin of replication, około 300 b rozpoznawanych przez specyficzne białka). W ori
podwójna helisa DNA otwiera się i zachodzi inicjacja na obu niciach jednocześnie z
utworzeniem specyficznej struktury tzw. widełek replikacyjnych.

W kolistym DNA E. coli dwukierunkowa replikacja prowadzi do powstania struktur
theta (na rysunku). U bakterii tej są trzy polimerazy DNA: I, II i III. Polimeraza DNA
III działa w widełkach replikacyjnych dodając nowe nukleotydy. W celu zajścia
replikacji podwójna helisa DNA jest rozwijana przez helikazę i stabilizowana przez
SSBP (single stranded binding protein).

Pomiędzy syntezą DNA na obu niciach istnieją wyraźne różnice. Synteza na nici
wiodącej 5' ŕ 3' przebiega w sposób ciągły, gdyż jest koniec 3'OH, do którego można
dodać nowy nukleotyd. Na drugiej nici DNA jest syntetyzowane fragmentami,
ponieważ nie ma końca 3'OH i konieczne jest zsyntetyzowanie małego primera RNA
aby dostarczyć wolne grupy 3'OH.

Po syntezie primeru primaza jest zastępowana przez polimerazę DNA III, która
dodaje nukleotydy do momentu dojścia do uprzednio zsyntetyzowanego DNA. Wtedy
polimeraza DNA III jest odłączana a pojawia się polimeraza DNA I, która poza
zdolnością do syntezy DNA, może usuwać primer RNA znajdujący się przed nią.

Po usunięciu primera polimeraza DNA I jest uwalniania i ostatnie wiązanie
fosfodiestrowe zostaje wyprodukowane przy pomocy ligazy DNA.

Podczas syntezy DNA w widełkach replikacyjnych następują zmiany w zwinięciu
DNA spowodowane przez enzymy rozplatające oraz topoizomerazy, które w pewnym
stopniu regulują proces replikacji.

Błędy replikacyjne naprawiane są przez polimerazę DNA III, która poza zdolnością
do syntezy DNA, ma aktywność 3' ŕ 5' egzonukleazy, co oznacza, że usuwa ona źle
wstawiony nukleotyd i zastępuje go nukleotydem prawidłowym. System naprawczy
nie zawsze zdoła wychwycić wszystkie błędy co może spowodować powstanie
mutacji.

Modele replikacyjne:

obracającego się koła

theta

przemieszczającej się pętli

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

2 z 21

2010-04-04 13:29

Wytłumaczone na rysunkach

Regulacja ekspresji genów u bakterii

Pierwszym   etapem   ekspresji   każdego   genu   jest   transkrypcja.   Prowadzi   ona   do
powstania RNA na matrycy DNA. Proces ten jest przeprowadzany przez polimerazę
RNA, a prekursorami są ATP, GTP, UTP, CTP. W przeciwieństwie do polimerazy
DNA polimeraza   RNA  może  zacząć  nową  nić  bez  primera.  Wszystkie  polimerazy
RNA   u   bakterii   są   skomplikowanymi   enzymami   składającymi   się   z   wielu
podjednostek. Enzym ten u E. coli zawiera podjednostki b , b ', a w dwóch kopiach
oraz s , która jest luźno związana z pozostałymi i łatwo może oddysocjować. Wiązanie
polimerazy RNA do DNA odbywa się w specjalnych miejscach promotorowych.

Cząsteczka s bierze udział tylko w formowaniu początkowego kompleksu polimerazy
RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie promotorów: sekwencji -35 od
miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie -10 od miejsca inicjacji. W
wyniku działania polimerazy RNA w kierunku 5' ŕ 3' powstaje

mRNA

U Prokaryota pojedyncza molekuła

mRNA

często koduje więcej niż jedno białko ze

względu na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA
transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego operonu na pojedynczą molekułę

mRNA

(tak zwane policystroniczne

mRNA

). W

mRNA

u Prokaryota zazwyczaj nie

występują introny, jednak jeśli już się tam znajdą to są samoistnie wycinane przez
RNA (zwane rybozymem).

tRNA

rRNA

powstają jako długie cząsteczki prekursorowe, które są następnie cięte

w kilku miejscach w celu utworzenia dojrzałych cząsteczek RNA.

mRNA

podlega na

ogół bezpośredniej translacji.

Translacja   zachodzi  w  kilku  etapach  :  inicjacja,   elongacja,  terminacja,  uwolnieni  i
sfałdowanie polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii jaką jest m.in. rybosom.
U Prokaryota  rybosomy  składają  się  z dwóch podjednostek: 30S i 50S dających w
połączeniu  rybosom 70S.  Podjednostka  30S  zawiera   16S

rRNA

i około 21 białek,

natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S

rRNA

i około 34 białek.

Inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawierającego
podjednostkę 30S,

mRNA

tRNA

dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do

tego kompleksu przyłącza się podjednostka 50S. Związanie

mRNA

z rybosomem

zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed
kodonem inicjacyjnym na

mRNA

). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca

16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokaryotycznym na translację
policystronicznego

mRNA

Proces inicjacji rozpoczyna się przyłączeniem aminoacylo-

tRNA

do kodonu start. U

bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy
białek zachodzi gdy osiągnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem
stop. Białka uwalniają się, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.

Zgromadzenie powiązanych ze sobą funkcyjnie genów bakteryjnych w jednym
miejscu związane jest z regulacją przeprowadzaną przez specyficzne cząsteczki,
umożliwiającą kontrolę ekspresji genów jednego szlaku metabolicznego.

Tego typu regulacja ekspresji genów bakteryjnych bierze się z konieczności

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

3 z 21

2010-04-04 13:29

efektywnego wykorzystania ograniczonych zapasów i energii oraz produkcji
wyłącznie niezbędnych związków.

Prawidłowo funkcjonująca komórka bakteryjna nie powinna syntetyzować enzymów
do metabolizmu laktozy, jeżeli brak jest laktozy w pożywce. Podobnie bezsensowne
byłoby produkowanie enzymów do syntezy tryptofanu jeśli znajdowałby się on w
wystarczającej ilości.

Dlatego też komórki bakteryjne opracowały precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy
różnych związków oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w której geny
odpowiedzialne za konkretny szlak metaboliczny znajdują się w jednym miejscu i
tworzą tzw.

operon.

Pierwszym   poznanym   mechanizmem   regulacji   operonowej   u   bakterii   jest   proces
rozkładu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegającym rozłożeniu na dwa
cukry składowe: galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Jeśli
w środowisku nie ma laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cząsteczek
tego   enzymu.   Natomiast   w   momencie   gdy   w   środowisku   znajduje   się   laktoza,   w
komórce pojawiają się tysiące cząsteczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiększa
się   w   komórce   ilość   pozostałych   enzymów   zaangażowanych   w   szlak   laktozowy
(galaktozydopermeazy i transacetylazy galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest
kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji. Geny
tych   trzech   enzymów   znajdują   się   w   jednym  liniowym  odcinku   na   chromosomie
E.coli i zostały oznaczone według kolejności występowania:

Z - beta galaktozydaza

Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)

A - transacetylaza galaktozydowa.

Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać może jednoczesnej indukcji przez
cząsteczkę laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, że przed tymi genami musi się
znajdować niezależny element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.

W końcu okazało się, że w regulacji bierze udział kilka genów:

gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cząsteczkę represora zdolną do
przejścia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wyłączający
operon

gen operatora, który otrzymuje sygnał wyłączający z represora

trzy geny kodujące białka, które są transkrybowane na jedno

mRNA

miejsce promotora (częściowo nachodzące na gen operatorowy), gdzie
przyłącza się RNA polimeraza i indukuje syntezę

mRNA

Operon laktozowy, lac, działa w następujący sposób. Gen regulatorowy produkuje
cząsteczkę represora, która może przenieść się do miejsca występowania operatora,
przyłączyć się do niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym
operonie.

Jeżeli w pobliżu nie ma cząsteczek laktozy, cząsteczka represora przyjmuje
konformację zdolną do związania się z operatorem. Gdy represor zwiąże się z
operatorem, promotor jest częściowo zasłonięty, wobec czego polimeraza RNA nie

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

4 z 21

2010-04-04 13:29

może się z nim związać i nie dochodzi do transkrypcji

mRNA

a następnie syntezy

trzech białek.

Jeżeli natomiast w środowisku obecna jest laktoza, represor wiąże się z nią i
przyjmuje inny kształt, który nie pozwala na połączenie się z operatorem. Promotor
pozostaje odsłonięty, wiąże się z polimerazą RNA i dochodzi do ekspresji genów,
które następnie prowadzą do rozkładu laktozy.

Jest to przykład regulacji genów na poziomie transkrypcyjnym.

FIG 14-10 z Hopsona p. 314 An inducible operon

Ten mechanizm jest prosty i ładnie tłumaczy dlaczego komórka E.coli produkuje
tylko tyle beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywistości sytuacja
staje się nieco bardziej skomplikowana gdyż komórka bakterii może jednocześnie
otrzymać laktozę i glukozę. Co wtedy?

Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza
może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw
rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych.

Bakteria zdolna do zużycia glukozy pomimo obecności laktozy w pożywce będzie
rosła szybciej niż inne bakterie tym samym zdobywając pewną nad nimi przewagę.

Dlatego też nie należy się dziwić, że powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna,
który   umożliwia   bakterii  zużywanie   na   początku   glukozy   nawet   gdy   jest   laktoza.
Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z
promotorem   w   operonie   lac   dużo   lepiej   w   obecności   specyficznego   białka   CAP
(catabolite   gene   activator   protein),   które   musi   być   związane   ze   specyficznym
miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże
się z tym miejscem jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi
przy braku glukozy.

Jeżeli natomiast glukoza znajduje się w pożywce, spada poziom cAMP, białko CAP
zmienia kształt, nie wiąże się z CBS, polimeraza RNA gorzej wiąże się z promotorem i
synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona.

Fig14-11 p.315 Represja kataboliczna Biology Wessels Hopson

Istnieją więc trzy różne poziomy aktywności operonu lac, zależne od obecności
laktozy i glukozy w pożywce oraz regulowane przez trzy różne białka: lac represor,
polimerazę RNA i CAP.

Najniższy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecność laktozy: nie ma substratu,
niepotrzebne są enzymy do katalizy, represor lac jest połączony z operonem i blokuje
wiązanie się polimerazy RNA.

Najwyższy poziom ekspresji obserwuje się przy obecności laktozy, lecz braku
glukozy: laktoza wiąże represor uniemożliwiając mu związanie się z operatorem, co z
kolei pozwala na przyłączenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i
łączenie się go z CAP i CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazę RNA.

Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonują
w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyż
obecność substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

5 z 21

2010-04-04 13:29

Ponadto mamy  do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji genów również
wynikającymi   z   dążenia   komórki   do   efektywnego   wykorzystania   surowców   ale
jednocześnie nie nadprodukowania jakiejś substancji bez wyraźnej potrzeby. Ten typ
mechanizmu   regulacji   to   represja   czyli   zahamowanie   syntezy   enzymów   szlaku
biosyntetycznego   w   odpowiedzi   na   nadmiar   końcowego   produktu.   Przykładem
operonu regulowanego w ten sposób jest operon tryptofanowy (trp).

Operon ten zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) kodujących enzymy, które prowadzą do
syntezy

aminokwasu

- tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego również

mamy do czynienia z cząsteczką represora kodowaną w niewielkiej odległości od
operonu. Cząsteczka represora trp podobnie jak lac może istnieć w dwóch
konformacjach: jedna powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji,
natomiast druga konformacja nie pozwala na związanie się represora z operatorem i
umożliwia zajście transkrypcji.

W obecności tryptofanu cząsteczka represora wiąże się z tym

aminokwasem

i zmienia

konformację, na taką która umożliwia związanie się z operatorem i zablokowanie
syntezy enzymów.

Jeżeli tryptofan jest nieobecny, represor nie może związać się z operatorem. Dochodzi
wtedy do przyłączenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie
doprowadzą do syntezy tryptofanu.

Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów czyli indukcja operonu lac i
represja operonu trp są przykładami na kontrolę negatywną. Oznacza to, że ekspresja
genów podlegających takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wyłączona przez
cząsteczkę represora.

Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, że
geny znajdujące się pod taką kontrolą ulegają ekspresji dopiero pod wpływem
działania specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji może
być opisana już wcześniej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu
lac przez wiąząnie się białka CAP do CBS.

Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do
rozkładu   maltozy   są   syntetyzowane   dopiero   po   dodaniu   maltozy   do   pożywki.   Ich
synteza   jest   regulowana   na   poziomie   transkrypcji   przez   białko   aktywujące
(AP-activator protein). AP  nie  może  związać  się  z DNA dopóki nie  połączy  się  z
cząsteczką maltozy. Gdy AP zwiąże się z cząsteczką maltozy, kompleks taki łączy się
z DNA i umożliwia polimerazie RNA rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie
jak   represor   rozpoznaje   specyficzną   sekwencję   DNA   tzw.   miejsce   wiązania
aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajdują się w kilku operonach
wobec   czego   aktywator   kontroluje   więcej   niż   jeden   operon.   Grupa   operonów
regulowanych przez jedno białko aktywujące nazywana jest

regulonem.

Atenuacja

Atenuacja   jest   typem   regulacji   opartym   na   fakcie,   że   w   organizmach
prokariotycznych   transkrypcja   i   translacja   są   procesami   wzajemnie   połączonymi.
Atenuacja   została   zaobserwowana   w   niektórych   operonach   kontrolujących
biosyntezę

aminokwasów

Najlepiej zbadanym przykładem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

6 z 21

2010-04-04 13:29

wspomnianymi już wcześniej genami i strukturami znajdującymi się w tym operonie,
operon   ten   zawiera   tzw.   sekwencję   liderową   w  obrębie   której  znajduje   się   region
atenuatora kodujący polipeptyd zawierający przy końcu kodony tryptofanu. Jeżeli w
komórce   znajduje   się   dużo   tryptofanu   peptyd   liderowy   zostanie   zsyntetyzowany.
Natomiast   przy   braku   tryptofanu   nie   powstanie   peptyd   liderowy.   Jakie   są   tego
rezultaty?

Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji genów
tryptofanowych. W jaki sposób?

Proces ten jest możliwy ze względu na fakt, że transkrypcja i translacja w komórkach
bakterii zachodzi praktycznie jednocześnie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega
transkrypcji i gdy następnie transkrypcja idzie dalej,

mRNA

sekwencji liderowej ulega

już translacji. Jednakże w przypadku

mRNA

sekwencji liderowej, gdy jest już

uwolnione z DNA i połączy się z rybosomem ulega ono sfałdowaniu w podwójną
pętlę, która sygnalizuje zatrzymanie transkrypcji dalszych genów (tryptofanowych).

Jeśli nie  ma  tryptofanu to nie  dojdzie  do translacji całej sekwencji liderowej gdyż
zostanie   ona   zatrzymana   na   kodonie   tryptofanowym,   co   powoduje   przyjęcie   innej
konformacji   przez

mRNA

sekwencji liderowej. Ta konformacja nie blokuje

polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych.
Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny sposób
kontrolują syntezę enzymów szlaku biosyntezy tryptofanu.

Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bekterii np. w
biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.

Antysensowne RA

Większość systemów kontrolujących czy to transkrypcję czy translację wykorzystuje
białka jako cząsteczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza się, że w regulację
zostanie zaangażowane RNA.

Jednym   z   rodzajów   regulatorowego   RNA   jest   RNA   antysensowne   używane   w
kontroli różnych genów bakteryjnych. Antysensowne RNA oddziałuje jako regulator
poprzez   parowanie   z   komplementarną,   sensowną   nicią   RNA.   Jeżeli   tą
komplementarną   nicią   jest

mRNA

, to parowanie z antysensownym RNA może

zapobiec zajściu translacji.

Antysensowne RNA może być syntetyzowane z tego samego genu co

mRNA

przez

zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do
pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym końcu.

PLAZMIDY

Plazmidy   są   to   elementy   genetyczne   zdolne   do   autonomicznego   powielania   się   i
istnienia   pozachromosomalnego.   Większość   plazmidów   ma   koliste,   superzwinięte
dsDNA, a  niektóre  liniowe  dsDNA. Wiele  plazmidów może  być  przenoszonych w
procesie koniugacji z jednej do drugiej komórki. Niektóre plazmidy mają zdolność do
wintegrowywania   się   w   chromosom   bakteryjny   i   wtedy   ich   replikacja   podlega
kontroli bakterii.

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

7 z 21

2010-04-04 13:29

Jednym z najlepiej poznanych plazmidów jest plazmid F z E.coli. Jest tp plazmid typu
koniugacyjnego i może być transferowany  z komórki donora do akceptora nawet z
fragmentami   chromosomalnego   DNA   donora.   Plazmid   F   jest   kolistą   cząsteczką
(dł.100bp)   i   zawiera   różne   geny   niezbędne   do   procesu   replikacji   i   transferu   ,   a
ponadto sekwencje, które pozwalają na rekombinację z chromosomem bakteryjnym
w   celu   utworzenia   Hfr.   Plazmidy   zdolne   do   integracji   w   chromosom   gospodarza
nazywane są episomami.

Większość   plazmidów   w   bakteriach   gramujemnych   przechodzi   replikację
dwukierunkową   według   modelu   theta   z   zastosowaniem   enzymów   komórkowych.
Natomiast  plazmidy  bakterii gramdodatnich w większości replikują  według modelu
obracającego   się   koła.   Plazmidy,   które   posiadają   materiał   genetyczny   w   formie
liniowej replikują w sposób podobny do adenowirusów. FIG 6.47

Pomimo, że plazmidy są niezależnie replikującymi elementami genetycznymi, ilość
ich cząsteczek w komórce jest do pewnego stopnia określona przez daną komórkę a
ponadto przez warunki zewnętrzne.

Plazmidy są w biologii molekularnej bardzo istotnym narzędziem służącym do
badania różnorodnych procesów genetycznych czy ekologii i życia bakterii. Ponadto
stosowane są w biotechnologii.

Obecność plazmidów w komórce może mieć znaczny wpływ na jej fenotyp np. u
Rhizobium to plazmidy umożliwiają współdziałanie z roślinami.

Ze względu na zróżnicowanie wielkości plazmidów oraz posiadanych przez nie genów
na:

produkcję toksyn

uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje

katabolizm nietypowych substrató np. pestycydów

kontrolę procesu koniugacji

i wiele innych, nie jest łatwo sklasyfikować plazmidy według jakiejś
charakterystycznej cechy.

Jednak dokonuje się podziału na pewne grupy.

Plazmidy koniugacyjne

Plazmidy te mają zdolność do przenoszenia się z komórki donora do akceptora w
procesie koniugacji. Za ten proces odpowiedzialne są geny w regionie tra znajdujące
się w plazmidach. Geny te związane są między innymi z syntezą pili np. F i I

Pili typu F biorą udział w transferze plazmidu F oraz niektórych plazmidów z
odpornością na antybiotyki. Pili typu I są zaangażowane w przenoszenie plazmidów z
opornością na antybiotyki i innymi właściwościami.

Plazmidy opornościowe (R - resistance)

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

8 z 21

2010-04-04 13:29

Plazmidy   te   nadają   komórce   oporność   na   antybiotyki   i   inne   inhibitory   wzrostu.
Plazmidy   R   mogą   posiadać   różnorodne   geny   oporności   na   antybiotyki.   Geny   te
kodują   zazwyczaj  białka   które   inaktywują   antybiotyk   albo   wpływają   na   pobranie
antybiotyku przez komórkę.

Plazmid R100 niesie oporność na sulfonamidy, streptomycynę, tetracyklinę,
chloramfenikol i inne. Plazmid ten może być przenoszony pomiędzy bakteriami z
Enterobakteriaceae: Escherichia, Klebsiella czy Salmonella.

Poza tym znane są plazmidy z opornością na kanamycynę, penicylinę czy
neomycynę. Ponadto plazmidy typu R posiadają geny, które hamują wprowadzanie
plazmidu tego samego typu do komórki, plazmid dodatkowy zostaje zgubiony w
procesie replikacji, co nie przeszkadza współistnieć w jednej komórce plazmidom z
dwóch różnych grup.

Możliwa jest rekombinacja genetyczna pomiędzy dwoma R co może prowadzić do
powstania organizmów opornych na wiele leków. Plazmidy R są odpowiedzialne za
uzyskiwanie przez bakterie chorobotwórcze oporności na leki (antybiotyki).

Komórki  bakteryjne   mogą   wymieniać   między   sobą   materiał  genetyczny   w   trzech
procesach,   które   zachodzą   naturalnie:   koniugacja,   transdukcja   i   transformacja.
mechanizmy   przekazywania   materiału   genetycznego   nie   są   związane   z   procesem
reprodukcji komórki bakteryjnej, zachodzą one w konkretnych warunkach i polegają
na przekazaniu niewielkiej części materiału genetycznego z komórki dawcy do biorcy.

REKOMBIACJA DA U BAKTERII

Proces rekombinacji jest to przeprowadzanie wymiany pomiędzy
homologicznymi odcinkami DNA. Jest to podstawowy mechanizm wymiany
genów pomiędzy chromosomami w żywych organizmach. Powoduje on
zwiększenie różnorodności genetycznej, a ponadto w sytuacjach ekstremalnych
przy dużym zniszczeniu DNA umożliwia przeżycie organizmu.

W trakcie rekombinacji u bakterii uczestniczy specyficzne białko RecA. Białko to ma
zdolność   do   niespecyficznego   (czyli   niezależnego   od   sekwencji)   wiązania   się   z
jednoniciowym   DNA.   Następnie   kompleks   białko-   DNA   atakuje   losowo   drugą
cząsteczkę   DNA,   powodując   rozplecenia   nici.   Jeżeli   natrafi   na   sekwencję
komplementarną   to   zapoczątkowuje   powstanie   DNA   rekombinowanego   z   nici
atakującej   i   atakowanej.   Powstaje   przejściowa   struktura   krzyżowa   (rysunek).   Po
czym   struktura   ta   zostaje   pocięta   przez   endonukleazy   i   powstają   dwie
zrekombinowane cząsteczki DNA.

W organizmach bakteryjnych rekombinacja zachodzi na trzy sposoby:

koniugacja

transformacja

transdukcja

Koniugacja

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

9 z 21

2010-04-04 13:29

Koniugacja   u   bakterii   jest   to   proces   transferu   genetycznego   zachodzący   podczas
kontaktu dwóch komórek. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid
lub fragment chromosomu, który jest transferowany dzięki plazmidowi. W koniugacji
jedna   z   komórek   tzw.   donor   przekazuje   informację   genetyczną   komórce   biorcy.
Komórka  dawcy  posiada specyficzną strukturę powierzchniową tzw. pilus płciowy,
który pozwala na kontakt pomiędzy komórkami. Natomiast komórka biorcy posiada
na swej powierzchni specyficzne receptory dla pilusa płciowego. Znane są dwa typy
dawców:

F+ plazmid w tej komórce funkcjonuje jak typowy plazmid i tylko on jest
przenoszony w procesie koniugacji

Hfr plazmid jest wintegrowany w chromosom dawcy i umożliwia on
przekazanie DNA chromosomalnego podczas koniugacji.

Gdy komórki koniugujące już się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i
zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA
w obu komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia
zachowanie pełnej informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału
genetycznego zachodzi sekwencyjnie zaczynając od określonego miejsca w
chromosomie dawcy.

Transfer DNA z F

do F

Podczas koniugacji musi zajść synteza DNA. Odbywa się to według modelu
obracającego się koła. Koliste DNA plazmidowe zostaje nacięte i jedna nić
rodzicielska jest przekazywana do komórki biorcy.

Koniugacja pomiędzy komórkami typu F

i F

, zachodzi podobnie do modelu

replikacji   obracającego   się   koła.   Gdy   dojdzie   do   kontaktu   pomiędzy   dwiema
komórkami,   zostaje   nacięte   DNA   plazmidowe   i   jedna   nić   jest   przekazywana   do
komórki  biorcy.   Synteza   DNA  według  modelu   obracającego   się   koła   odbudowuje
drugą nić DNA u dawcy. Podobnie komplementarna nić jest tworzona u biorcy.

Obecność plazmidu F w komórce powoduje różne zmiany:

komórka ma zdolność do syntezy pilii płciowych

istnieje możliwość przeniesienia fragmentów DNA do innej komórki

zmiana receptorów komórkowych uniemożliwiająca pobieranie kolejnych
plazmidów

Plazmid może być wintegrowany w chromosom w konkretnych miejscach, które
charakteryzują się homologią DNA komórkowego do plazmidowego. Po
wintegrowaniu plazmidu mamy do czynienia z komórką typu Hfr (high frequency of

recombination), która nie może w koniugacji przekształcić komórki F

w F

lub Hfr,

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

10 z 21

2010-04-04 13:29

ponieważ bardzo rzadko zachodzi w takich sytuacjach transfer całego plazmidu.

Szczegółowe wyjaśnienie procesu na rysunkach

W procesie koniugacji przerywanej przeprowadzanym doświadczalnie możliwe jest
zmapowanie ułożenia genów na chromosomie.

Transdukcja

W procesie transdukcji DNA między bakteriami jest przekazywane przy udziale
bakteriofagów. Wyróżniamy dwa typy transdukcji: ogólną i ograniczoną.

Transdukcja ogólna polega na przeniesieniu przez faga dowolnych genów
zlokalizowanych w przypadkowym miejscu w genomie bakterii do komórki biorcy, z
niską efektywnością.

Transdukcja ograniczona występuje tylko w przypadku fagów łagodnych i polega na
tym, że fag wintegrowuje się w specyficzne  miejsce w genomie bakterii, następnie
jako profag jest replikowany wraz z genomem komórki gospodarza. Potem zachodzi
proces   uwolnienia   profaga,   który   może   być   na   tyle   nieprecyzyjny,   że   spowoduje
wycięcie profaga wraz z pobliskim fragmentem chromosomu. Kolejnym etapem jest
liza   komórki   i   uwolnienie   cząsteczek   fagowych   z   konkretnymi   fragmentami
chromosomów. FIG 7 16 7 17

Transformacja

Transformacja jest to proces pobierania przez komórki bakteryjne  wolnego DNA z
podłoża   lub   uwolnionego   przez   inne   bakterie.   Niektóre   komórki   mają   naturalną
zdolność do przeprowadzania tego procesu dzięki specyficznym systemom w błonie,
ułatwiającym   pobranie   DNA.   Są   to   tzw.   bakterie   kompetentne.   W   inżynierii
genetycznej   stosuje   się   różne   metody   umożliwiające   również   innym   bakteriom
przeprowadzenie   transformacji.   Podczas   pojedynczej  transformacji  może   dojść   do
pobrania   niewielkiej  ilości  DNA,   która   jednak   wydatnie   rośnie   przy   zastosowaniu
bakterii kompetentnych.

WIRUSY

Wirus jest to element genetyczny nie posiadający organizacji komórkowej. Może on
istnieć pozakomórkowo, jednak wtedy nie zachodzą w nim żadne przemiany
metaboliczne. Pozakomórkowa forma wirusa,

wirion, jest cząsteczką zawierającą

kwas nukleinowy, otoczoną przez białka i niekiedy posiadającą pewne inne
komponenty makrocząsteczkowe.

Replikacja wirusa odbywa się dopiero po wprowadzeniu jego materiału genetycznego
do komórki. Gdy wirus znajdzie się w komórce rozpoczyna się jego reprodukcja.
Proces ten związany jest z infekowaniem komórki gospodarza.

W związku z małą wielkością wirus zawiera jedynie bardzo podstawowe informacje
dotyczące jego genomu, regulacji reprodukcji oraz budowy otoczki białkowej. Wobec
tego podczas procesu reprodukcji jest on w dużym stopniu zależny od metabolicznych

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

11 z 21

2010-04-04 13:29

i strukturalnych cech gospodarza, dostosowując je w pewnym stopniu do swoich
potrzeb.

Wirus zdolny jest do wprowadzania dziedzicznych zmian w genomie gospodarza.
Zmiany te mogą mieć charakter korzystny lub destruktywny dla gospordarza.

Wirusy można sklasyfikować w oparciu o organizację posiadanego przez nie
materiału genetycznego. Materiał genetyczny wirusów może występować w kilku
formach: DNA jedno- lub dwuniciowe, RNA jedno- lub dwuniciowe oraz zarówno
DNA jak i RNA lecz na różnym etapie istnienia wirionu.

Poza tym dokonuje się podziału na grupy w zależności od rodzaju infekowanego
gospodarza: wirusy roślinne, zwierzęce i bakteryjne.

WIRIOY

Wiriony cechuje zarówno różnorodność kształtu jak i wielkości. Są one znacznie
mniejsze niż komórki (około 28 - 200 nm) a ponadto mają dużo mniejsze genomy (
największe około 200kbp).

Kwas nukleinowy znajduje się wewnątrz cząsteczki wirionu i otoczony jest przez
białkowy "płaszcz" zwany kapsydem, precyzyjnie uformowany z kilku podjednostek
białkowych tzw. kapsomerów. Informacja dotycząca formy kapsydu zawarta jest w
strukturze kapsomerów, a tworzenie otoczki zachodzi na zasadzie samoskładania,
często z udziałem chaperonów.

Kompleks otoczki z kwasem nukleinowym zwany nukleokapsydem, często jest
dodatkowo otoczony dwuwarstwową błoną lipidową zawierającą glikoproteiny
pochodzenia wirusowego oraz lipidy pochodzące z błony komórki gospodarza. Błona
wirusa jest pierwszym elementem wchodzącym w interakcje z komórką gospodarza i
jej pochodzenie wpływa na sposób infekcji oraz penetracji wirusa wewnątrz komórki.

Wewnątrz wirionu mogą znajdować się specyficzne enzymy odgrywające pewną rolę
w   procesie   infekowania   komórki   gospodarza.   Wiele   wirusów   zawiera   własne
polimerazy,   natomiast   retrowirusy   posiadają   odwrotne   transkryptazy.   Ponadto   w
wirusach   występują   neuroaminidazy,   które   rozrywając   wiązania   glikozydowe
glikoprotein   i  glikolipidów   ułatwiają   wirusom  penetrację   tkanek   zwierzęcych   oraz
lizozym,   który   umożliwia   wniknięcie   wirusów   bakteryjnych   do   komórki   oraz
powoduje jej lizę.

Wirusy posiadają pewną symetrię budowy. Symetria wirusów odnosi się do
nukleokapsydu a nie do całego wirusa z błoną.

Wyróżniamy dwa podstawowe typy symetrii:

helikoidalna, gdy podjednostki białkowe są ułożone w heliks, którego długość
zależy od długości kwasu nukleinowego a szerokość od wielkości i upakowania
podjednostek. Przykładem jest tu wirus RNA mozaiki tytoniowej TMV

izometryczna (bryłowa) gdy mamy do czynienia z ikosaedrami czyli

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

12 z 21

2010-04-04 13:29

dwudziestościanami

ZASADY REPRODUKCJI WIRUSA

Podstawowym problemem jaki wirus napotyka na swej drodze w namnażaniu jest
wzbudzenie komórki gospodarza do produkcji elementów niezbędnych do
wytworzenia następnych cząsteczek wirusa.

Pierwszym etapem w tym procesie jest przyłączenie się lub też adsorpcja wirionu na
podatnej komórce gospodarza. Następnie zachodzi penetracja, która polega na
iniekcji wirionu lub jego kwasu nukleinowego do wnętrza komórki.

Początkowa faza replikacji polega na przystosowaniu maszynerii biosyntetycznej
komórki gospodarza do syntezy kwasu nukleinowego wirusa. Produkowane są
enzymy wirusowe.

Kolejnym etapem jest replikacja kwasu nukleinowego wirusa, a następnie synteza
podjednostek białkowych otoczki i ich składanie oraz upakowanie kwasu
nukleinowego w nowe cząsteczki wirusa i uwolnienie ich z komórki.

W genomie wirusa kodowane są niektóre enzymy niezbędne do jego replikacji jednak
reszta czyli: systemy zapewniające energię, rybosomy,

tRNA

(z pewnymi wyjątkami)

oraz enzymy aktywujące

aminokwasy

są dostarczane przez komórkę gospodarza.

FIG 6-9 p 194.

(Powyżej opisany proces dotyczy wirusów bakteryjnych).

PRZYŁĄCZEIE

Pierwszy   etap   replikacji  wirusa   charakteryzuje   się   dużą   specyficznością   interakcji
pomiędzy wirusem a gospodarzem. Cząsteczka wirusa posiada na swojej powierzchni
białka, które oddziałują ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na komórce
zwanymi receptorami. Zwykle  pełnią  one  w komórce  normalne  funkcje  np. białka
transportowe   czy   białka   otoczki   bakteryjnej   lub   w   przypadku   grypy   jest   to
glikoproteina na erytrocytach.

Jeśli receptor nie występuje lub jest zmieniony, wirus nie może adsorbować i infekcja
nie zajdzie - gospodarz staje się odporny na wirusa, oczywiście dopóki w wirusie nie
zajdzie mutacja umożliwiająca mu adsorpcję do zmutowanego receptora.

Przyłączanie się wirusa może zachodzić również na niespecyficznej drodze poprzez
fagocytozę lub inne procesy endocytozy (powszechne wśród wirusów zwierzęcych i
roślinnych).

PEETRACJA

Proces penetracji wirusa do wewnątrz komórki gospodarza zależny jest od charakteru
tej komórki, szczególnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja
zachodzi inaczej w komórkach zwierzęcych pozbawionych ściany komórkowej niż w
roślinnych i bakteryjnych.

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

13 z 21

2010-04-04 13:29

Przykładem  skomplikowanego   mechanizmu   penetracji  jest   infekcja   komórki  E.coli
bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada  strukturę  głowową, osadzoną  na
ogonku, który  kończy  się zestawem włókien ogonowych. Włókna te jako pierwsze
przyłączają się do powierzchni komórki a następnie obkurczają co powoduje zbliżenie
się rdzenia ogonka do powierzchni komórki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu
powoduje powstanie niewielkiego otworu w ścianie komórkowej, przez który wnika
DNA wirusowe.

Na   tym   etapie   istnieje   jeszcze   możliwość   usunięcia   kwasu   nukleinowego   wirusa
poprzez   działanie   enzymów   restrykcyjnych   znajdujących   się   na   terenie   komórki.
Jednakże wirusy "nauczyły się" przeciwdziałać temu procesowi; modyfikując kwasy
nukleinowe   w   podobny   sposób   jak   komórki   gospodarza   lub   hamując   działanie
systemów restrykcyjnych przez specyficzne białka.

WIRUSOWE

mRA

W celu powstania nowych białek wirusowych muszą zostać utworzone specyficzne

mRNA

. Synteza

mRNA

wirusowego zależy od typu wirusa i jego materiału

genetycznego. FIG6.12 p196.

W przypadku gdy informację genetyczną wirusa stanowi RNA możliwe jest kilka
rozwiązań dla produkcji

mRNA

. Gdy mamy do czynienia z wirusem zawierającym

jednoniciowe RNA pozytywne (+), oznacza to, że służy ono bezpośrednio jako

mRNA

. W tym RNA kodowana jest między innymi polimeraza RNA specyficzna dla

wirusa. Polimeraza ta początkowo powoduje powstanie negatywnej nici
komplementarnej, która następnie służy jako matryca do wytworzania większej ilości
nici pozytywnych.

Jeśli   natomiast   wyjściowym   materiałem   genetycznym   jest   jednoniciowe   RNA
negatywne (-) lub dwuniciowe RNA sytuacja  się nieco komplikuje, gdyż nie  może
ono   pełnić   bezpośrednio   funkcji

mRNA

. Aby powstało

mRNA

konieczna jest

RNA-zależna polimeraza RNA, która występuje w wirusach i prowadzi do syntezy

mRNA

Retrowirusy (wirusy RNA) replikują się dzięki pośrednictwu DNA. Proces
kopiowania informacji genetycznej z RNA na DNA jest to odwrotna transkrypcja i
zachodzi on pod wpływem enzymu tzw. odwrotnej transkryptazy. Po zainfekowaniu
komórki, RNA wirionu kopiowane jest na dwuniciowe DNA (dsDNA) z przejściem
przez etap ssDNA. Następnie dsDNA służy jako matryca do syntezy

mRNA

BIAŁKA WIRUSOWE

Gdy mamy już

mRNA

możliwa jest synteza białek wirusowych. Białka te należą do

trzech głównych grup:

wczesne białka o charakterze enzymatycznym, niezbędne do replikacji kwasu
nukleinowego wirusa, syntetyzowane w niewielkich ilościach

późne białka czyli m.in. białka płaszcza wirusowego, białka strukturalne,

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

14 z 21

2010-04-04 13:29

syntetyzowane w dużych ilościach

białka lityczne, które umożliwiają otworzenie komórki gospodarza i uwolnienie
cząsteczek wirusa.

WIRUSY BAKTERYJE

Istnieje ogromna liczba wirusów bakteryjnych, wiele z nich ma skomplikowaną
strukturę, tylko niektóre posiadają lipidową otoczkę. Większość badanych wirusów
atakuje E.coli lub Salmonella typhimurium.

Bakteriofagi RA

Najlepiej   poznane   bakteriofagi   RN-owe   zawierają   jednoniciowe   RNA.   U
Enterobacteriaceae bakteriofagi infekują tylko komórki odgrywające rolę donorów w
procesie   rekombinacji   genetycznej   co   związane   jest   z   występowaniem   na   tych
komórkach   specyficznech   pili,   będących   jednocześnie   receptorami  dla   cząsteczek
tych wirusów.

Bakteriofagi te, są niewielkie (ok. 26 nm) i mają symetrię ikosaedralną. Niektóre
genomy tych bakteriofagów zostały już poznane np. MS2 ma genom o długości 3569
nukleotydów, nić RNA (+), która działa bezpośrednio jako

mRNA

. W komórce

gospodarza

mRNA

wchodzi do rybosomu i produkowane są cztery typy białek;

dojrzałości, odpowiedzialne za lizę, strukturalne do budowy  płaszcza oraz replikaza
RNA   (kombinacja   polipeptydów   wirusa   i   gospodarza).   Ciekawostką   jest,   że   gen
białka odpowiedzialnego za lizę komórki gospodarza nachodzi zarówno na gen białka
płaszczowego   jak   i   na   gen   replikazy,   co   w   rezultacie   powoduje,   że   rozpoczęcie
translacji tego genu jest niemożliwe dopóki nie powstanie odpowiednia ilość białka
płaszczowego.

Ikosaedralne bakteriofagi ssDA

Bakteriofagi ssDNA mają genom w formie zamkniętego koła o średnicy ok. 25 nm,
płaszcz zbudowany z pojedynczego białka w 60 kopiach, do którego dołączone są
inne białka tworzące strukturę szpikulcopodobną.

Bakteriofagi   te,   w   przeciwieństwie   do   poprzednich,   podczas   replikacji   korzystają
głównie   z   maszynerii   komórkowej   i   posiadają   we   własnym   genomie   jedynie
podstawowe   informacje   dotyczące   białek   kapsydowych,   szpikulcowych   czy
powodujących lizę komórki bakteryjnej.

Najpowszechniej badany wirus z tej grupy to f X174, atakujący E.coli, w którym po
raz pierwszy odkryto geny nachodzące na siebie (ang. overlapping genes). Geny te
stanowią rozwiązanie problemu małej ilości DNA kodującego, pozwalając na bardziej
efektywne wykorzystanie informacji genetycznej, ale jednocześnie stwarzają
niebezpieczeństwo, że jedna mutacja może wpłynąć na dwa geny.

FIG 6.17

Replikacja tego wirusa zachodzi według modelu obracającego się koła (rolling circle

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

15 z 21

2010-04-04 13:29

replication). Najpierw jednak dochodzi do powstania RF, czyli replikacyjnej formy
DNA. Jest to superzwinięte dsDNA, które powstaje wskutek działania komórkowych
enzymów na ssDNA wirusa.

Następne RF tworzone są w konwencjonalny sposób poprzez semikonserwatywną
replikację z pośrednimi formami theta, ale utworzenie genomu ssDNA zachodzi
według wspomnianego wyżej modelu. FIG 6-18.

Jedna nić zostaje przerwana i koniec 3' używany jest do rozpoczęcia syntezy nowej
nici. Synteza ta jest asymetryczna ponieważ tylko jedna z nici jest matrycą. Gdy
zostanie osiągnięta odpowiednia długość odpowiedni enzym przecina i łączy dwa
końce nowej nici.

Bakteriofagi dsDA

Wiele wirusów zawiera materiał genetyczny w postaci podwójnej nici DNA (dsDNA).
Były to pierwsze odkryte wirusy bakteryjne i są one bardzo intensywnie badane.

Bakteriofag T7 jest wirusem atakującym E.coli, posiada ikosaedralną główkę i mały
ogonek. Jego genom został zsekwencjonowany i zbadany. Okazało się, że część
genów nachodzi na siebie i ich kolejność wpływa na regulację powielania wirusa.

DNA wirusowe wchodzi liniowo do komórki gospodarza, zaczynając od lewego
końca i następuje natychmiastowa transkrypcja kilku genów na tym końcu dzięki
komórkowej RNA polimerazie.

Powstają nachodzące na siebie policystroniczne

mRNA

, które zostają przecięte przez

komórkową Rnazę, dając mniejsze

mRNA

kodujące: białka hamujące system

restrykcyjny gospodarza oraz wirusową RNA polimerazę, a także białka hamujące
RNA polimerazę komórki gospodarza.

Gdy   zostaje   zahamowana   polimeraza   komórki   bakteryjnej   (kontrola   negatywna),
zakończona   jest   transkrypcja   wczesnych   genów  T7.   Natomiast   fagowa   polimeraza
rozpoznaje tylko pozostałe promotory  na genomie T7 prowadząc do syntezy  reszty
białek faga.

Replikacja DNA zaczyna się w ori skąd odbywa się w obu kierunkach jednocześnie,
przy zastosowaniu dwóch typów primerów RNA ; w lewo primer syntetyzowany
przez primazę T7, w prawo syntetyzowany przez T7 RNA polimerazę. Oba primery
podlegają wydłużaniu przez fagową polimerazę DNA. FIG6.21

Wirus T7 posiada pewną cechę strukturalną tzw. dtr (direct terminal repeat o długości
ok.160bp,   na   5'   końcach   cząsteczki)   przydatną   podczas   replikacji.   W   celu
zakończenia replikacji na 5' końcu DNA primery RNA muszą zostać usunięte. Na obu
końcach   DNA   faga   T7   zostają   pewne   fragmenty,   które   nie   uległy   replikacji.   T7
"rozwiązuje"   ten   problem   przy   użyciu   wspominanych   już   sekwencji   dtr.   Na   obu
niciach  3'  DNA  znajdują  się   sekwencje   komplementarne   do  dtr   i  łączą  się   z  nimi
tworząc   cząsteczkę   o   podwojonej   długości   w   porównaniu   do   normalnego   T7.
Niezreplikowane   do   tej  pory   fragmenty   DNA  zostają   uzupełnione   dzięki  działaniu
polimerazy i ligazy DNA co prowadzi do utworzenia tzw. konkatameru. Konkatamer
zostaje pocięty na cząsteczki o długości odpowiadającej wirusowi T7 przez specjalny
enzym.

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

16 z 21

2010-04-04 13:29

Duże bakteriofagi dsDA

Największe i najbardziej skomplikowane fagi zarówno pod względem struktury jak i
replikacji należą do tzw. grupy fagów T-parzystych.

Przykładowym fagiem z tej grupy  jest  T4, mający  ikosaedralną  główkę  wydłużoną
przez  dodatkowe   białka   oraz  zróżnicowany   strukturalnie   ogonek.   W   genomie   T4
znajduje   się   nietypowy   nukleotyd   5-hydroksymetylocytozyna   (dodatkowo
glukozylowany)   zamiast   cytozyny,   który   powoduje   że   dane   DNA  jest   odporne   na
restrykcyjne endonukleazy bakteryjne. DNA T4 występuje w formie liniowej jednak
jego mapa genetyczna przedstawiana jest w formie kołowej.

Proces   replikacji   DNA   T4   jest   podobny   do   T7   jednakże   enzym   tnący   DNA   na
jednakowe   fragmenty   liniowe   nie   jest   specyficzny   do   sekwencji   co   powoduje
powstawanie   zróżnicowanych   końcow   cząsteczki   i   nieco   dłuższych   genomów
wirusowych.

Geny   fagaT4   kodują   dwie   podstawowe   grupy   białek;   wczesne,   czyli   enzymy
zaangażowane w proces replikacji i transkrypcji, oraz późne czyli białka strukturalne
główki i ogonka, a  także  enzymy  uwalniające  faga  z komórki. Fag T4 korzysta  w
trakcie syntezy z polimerazy RNA występującej w komórce bakteryjnej. Formowanie
główki i ogonka zachodzi niezależnie, DNA zostaje upakowane w główce nastepnie
przyłącza   się   ogonek   i   fag   gotowy   jest   do   opuszczenia   komórki.   Liza   ściany
komórkowej bakterii zachodzi pod wpływem lizozymu, który atakuje peptydoglikany
komórkowe. Cały proces może trwać około 25 minut.fig6.24

Wirusy łagodne

Większość   wirusów  bakteryjnych   przechodzi  cykl  lityczny   prowadzący   do   zabicia
komórki bakteryjnej. Jednakże jest wiele wirusów, które pomimo możliwości zabicia
komórki wybierają drogę lizogeniczną czyli łagodną kiedy to większość genów faga
nie   ulega   ekspresjii   a   genom   fagowy   wbudowany   do   bakteryjnego   ulega
synchronicznej   replikacji   i   wraz   z   podziałami   komórkowymi   jest   przekazywany
następnym pokoleniom bakterii. FIG 6.25 koniecznie Bakteria zainfekowana wirusem
w łagodnej postaci jest odporna na następne ataki nowych cząsteczek tego wirusa.

Wirusy   łagodne   istnieją   w   komórkach   zazwyczaj   w   formie   zwanej   prowirusem.
Prowirus   posiada   taką   samą   informację   genetyczną   jak   wirus.   Jednak   jest   ona
zablokowana przez specjalny fagowy represor i nie ulega ekspresji. Ta sytuacja może
ulec   zmianie   pod   wpływem   specyficznych   czynników   (np.UV,   promieniowanieX)
powodujących inaktywację represora - indukcja lizogeniczna.

Wirus łagodny może istnieć w dwóch formach zależnych od warunków. Czasem jako
niezależna jednostka, kontrolująca swoją replikację (cykl lityczny), lub jako DNA
wintegrowane w materiał genetyczny komórki gospodarza (cykl łagodny -
lizogeniczny).

Najlepiej poznanym wirusem łagodnym jest lambda atakująca E.coli, zawiera on
dsDNA w formie liniowej z 12-nukleotydowymi jednoniciowymi, komplementarnymi
ogonami na 5' końcach, które łączą sie formując dwuniciową kolistą cząsteczkę.

Genom faga lambda zawiera dwa zestawy genów; jeden - kontrolujący cykl lityczny,
drugi - lizogeniczny. Podczas infekcji dochodzi do zapoczątkowania ekspresji genów
obu cykli. Fag lambda zawiera kilka operonów.

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

17 z 21

2010-04-04 13:29

Po   wprowadzeniu   wirusa   do   komórki   zapoczątkowana   zostaje   transkrypcja   jego
genów.   Produktem   genu   cI   jest   białko   cI   będące   represorem   transkrypcji   genów
zaangażowanych   w   cykl   lityczny.   Jeśli  represor   zgromadzi   się   w   komórce   zanim
ulegną ekspresji geny lityczne to zahamuje on cykl lityczny.

Powodem dla którego liza nie zawsze zostaje zahamowana jest istnienie białka Cro
będącego produktem genu cro. Kluczem do zrozumienia tego procesu jest położenie
genów kodujących te dwa białka. Te dwa geny leżą blisko siebie, są transkrybowane
w przeciwnych kierunkach a pomiędzy nimi znajdują się promotory i operatory do
których mogą się wiązać produkty obu genów. Gdy represor lambda jest związany ze
swoim operatorem, zasłania on promotor cro. Natomiast gdy białko Cro jest związane
ze swoim operatorem zasłania ono jeden z promotorów dla cI.

W cyklu lizogenicznym następuje ciągła ekspresja genu cI. Produkt czyli represor
wiąże się z dwoma operatorami na DNA i wyłącza transkrypcję reszty genów faga
lambda (kontrola negatywna), jednocześnie indukuje syntezę samego siebie (kontrola
pozytywna). W ten sposób represor zapewnia zahamowanie ekspresji innych genów
koniecznych do wzrostu i reprodukcji faga.

W komórce lizogenicznej powielenie faga może zajść tylko w przypadku inaktywacji
represora, co jest możliwe przy zastosowaniu czynników niszczących DNA. Jednym z
rezultatów   działania   takich   czynników   jest   zmiana   białka   RecA   (   w   normalnych
warunkach   biorącego   udział w  rekombinacji  genetycznej)   w specyficzną   proteazę,
która   bierze   udział   w   zniszczeniu   represora.   W   momencie   gdy   represor   jest
zdezaktywowany, może już zachodzić transkrypcja pozostałych genów faga lambda
do tej pory zablokowanych, co w rezultacie prowadzi do lizy komórki.

FIG 6.25, 27

DNA faga lambda integruje w chromosom gospodarza w postaci kolistej w
specyficznym miejscu na chromosomie tzw.att (bacterial attachment sites) dzięki
enzymowi integrazie (kodowanym przez fagowy gen int).

Podczas   wzrostu   komórki   system   represji   faga   lambda   uniemożliwia   zajście   lizy
komórki,   natomiast   w   trakcie   replikacji   DNA   gospodarza   zachodzi   równoczesna
replikacja   DNA   faga   i   w   komórce   potomnej   dochodzi   do   uruchomienia   cyklu
produktywnego.

Fag lambda  używany  jest  jako wektor w inżynierii genetycznej, do konstruowania
hybryd DNA  z enzymami restrykcyjnymi.  Fag lambda   zawiera  długi region  DNA,
który   dzięki  temu,   że   nie   pełnie   żadnych   istotnych   funkcji w  replikacji  może   być
zastępowany obcym DNA.

Bakteriofag Mu

Bakteriofag  Mu   jest   jednym  z  bardziej  interesujących   fagów   ze   względu   na   jego
możliwość   replikacji  jako   ruchomego   elementu   genetycznego.   Mu   jest   wyjątkowo
mutagenny,   ponieważ   może   integrować   w   środku   genu   komórki   gospodarza
inaktywując go, ponadto ma zdolność do przemieszczania się w genomie.

WIRUSY ZWIERZĘCE

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

18 z 21

2010-04-04 13:29

Wirusy zwierzęce posiadają materiał geneyczny zarówno w formie RNA jak i DNA.
Jedną z ważniejszych grup wirusów zwierzęcych są retrowirusy, gdyż powodują one
choroby bardzo groźne dla człowieka (AIDS). Wirusy dzieli się na różne grupy w
zależności od typu kwasu nukleinowego, obecności otoczki i niekiedy według
stosowanego modelu replikacyjnego.

FIG6.35

Wirusowa   infekcja   komórki   zwierzęcej   może   mieć   rożne   efekty.   Wirus   może
spowodować   rozpadnięcie   się   komórki,   trwałą   infekcję   z  powolnym   uwalnianiem
cząsteczek wirusa lub infekcję utajoną kiedy to symptomy pojawiają się ze znacznym
opóźnieniem   w   stosunku   do   czasu   infekcji.   Ponadto   wirusy   mogą   powodować
powstawanie nowotworów.

FIG6.36

Wirusy zwierzęce RA (+)

Do tej grupy wirusów należą: wirus polio, hepatitis A, wirusy przeziębieniowe. W
małych wirusach RNA takich jak polio, RNA działa bezpośrednio jako pojedyncze

mRNA

korzystając z translacyjnej maszynerii komórkowej produkuje pojedynczą

długą poliproteinę, która następnie zostaje pocięta na liczne małe białka niezbędne w
procesie powielania kwasu nukleinowego (polimeraza RNA) oraz powstania nowej
cząsteczki wirusa (np. białka strukturalne). Synteza białek komórkowych zostaje
zahamowana.

Wirusy zwierzęce RA (-)

W tych wirusach RNA nie odgrywa bezpośrednio roli

mRNA

. Najpierw jest ono

kopiowane przez RNA-zależną polimerazę RNA pochodzenia wirusowego dzięki
czemu powstaje

mRNA

następnie wykorzystywane do syntezy białek wirusowych,

które prowadzą do replikacji genomu wirusowego i powstania nowych cząsteczek
wirusa. FIG6.39

Przykładem wirusa tego typu jest ludzki wirus grypy, ponadto rhabdowirusy.

Wirusy zwierzęce dsDA

Wśród wirusów DN-owych można wyróżnić cztery główne rodziny; papovawirusy,
wirusy herpes, pox i adenowirusy. Spośród nich wszystkie poza wirusami pox
przechodzą replikację w jądrze komórkowym, natomiast pox nietypowo powiela się w
cytoplazmie.

Niektóre wirusy z grupy

papovawirusów mają zdolność do indukowania

transformacji   nowotworowej   komórek   gospodarza.   Gdy   wirus   tego   typu   infekuje
komórkę, mogą zajść  dwa  typy  replikacji w zależności od komórki. W komórkach
pierwszego   typu   infekcja   wirusa   polega   na   tworzeniu   nowych   wirionów   i   lizie
komórki   gospodarza.   W   drugim   typie   komórek   nie   dochodzi   do   wielokrotnego

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

19 z 21

2010-04-04 13:29

powielenia  wirionu, lecz DNA wirusowe  integruje  w genomie  niektórych komórek
prowadząc   do   genetycznej  modyfikacji,   która   w  konsekwencji  może   spowodować
transformację komórki i brak zahamowania jej wzrostu. Przykładem takiego wirusa
jest   SV40   posiadający   zdolność   do   indukowania   nowotworów   w   komórkach
zwierzęcych FIG.6.44

Wirusy herpes są dużą grupą dsDNA wirusów powodujących wiele chorób u zwierząt
i człowieka (np. ospę wietrzną), mają zdolność do pozostawania w formie utajonej w
komórkach gospodarza, niektóre mogą prowadzić do transformacji nowotworowej
(np.wirus Epsteina-Barra).

Najbardziej skomplikowane i największe wirusy zwierzęce należą do grupy wirusów
pox.   Unikatową   wlaściwością   tych   wirusów   jest   zdolność   do   przeprowadzania
replikacji DNA na terenie cytoplazmy komórki gospodarza. Do tej grupy należy wirus
ospy,   który   jako   pierwszy   został   szczegółowo   zbadany,   oraz   wirus   krowianki
(cowpox),   który   powoduje   bardzo   łagodną   i   niegroźną   infekcję   w   komórkach
ludzkich. Wirus krowianki służy jako szczepionka przeciw ospie oraz jest używany w
eksperymentach   genetycznych   do   wprowadzania   obcych   genów   do   komórek
zwierzęcych i ludzkich.

Adenowirusy zostały po raz pierwszy wyizolowane z migdałków, powodują one
łagodne infekcje dróg oddechowych i występują często w zdrowych osobnikach.

Retrowirusy

Jedną z najbardziej skomplikowanych i niewątpliwie najciekawszych grup wirusów
zwierzęcych są retrowirusy. Przyczyn, dla których znajdują się one w centrum
zainteresowania jest wiele.

Po pierwsze, to one zostały początkowo zidentyfikowane jako czynniki indukujące
powstawanie nowotworów. Po drugie, jeden z retrowirusów jest przyczyną jednej z
najgroźniejszych i najbardziej kontrowersyjnych współcześnie chorób czyli AIDS.

Ponadto mogą one specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez
pośrednicze DNA. Proces ten jest badany pod kątem wprowadzania obcych genów
do komórek w terapii genowej.

Poza tym retrowirusy posiadają enzym - odwrotną transkryptazę, która stosując RNA
jako   matrycę   kopiuje   informacje   genetyczną   z   RNA   na   DNA.   Enzym   ten   jest
powszechnie   stosowany   w   inżynierii   genetycznej.   Należy   tutaj   zaznaczyć,   że
odwrotna   transkryptaza   nie   jest   "narzędziem"   zarezerwowanym   wyłącznie   dla
retrowirusów - posiadają ją także retrotranspozony u Eukaryota czy E.coli.

Retrowirusy posiadają otoczkę o nieokreślonej symetrii. Genom retrowirusów ma
bardzo nietypową budowę. Składa się on z dwóch jednakowych pojedynczych nici
RNA (+) , połączonych wiązaniami wodorowymi poprzez parowanie nukleotydów ze
specyficznymi cząsteczkami

tRNA

. 5' koniec RNA posiada cap natomiast 3' koniec

posiada ogon poly(A) wobec czego RNA mogłoby służyć bezpośrednio jako

mRNA

jednak tak się nie dzieje.

Ogólnie proces replikacji retrowirusów zachodzi w kilku etapach. Na początku wirus
dostaje się do komórki, następnie jedna z nici RNA jest odwrotnie transkrybowana w
ssDNA które zostaje przekształcone w liniowe dsDNA przez odwrotną transkryptazę.
Kolejnym etapem jest wintegrowanie powstałego dsDNA retrowirusa w genom

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

20 z 21

2010-04-04 13:29

komórki gospodarza. Potem zachodzi transkrypcja DNA wirusowego,
powstaje

mRNA

i "potomne" wirusowe RNA, które zostaje upakowane w kapsydzie

na terenie cytoplazmy. W końcu nowe cząsteczki wirusa są odpączkowywane z błony
cytoplazmatycznej i uwalniane z komórki. FIG 6.48.49.50.

Pierwszym etapem po wejściu wirusa  do komórki jest  transkrypcja  RNA na  DNA
przy   zastosowaniu   odwrotnej   transkryptazy.   Enzym   ten   wykazuje   kilka   rodzajów
aktywności;   synteza   DNA   z   wykorzystaniem   RNA   jako   matrycy   (odwrotna
transkryptaza),   synteza   DNA   z   wykorzystaniem   DNA   jako   matrycy   (polimeraza
DNA) oraz degradowanie nici RNA w hybrydzie RNA-DNA (rybonukleaza H). Jak
wszystkie polimerazy DNA enzym ten wymaga primeru do syntezy DNA.

W reakcji przeprowadzanej przez odwrotną transkryptazę primerem jest specyficzne

tRNA

komórkowe. Rodzaj użytego

tRNA

jest związany z typem wirusa i pochodzi z

ostatniej komórki gospodarza. Przy użyciu danego

tRNA

jako primeru około 100

nukleotydów RNA z

5'końca jest odwrotnie transkrybowanych na DNA. Gdy transkrypcja dojdzie do 5'
końca, zostaje ona zatrzymana.

W   celu   skopiowania   pozostałej  większości  RNA  stosowany   jest   inny   mechanizm.
Najpierw   usuwane   jest   RNA   już   skopiowane   przez   RT   (reverse   transcriptase   -
odwrotna   transkryptaza)   dzięki   jej   aktywności   rybonukleazowej   co   powoduje
pozostawienie małego odcinka jednoniciowego DNA komplementarnego do 3' końca
RNA. Ten odcinek DNA jest transferowany na drugą stronę nici RNA i hybrydyzuje z
3' końcem i następnie dokończona zostaje synteza DNA(-) na matrycy RNA.

Działanie RT jako rybonukleazy prowadzi do usunięcia RNA z wyjątkiem małego
fragmentu, który zostaje użyty jako primer do syntezy pozytywnej nici DNA.
Ostatecznie zostaje utworzona dsDNA z LTR (long terminal repeats) na obu końcach.

LTR zawierają silne promotory transkrypcji i biorą udział w procesie integracji, który
może zajść w dowolnym punkcie DNA komórkowego. Wintegrowany fragment
wirusa nazywany jest prowirusem i staje się stabilnym elementem genetycznym.
Prowirusowe DNA jest transkrybowane przez komórkową RNA polimerazę w RNA
które zostaje opatrzone ogonem poly(A) i czapeczką cap, a następnie może zostać
upakowane w cząsteczki wirusa lub może ulec translacji w białka wirusowe.

WIROIDY

Wiroidy   są   to   małe,   koliste   cząsteczki   jednoniciowego   RNA.   Wiroidy   są
najmniejszymi  znanymi  patogenami  w   postaci  kwasu   nukleinowego.   Cząsteczki  te
atakują  rośliny  wyższe. Pozakomórkowo występują  one  w postaci "nagiego"  RNA
pozbawionego   nawet   kapsydu.   Wiroidy   nie   zawierają   genów   kodujących   białka
strukturalne i są całkowicie zależne od komórki gospodarza.

Webmaster

This server is running Apache

GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html

21 z 21

2010-04-04 13:29