Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii i enzymologii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
OBLICZENIA BIOCHEMICZNE
Praca w laboratorium biochemicznym wymaga umiejętności obliczania stężeń i rozcieńczeń
odczynników stosowanych do doświadczeń. W podstawowym kursie biochemii nie ma czasu
na przygotowywanie odczynników przez studentów. Trzeba jednak zdawać sobie sprawę z
tego, że ćwiczenia, które Państwo wykonują nie udałyby się, gdyby roztwory nie były
przygotowane w odpowiednich stężeniach. Większość ćwiczeń wymaga ilościowego
przedstawienia wyników. Tak jest w przypadku obliczania ilości produktu powstałego w
wyniku przeprowadzenia reakcji enzymatycznej. Aby móc to zrobić, trzeba znać sposoby
obliczania stężenia substancji na podstawie natężenia barwy powstałego produktu, lub na
podstawie wartości współczynnika pochłaniania światła właściwego dla danego związku
chemicznego. Zanim przystąpimy do eksperymentów nauczmy się obliczać stężenia. Bez tych
umiejętności, praca w laboratorium jest niemożliwa.
Sposoby wyrażania stężeń
Stęż enia procentowe
W pracowni biochemicznej najczęściej mamy do czynienia z roztworami wodnymi, choć
używamy także innych rozpuszczalników. Stężenie roztworu można określić w rozmaity
sposób na przykład w procentach wagowych tj. liczbą gramów substancji rozpuszczonej w
100 gramach roztworu. I tak 37% HCl zawiera 37 g cholorowodoru (gazowego HCl) w 100 g
roztworu (63 g wody). Procentowość roztworu można wyrazić w procentach wagowo-
objętościowych tzn. liczbą gramów substancji rozpuszczonej w 100 mililitrach (ml) roztworu.
Ten sposób wyrażania procentowości roztworów jest rozpowszechniony w biochemii.
Przykład 1. Ile gramów NaCl i ile ml wody potrzeba do sporządzenia 500 g 10% w/w
roztworu oraz 500 ml 10% w/o roztworu.
Rozwiązanie: W 100 g 10% w/w roztworu i w 100 ml 10% w/o roztworu znajduje się 10 g
NaCl, więc w 500 jest 50 g NaCl. Dla sporządzenia 500 g 10% w/w roztworu należy odważyć
50 g NaCl i rozpuścić je w 450 g (ml) wody, a dla sporządzenia 500 ml 10 % w/o roztworu
należy taką samą naważkę rozpuścić w przybliżeniu w 400 ml wody i uzupełnić wodą do 500
ml.
Przykład 2. Przygotować 300 ml 20% w/o roztworu Na2SO4 mając do dyspozycji sól
uwodnioną Na2SO4 · 10 H2O.
Rozwiązanie: Najpierw należy obliczyć potrzebną ilość soli bezwodnej.
100 ml 20% w/o Na2SO4 — 20 g Na2SO4
300 ml 20% w/o Na2SO4 — 60 g Na2SO4
Potem przeliczyć ilość g soli bezwodnej na sól uwodnioną: masa cząsteczkowa Na2SO4
wynosi 142 zaś 322 soli uwodnionej Na2SO4 · 10 H2O
142 g Na2SO4 — 322 g Na2SO4 · 10 H2O.
60 g — x
x = 136 g
Należy odważyć 136 g Na2SO4 · 10 H2O, rozpuścić w około 200 ml wody po czym uzupełnić
objętość do 300 ml.
Stężenie roztworów wyraża się też liczbą moli rozpuszczonej substancji.
Mol (gramocząsteczka) to ilość substancji odpowiadająca jej masie cząsteczkowej, na
przykład dla NaCl wynosi 58 g. Dwa mole NaCl to 116 g. Stężenie molowe (M) określa
liczbę moli w jednym litrze (1000 ml) roztworu, a stężenie molarne – liczbę moli
rozpuszczonych w 1 litrze (1000 ml) rozpuszczalnika. Trzeba pamiętać, że w literaturze
angielskojęzycznej stężenie zapisywane mianem M nosi nazwę molar concentration.
Przykład 3. Sporządzić 100 ml 10-4 M roztworu hemoglobiny (m.cz. 64000).
Rozwiązanie: Gramocząsteczka hemoglobiny wynosi 64000 g czyli 10-4 M wynosi 6.4 g.
1000 ml 10-4 M — 6,4 g Hb
100 ml 10-4 M — 0,64 g Hb
Należy naważkę 0,64 g hemoglobiny rozpuścić w wodzie i uzupełnić nią do 100 ml.
Przykład 4. Sporządzić 0,5 litra 0,25 M roztworu NaOH (m.cz. 40).
Rozwiązanie: Gramocząsteczka wynosi 40 g. Jeśli na 1 litr 1 M NaOH trzeba 40 g zasady, to
na 500 ml 0,25 M trzeba 0,5 · 0,25 · 40 = 5 g. Należy 5 g NaOH rozpuścić np. w 400 ml wody
i uzupełnić nią do 500 ml. Nie wolno obliczać objętości wody z różnicy (500 – 5) i
rozpuszczać 5 g w 495 ml wody.
Przykład 5. Ile gramów siarczanu żelazowego Fe(III) (m. cz. 400) potrzeba do sporządzenia
0.3 litra 0,5 M roztworu?
Rozwiązanie: Gramocząsteczka Fe2(SO4)3 wynosi 400 g, więc potrzebna ilość siarczanu
wynosi 0,3 · 0,5 · 400 = 60 g.
Sporządzanie roztworów z roztworów stężonych kwasów.
Roztwory procentowe
Stężenie stężonych roztworów kwasów jest zawsze wyrażone w procentach wagowych (w/w).
Chcąc przyrządzić z nich roztwór procentowy wagowo-objętościowy (w/o) przez
rozcieńczenie wodą należy uprzednio przeliczyć % w/w stężonego roztworu na % wagowo-
objętościowy. 100 ml (cm3 ) stężonego H2SO4 waży 1,84 g/cm3 · 100 = 184 g. W tych 184 g
jest 96% czystego kwasu czyli 184 · 0,96 =176,6 g. Czyli stężenie procentowe w/o stężonego
H2SO4 wynosi 176,6%. W praktyce zamiast najpierw mnożyć przez 100, a potem dzielić
przez 100 (bo mnożymy przez ułamek dziesiętny 0,96), wystarczy pomnożyć % w/w przez
gęstość stężonego kwasu (1,84 g/cm3).
Przykład 6. Mamy sporządzić 400 ml 15% w/o roztworu H2SO4 ze stężonego roztworu
kwasu siarkowego o gęstości d = 1,84 g/cm3 i stężeniu 96% (oczywiście w/w).
Rozwiązanie: Musimy 96% w/w pomnożyć przez 1,84 co równa się 176,6. Przy wszystkich
rodzajach rozcieńczeń stężonych roztworów wodą można wyjść z zależności, że iloczyn
stężenia roztworu (%, M,) i jego ilości (g, ml, l) jest wielkością stałą, czyli: cA· vA = cB · vB.
W tym przypadku: %A · VA = %B · VB
czyli 15% · 400 ml = 176,6% · B ml. Obliczone B wynosi: 6000 : 176,6 = 34 ml
34 ml stężonego kwasu siarkowego trzeba do sporządzenia 400 ml 15% w/o roztworu. Ze
względu na zjawisko kontrakcji trzeba obliczyć potrzebną ilość wody z różnicy. Należy wziąć
366 ml wody i dodać 34 ml stężonego kwasu siarkowego.
Przykład 7. Rozcieńczyć 50 ml stężonego roztworu HCl (37%, (d = 1,19 g/cm3) dla
uzyskania 20% w/o roztworu.
Rozwiązanie: Trzeba przeliczyć procent w/w na procent w/o, czyli 37 · 1,19 = 44% w/o.
Następnie 44% · 50 ml = 20 · y ml z czego obliczyć y = 2200 : 20 = 110
Należy 50 ml stężonego roztworu HCl uzupełnić wodą do 110 ml.
Roztwory molowe
Przykład 8. Ile ml stężonego roztworu H2SO4 (96%, d = 1,84 g/cm3) potrzeba do
sporządzenia 1 litra 1 M roztworu.
Rozwiązanie: Musimy najpierw obliczyć ile czystego kwasu znajduje się w 1ml stężonego
kwasu siarkowego: 1, 84 — 100%
x — 96%
1,84 · 96 = 176,64 176,4 : 100 = 1,764
Następnie trzeba obliczyć ilość ml stężonego kwasu siarkowego, w której znajduje się
potrzebna ilość gramów czystego H2SO4. Masa cząsteczkowa H2SO4 wynosi 98 czyli 1 litr
1 M roztworu zawiera 98 g czystego kwasu. Jeśli w 1ml stężonego kwasu jest 1,764 g
czystego H2SO4 to 98 g znajduje się w 98 : 1,764 = 55,55 ml stężonego kwasu siarkowego.
Przeliczanie stęż enia procentowego na molowe
Przykład 9. Jaka jest molowość 96% w/w roztworu H2SO4 o gęstości 1,84 g/cm3. Masa
cząsteczkowa kwasu wynosi 98.
Rozwiązanie: Obliczyć liczbę g H2SO4 w 1000 ml roztworu czyli w 1840 g. Jeśli 100 g 96%
w/w H2SO4 zawiera 96 g H2SO4 to 1840 g zawiera 1766 g. Po podzieleniu tej wartości przez
98 g (gramocząsteczkę) obliczamy molowość roztworu, która wyniesie 18 moli/litr roztworu.
Obliczyliśmy, że stężony kwas siarkowy jest 18 M.
Przeliczanie stęż enia molowego na stęż enie procentowe
Przykład 10. Jakie jest stężenie % w/w 12 M roztworu HCl (d = 1,19 g/cm3, masa
cząsteczkowa 36,5)
Rozwiązanie: Trzeba obliczyć liczbę gramów HCl w 1000 ml roztworu 12 · 36.5 = 438 g
HCl / litr. Następnie trzeba obliczyć liczbę gramów HCl w 100 g roztworu: jeśli w 1000 ml
jest 1190 g tzn., że 1190 g roztworu zawiera 438 g HCl. Zatem 100 g roztworu zawiera 37g,
co znaczy, że 12 M kwas solny jest 37% w/w.
Przykład 11. Jakie jest stężenie procentowe w/o 4 M roztworu NaOH. (m. cz. NaOH = 40)
Rozwiązanie: Trzeba obliczyć liczbę gramów NaOH w 1000 ml roztworu: 4 · 40 g = 160 g/l,
a potem w 100 ml roztworu: 160 : 10 = 16 g/ml. 4 M roztwór NaOH jest 16% w/o.
Rozcień czanie roztworów
Przykład 12. Należy otrzymać 8% w/o roztwór z roztworu 40% w/o. Ogólna zasada jest
następująca: Trzeba wziąć taką ilość ml roztworu stężonego, która równa jest wartości
stężenia roztworu żądanego i uzupełnić wodą do ilości ml równych wartości stężenia
roztworu rozcieńczanego. Zatem trzeba wziąć 8 ml 40% roztworu i uzupełnić wodą do 40 ml,
uzyskując w ten sposób 40 ml 8% w/o roztworu. Można też wykonać obliczenie zauważając,
że dla otrzymania tak rozcieńczonego roztworu trzeba roztwór 40% rozcieńczyć 5 krotnie:
40 : 8 = 5. Należy wziąć 4 części wody i jedną część roztworu 40%. Na przykład zgodnie z
powyższym poleceniem 8 ml roztworu i 32 ml wody, 16 ml roztworu i 64 ml wody itd.
Przykład 13. Ile ml 20% roztworu NaOH potrzeba do sporządzenia 500 ml 5% roztworu.
Rozwiązanie: wiemy już, że cA· vA = cB · vB. Po podstawieniu: 20 % · x ml = 5% · 500 ml
obliczamy, że x równa się 125 ml. Należy 125 ml 20% roztworu uzupełnić wodą do 500 ml.
Przykład 14. Do jakiej objętości należy rozcieńczyć 20 ml 3 M roztworu NaOH aby uzyskać
stężenie 0,15 M. Rozwiązanie: 3 M · 20 ml = 0,15 M · x ml. Obliczamy x, które wynosi
400 ml. Należy 20 ml 3 M roztworu uzupełnić wodą do 400 ml.
Przykład 15. Obliczyć molowe stężenie roztworu po dodaniu 90 ml wody do 30 ml 3M
roztworu.
Rozwiązanie: Obliczenie jest analogiczne jak w Przykładzie 13 czyli: cA· vA = cB · vB.
Po podstawieniu danych mamy: 3 M · 30 ml = x M · 120 (30 + 90). Obliczone x = 0,75 M.
Mieszanie roztworów
Przykład 16. Ile ml 20% i 4% (w/o) roztworu (NH4)2SO4 należy zmieszać w celu otrzymania
400 ml 10% roztworu?
Rozwiązanie: Układa się liczby w kwadracie (jak poniżej), gdzie po lewej stronie pisze się w
kolumnie liczby wyrażające stężenia procentowe roztworów (20%, 4%), a na przecięciu
przekątnych stężenie procentowe, jakie należy otrzymać (10%). Następnie po przekątnej
odejmuje się od większej liczby mniejszą (10 – 4) i (20 – 10), zaś różnicę wpisuje się w
przeciwległym kącie kwadratu tzn. 6 ml 20% i 10 ml 4%.
20
6 ml 20%
10
4
10 ml 4%
Z tego zapisu widać, że 6 ml 20% należy wziąć do przygotowania 16 ml żądanego roztworu,
to x ml 20% do przygotowania 400 ml
x = ( 6 · 400) : 16 = 150 ml
Należy zmieszać 150 ml 20% roztworu i 250 (400 -150) ml 4% roztworu żeby otrzymać 400
ml 10% roztworu (NH4)2SO4. Punktem wyjścia do obliczeń może też być 10 ml 4% roztworu.
Dla rozwiązania tego zadania można też ułożyć równanie z jedną niewiadomą w taki sposób:
(20 · x) + 4 · (400 – x) = 400 · 10
20x + 1600 – 4x = 4000
16x = 4000 – 1600
16x = 2400
x = 150 ml
trzeba wziąć 150 ml 20% roztworu i (400 – 150) ml 4% roztworu do przygotowania 400 ml
10% roztworu (NH4)2SO4.
Przykład 17. Zmieszano 3 litry 2 M roztworu i 1 litr 3 M roztworu NaCl. Obliczyć
molowość uzyskanego roztworu. Można korzystać z następującej zależności:
v1 · M1 + v2 · M2 = (v1 + v2) · Mx
3 l · 2 M + 1 l · 3 M = ( 3 + 1) · x
6 + 3 = 4x
x = 9 : 4 = 2,25 M, tyle wynosi molowość nowego roztworu.
Obliczanie rozcień czenia preparatów enzymatycznych i produktów reakcji
Często w obliczeniach aktywności enzymów mamy do czynienia z rozcieńczaniem
preparatów enzymów i z rozcieńczaniem produktów reakcji w celu możliwości wykonania
oznaczenia z odpowiednią dokładnością. Na przykład, z preparatu enzymatycznego bierzemy
tylko 1/20. Potem po zakończeniu reakcji do pomiaru ilości powstałego produktu bierzemy 1
ml z 5 ml mieszaniny reakcyjnej. Aby obliczyć aktywność enzymu musimy pamiętać o tych
manipulacjach i aktywność obliczona na końcu oznaczenia musi zostać pomnożona przez
(20 · 5), czyli przez 100.
Kolorymetria
Kolorymetria to metoda analityczna pozwalająca na ilościowe oznaczenie nawet bardzo
małych ilości substancji w roztworze na podstawie prostej zależności między intensywnością
zabarwienia roztworu (absorpcja światła o określonej długości fali), a stężeniem zawartej w
nim substancji. Metodami kolorymetrycznymi można mierzyć zarówno stężenia substancji
posiadających własną barwę, jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich
reakcji chemicznych przeprowadza się w związki zabarwione. Obserwowane zabarwienie jest
dopełnieniem barwy promieniowania absorbowanego i odwrotnie. Przepuszczanie przez dany
roztwór tylko tej części widma świetlnego, która jest maksymalnie absorbowana sprawia, że
zmniejszenie natężenie tego światła po przejściu przez barwny roztwór nie jest zakłócane
światłem o innej długości fali. Dlatego w oznaczeniach kolorymetrycznych należy używać
światła monochromatycznego (jednobarwnego). W spektrofotometrach uzyskuje się światło
ściśle monochromatyczne przez zastosowanie pryzmatów lub siatek dyfrakcyjnych. W
prostszych aparatach fotokolorymetrach używanych na ćwiczeniach zastosowane filtry dają
światło tylko w przybliżeniu jednobarwne. Do roztworu o kolorze zielonym dobiera się filtr
czerwony, który pochłania promienie świetlne o długości fali odpowiadającej barwie zielonej,
a przepuszcza odpowiadające barwie czerwonej, absorbowane w maksymalnym stopniu przez
roztwór o kolorze zielonym. W przypadku, kiedy żaden z rodzajów promieni widzialnych nie
ulegnie pochłonięciu przez substancję odnosi się wrażenie światła białego, a roztwory takie są
bezbarwne.
Podstawowe prawo kolorymetrii, prawo Lamberta–Beera mówi, że absorbancja
(efektywność pochłaniania/absorbcji) światła monochromatycznego jest wprost
proporcjonalna do grubości warstwy i stężenia roztworu:
A = k · l · c
Miano i wartość współczynnika absorpcji k zależy od jednostek stężenia i grubości
warstwy absorbującej. W przypadku wyrażenia stężenia w molach na litr (M) nosi on nazwę
molowego współczynnika absorpcji ε. Liczbowo równa się on absorpcji, jaką daje roztwór
1M o grubości warstwy 1 cm. Molowy współczynnik pozwala obiektywnie ocenić czułość
reakcji (im jego wartość większa tym reakcja czulsza, jeśli ε < 1000, metoda jest mało czuła).
Z jego wartości można również obliczyć stężenie substancji w molach na litr:
c = A : (ε · l)
Ponieważ większość pomiarów kolorymetrycznych w pracowni biochemicznej
przeprowadza się w 1 cm kuwetach, to obliczenie stężenia substancji sprowadza się do
podzielenia wartości absorbancji przez wartość ε. Znając absorbancję roztworu i jego stężenie
można obliczyć molowy współczynnik absorpcji dla danej substancji.
Przykład 18. Roztwór ATP (adenozyno 5`-trójfosforanu) o stężeniu 3·10 –5 M wykazuje w
kuwecie 1 cm absorbancję A = 0,462. Obliczyć molowy współczynnik absorpcji ε dla ATP.
Ponieważ pomiar odbywa się w kuwecie 1 cm to ε = A : c, czyli 4,62·10-1 : 3·10-5 = 1,54·104
= 15400. Pamiętając, że ε równa się absorpcji 1 M roztworu można ten sam wynik otrzymać z
proporcji:
0,462 — 3·10-5 M
x — 1M x = 0,462 : 3·10-5 = 1,54·104
Z prawa Lamberta-Beera wynika że przy zachowaniu jednakowej długości drogi światła
absorbancja A jest proporcjonalna do stężenia (c), czyli A próby badanej : A wzorca = c próby badanej : c wzorca. Można więc obliczyć stężenie próby badanej dzieląc: A próby badanej przez A wzorca i
mnożąc ten iloraz przez c wzorca. Stężenie wzorca musi być wyrażone w takich samych
jednostkach jak stężenie próby.
Roztwory wzorcowe (standardowe) zawierają określoną ilość substancji w określonej
objętości np. w 1 ml. Na przykład 10 µg białka w 1 ml; 1 mg glukozy w 1 ml itd. Niemożliwe
jest zważenie 10 µg substancji ani nawet 1 mg z dokładnością odpowiadającą wymogom
oznaczenia kolorymetrycznego. W takich przypadkach należy odważyć wielokrotność
żądanej masy, a potem rozcieńczyć taki roztwór odpowiednio do potrzeb analizy. Np.
odważamy 10 mg białka, rozpuszczamy w 10 ml rozpuszczalnika i otrzymujemy w ten
sposób roztwór 1mg/ml (1000µg/ml). Z tego roztworu posługując się sposobem tzw. szeregu
rozcieńczeń sporządzamy roztwór 10-krotnie rozcieńczony (100 µg/ml), a z niego roztwór 10-
krotnie rozcieńczony, który będzie zawierał już żądaną ilość białka – 10 µg/ml. Również
roztwór glukozy warto zrobić przynajmniej 10-krotnie bardziej stężony (10 mg/ml) i
rozcieńczyć go 10 razy.
Przykład 19. Jakie jest stężenie glukozy w próbie badanej, jeśli absorbancja tej próby
wynosi 0,450, natomiast wzorzec o stężeniu 0,5 mg/ml wykazuje absorbancję 0,150.
Rozwiązanie: Można skorzystać z zależności: A próby badanej : A wzorca = c próby badanej : c wzorca i obliczyć c próby badanej: (0,450 : 0,150) · 0.5 = 1.5 mg/ml. Można też ułożyć proporcję
0,5 mg — 0,150
x mg — 0,450 x = (0,5 · 0,450) : 0,150 co da ten sam wynik: 1,5 mg/ml
Krzywa wzorcowa dla roztworu nie
stosujęcego się do prawa Lamberta-
stosującego się do prawa Lamberta-
Beera
Beera
0,7
0,7
0,6
0,6
0,5
ja
0,5
ja
c
c
n
n
0,4
a
0,4
a
rb
rb
o 0,3
o 0,3
s
s
b
b
0,2
A
0,2
A
0,1
0,1
0
0
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
Stężenie [
St
µM]
ężenie [µM]
A B
Gdy roztwór nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera (wartości absorbancji nie wzrastają
proporcjonalnie do stężeń) należy posługiwać się krzywą wzorcową, która nie jest wtedy linią
prostą. Krzywa wzorcowa (kalibracyjna) przedstawia zależność między absorbancją i
stężeniem i w przypadku zgodności z prawem Lamberta-Beera ma postać linii prostej
przechodzącej przez punkt przecięcia osi współrzędnych. W celu przygotowania krzywej
wykonuje się pomiary absorbancji dla kilkunastu stężeń roztworów wzorcowych
(maksymalna absorbancja nie powinna przekraczać wartości 1) i wykreśla się krzywą
odkładając na osi X stężenia, a na osi Y odpowiednie wartości absorbancji. Należy tak
dobierać podziałkę na osiach żeby krzywa była nachylona do osi pod kątem mniej więcej 45°.
Stężenie próby badanej odczytuje się z krzywej wzorcowej przez interpolację biorąc pod
uwagę absorbancję tej próby. Dla prostoty, obliczanie stężeń na podstawie roztworów
wzorcowych lub krzywej wzorcowej wymaga żeby końcowe objętości, w których
przeprowadzamy reakcję dla wzorców i próby badanej były sobie równe. Na ćwiczeniach
korzystamy z krzywej wzorcowej, bo dzięki temu widać, w jakim zakresie wartości
absorbancji są wprost proporcjonalne do stężenia. Wykreślanie krzywej niezbędne jest
również dla oceny zakresu stężeń, w jakich można przeprowadzać oznaczenia. Z krzywej na
rysunku B widać, że powyżej stężenia 50 µM odczyty z krzywej są już mało dokładne,
ponieważ wzrost absorbancji jest tylko minimalny pomimo dużego wzrostu stężenia.
Stężenie rozcieńczonych roztworów jest wyrażane w milimolach, mikromolach itd., gdzie:
1 mmol = 10-3 mola; 1µmol = 10-6 mola; 1nmol = 10-9 mola; 1 pmol = 10-12 mola. Gdy
wyrażamy stężenia w tych jednostkach, to musimy wiedzieć, że roztwór 1 mM = 10-3 M =
1mmol/litr = 1µmol/ml, roztwór 1µM = 10-6 M = 1µmol/litr = 1nmol/ml, a roztwór 1nM =
1nmol/litr = 1 pmol/ml. Jeśli stężenie jest wyrażane w gramach, to 1g = 1000 mg, 1mg = 1000
µg, 1 µg = 1000 ng, 1 ng = 1000 pg. Zatem, jednostki układają się w kolejności: mili-, mikro-,
nano-, piko-, co oczywiście trzeba pamiętać.
No to do tablicy!