plik

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 1 -

Ćwiczenie 2

Temat: Wpływ czynników fizyko-chemicznych na drobnoustroje

Temperatura jako czynnik wzrostowy

Temperatura  jest  jednym  z  najważniejszych  czynników  warunkujących  wzrost  i  procesy
życiowe  drobnoustrojów.  Działanie  na  mikroorganizmy  może  mieć  charakter  bezpośredni:
wpływając  na  szybkość  wzrostu,  aktywność  enzymów,  skład  chemiczny  komórek,
wymagania

pokarmowe,

lub

pośredni

regulując

rozpuszczalność

związków

wewnątrzkomórkowych,  transport  jonów,  dyfuzję  substancji  chemicznych  i  zmianę
właściwości osmotycznych błon komórkowych.
Każdy gatunek mikroorganizmów charakteryzuje się trzema kardynalnymi temperaturami
rozwoju:  minimalną,  optymalną  i

maksymalną. W temperaturze optymalnej

mikroorganizmy  rozwijają  się  najszybciej,  natomiast  powyżej  temperatury  maksymalnej
i poniżej temperatury minimalnej wzrost mikroorganizmów jest niemożliwy.
Drobnoustroje  ze  względu  na  wymagania  temperaturowe  można  podzielić  na  4  grupy:
termofile, mezofile, psychrofile, psychrotrofy (Rys. 1).

Rysunek 1 – Zakres temperaturowy wzrostu drobnoustrojów.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 2 -

1. Drobnoustroje termofilne (termofile - ciepłolubne) – to mikroorganizmy

charakteryzujące  się  wysoką  optymalną  temperaturą  wzrostu  w  granicach  45-50ºC,
a  niekiedy  nawet  wyższej  od  60ºC.  Większość  termofili  to  bakterie  gram-dodatnie
przetrwalnikujące  np.  Geobacillus  stearothermophilus,  Bacillus  coagulans  –
przetrwalniki  tych  bakterii  wyróżniają  się  wysoką  ciepłoodpornością  i  wyznaczają
parametry  sterylizacji  konserw  produkowanych  do  krajów  z  ciepłej  i  gorącej  strefy
klimatycznej.  Do  drobnoustrojów  termofilnych  należą  również  niektóre  gatunki
bakterii  fermentacji  mlekowej,  np.  Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii
stosowany  w  przemysłowej  produkcji  kwasu  mlekowego  oraz  Lactobacillus
delbrueckii  subsp.  bulgaricus  i  Streptococcus  thermophilus  wchodzące  w  skład
zakwasów

jogurtowych,

także

bakterie

stosowane

produkcji

wysokodogrzewanych serów dojrzewających.

2. Drobnoustroje mezofile (mezofile – obojętnolubne) – to drobnoustroje rozwijające

się w temperaturach umiarkowanych. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się
zazwyczaj w zakresie od 20 do 45ºC. Wśród mezofili wyróżniamy organizmy
saprofityczne i większość gatunków chorobotwórczych dla człowieka np.
Salmonella sp., Staphylococcus aureus.

3. Drobnoustroje psychrofilne (psychrofile – zimnolubne) – to mikroorganizmy

rosnące już w temperaturach od 0ºC, o temperaturze optymalnej nie wyższej niż 15ºC
i  maksymalnej  -  20ºC.  Wzrost  mikroorganizmów  psychrofilnych  w  niskich
temperaturach  jest  uwarunkowany  aktywnością  enzymów  katalizujących  reakcje
metaboliczne  w  tych  temperaturach.  Psychrofile  znalazły  dobre  warunki  do  rozwoju
w  regionach  podbiegunowych,  szczytach  gór,  jeziorach,  morzach  i  oceanach  strefy
umiarkowanej.  Do  tej  grupy  mikroorganizmów  zaliczamy  gatunki  bakterii  należące
do rodzajów: Alcaligenes, Bacillus, Psudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter.

4. Drobnoustroje psychrotrofowe (psychrotrofy) to mikroorganizmy, które bez

względu  na  swoje  temperatury  kardynalne  posiadają  zdolność  rozwoju
w  temperaturze  ≤7ºC.  Do  psychrotrofów  zaliczamy  wszystkie  psychrofile  i  część
mezofili.

W przemyśle spożywczym mikroorganizmy o niskich temperaturach wzrostu stanowią

istotny  problem  w  przechowalnictwie  żywności.  Psychrofile  spotykane  są  najczęściej
w produktach żywnościowych pochodzenia morskiego, natomiast psychrotrofy  – w nabiale,
wędlinach,  warzywach  i  owocach.  Szczególne  niebezpieczeństwo  zatruć  pokarmowych
stwarzają patogenne psychrotrofy: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus
cereus.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 3 -

Temperatura jako czynnik zabójczy

W temperaturze przekraczającej maksymalną temperaturę wzrostu drobnoustrojów

następuje  ich  termiczna  inaktywacja.  Pod  wpływem  ogrzewania  zachodzi  mechanizm
śmierci  cieplnej  drobnoustrojów.  Prowadzi  on  do  powstania  letalnych,  nieodwracalnych
zmian  w  komórce.  Zniszczeniu  ulega  głównie  struktura  przestrzenna  białek  komórkowych
oraz  kwasów  nukleinowych  (DNA,  RNA).  Wzrost  temperatury  prowadzi  również  do
obniżenia  aktywności,  dezaktywacji  enzymów  podtrzymujących  metabolizm  komórki,
a następnie zahamowania przemian wewnątrzkomórkowych. Wysoka temperatura uszkadza
funkcjonowanie błony cytoplazmatycznej, która staje się przepuszczalna dla białek, kwasów
nukleinowych  i  innych  substancji  wewnątrzkomórkowych.  Ze  względu  na  specyficzną
oporność mikroorganizmów na działanie wysokiej temperatury wyróżnia się mikroorganizmy
ciepłooporne i ciepłowrażliwe. Najbardziej ciepłooporną  grupą mikroorganizmów są formy
przetrwalne  (spory)  laseczek  z  rodzaju  Bacillus  i  Clostridium.  Mniejszą  ciepłoopornością
w porównaniu z przetrwalnikami wykazują komórki wegetatywne (rys. 2).

Ciepłooporne

Bakterie przetrwalnikujące
Formy przetrwalne (spory)

Ciepłowrażliwe

Bakterie nie-

przetrwalnikujące

Komórki wegetatywne

Mikroorganizmy

Rysunek 2 – Podział mikroorganizmów na bakterie ciepłooporne i ciepłowrażliwe.

Pasteryzacja może być jest stosowana w mikrobiologii do badania zdolności
przetrwalnikowania

(pasteryzacja 80ºC przez 10 min) oraz ciepłooporności

mikroorganizmów (pasteryzacja 63,5ºC przez 30 min). Działanie temperatury 80ºC przez 10
min ma charakter letalny w stosunku do komórek wegetatywnych, oporne są tylko
przetrwalniki bakterii z rodzajów Bacillus i Clostridium. Działanie temperatury 63,5ºC przez
30 min przetrzymują tzw. bakterie ciepłooporne np. komórki wegetatywne Enterococcus,
Corynebacterium, Micrococcus oraz przetrwalniki Bacillus i Clostridium.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 4 -

Stężenie jonów wodorowych (pH) środowiska

Drobnoustroje  posiadają  zdolność  wzrostu  i  spełniania  swoich  funkcji  życiowych  tylko
w określonym zakresie wartości pH środowiska. Przedział pH, w którym mogą się rozwijać,
wyznaczają wartości minimalne i maksymalne, natomiast wartość pH, przy której szybkość
wzrostu jest najwyższa, nazywamy optymalną.

Drobnoustroje  acydofilne  (acydofile,  kwasolubne)  -  charakteryzujące  się  zdolnością
wzrostu w środowisku przy niskiej wartości pH (pH < 4.0), Ich optymalny wzrost obserwuje
się w zakresie pH od 2.0 do 5.0. Do typowej mikroflory acydofilnej zaliczamy  m.in. bakterie
fermentacji  mlekowej  (do  pH  =3.5),  bakterie  octowe,  a  także  termoacydofilne  bakterie
należące  do  rodzaju  Alicyclobacillus  (ich  wzrost  odnotowano  w  pasteryzowanych  sokach
owocowych).  Wśród  acydofili  występują  liczne  gatunki  drożdży  i  grzybów  strzępkowych,
np. gatunki należące do rodzajów: Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium.
Drobnoustroje  neutrofile  (neutrofile,  obojętnolubne)  –  odznaczające  się  optymalnym
wzrostem  w środowisku  o pH bliskim obojętnemu  (pH 6.0-7.5). Większość bakterii należy
do tej grupy drobnoustrojów.

Drobnoustroje  alkalifilne  (alkalifile,  zasadolubne)  –  mikroorganizmy,  których  wzrost
występuje w środowiskach alkalicznych o pH > 9.0, o optymalnej dla wzrostu wartości pH
od  8.0  do  11.0.  Do  alkalifili  zaliczamy  m.in.  Vibrio  cholerae  (przecinkowiec  cholery),
Streptococcus pneumoniae (paciorkowiec zapalenia płuc), bakterie nitryfikacyjne z rodzajów
Nitrosomonas i Nitrobacter oraz Enterococcus faecalis, wybrane gatunki Bacillus sp.

Aktywność wody w środowisku (a

)

Wzrost mikroorganizmów jest możliwy tylko w obecności wody. Do określenia
zapotrzebowania na wodę drobnoustrojów przyjęto termin aktywność wody w środowisku
(a

). Czysta chemicznie woda ma aktywność wody równą 1, ze wzrostem stężenia związków

rozpuszczalnych a

maleje poniżej tej wartości. Aktywność wody, przy której szybkość

wzrostu mikroorganizmów jest najwyższa nazywany optymalną. Spadek a

poniżej wartości

optymalnej powoduje spowolnienie wzrostu i wydłużenie fazy adaptacyjnej. A

, poniżej

której zostaje zahamowany wzrost drobnoustrojów, nazywamy minimalną.
Dla większości bakterii optymalna wartość a

mieści się w zakresie 0.96-0.99. Najniższą a

przy której stwierdzono wzrost bakterii to 0.75. Są to organizmy halofilne, które wykazują
wyraźne zapotrzebowanie na NaCl np. Vibio, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus.
Grzyby w porównaniu z bakteriami mogą rozwijać się przy niższych wartościach a

, grzyby

strzępkowe między 0.91-0.80, drożdże do a

=0.88. Stwierdzono jednak wzrost kserofilnych

grzybów strzępkowych przy a

=0.65 (Rys. 3).

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 5 -

Rysunek 3 – Aktywność wody (a

) a wzrost różnych grup drobnoustrojów.

Promieniowanie UV

W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie
na  mikroorganizmy  nadfioletowej  części  widma  słonecznego  o  długości  fali  250-260  nm,
a  więc  tą  część  widma,  która  jest  najsilniej  absorbowane  przez  kwasy  nukleinowe  (DNA,
RNA).  Promieniowanie  UV  jest  wykorzystywane  do  niszczenia  mikroorganizmów
występujących  w  powietrzu  i  na  odkrytych  powierzchniach  zamkniętych  pomieszczeń  o
niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów i chłodni, laboratoriów). Najbardziej efektywnie
działa promieniowanie o długości fali 260 nm, które jest pochłaniane przez zasady purynowe
i  pirymidynowe  oraz  promieniowanie  o  długości  fali  280  nm  -  pochłaniane  przez
aminokwasy  aromatyczne  (tryptofan,  tyrozyna,  fenyloalanina).  Następuje  również
unieczynnienie enzymów, surowic i toksyn.

Czynniki chemiczne
Środki dezynfekcyjne - Patrz chemiczne metody wyjaławiania (patrz:

ćwiczenie 1 –

przewodnik dla studentów studiów stacjonarnych

Obowiązuje również treść przewodnika do ćwiczenia 4 i 5 dla studentów studiów
stacjonarnych.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 6 -

1. Posiewy celem wyizolowania z materiału Escherichia coli, Enterococcus faecalis,

Saccharomyces cerevisiae

Materiał stanowią 3 kultury A, B i C – każde stanowisko bada jedną kulturę.

Posiewy wykonać do następujących podłóż:

Kultura A

bulion z glukozą – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

YGC-agar – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 25ºC przez 96 godzin.

Kultura B

pożywka z żółcią, zielenią brylantową, laktozą i rurką Dürhama – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

podłoże VRBL-agar – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin.

Kultura C

pożywka wg Burzyńskiej z azydkiem sodu, glukozą, fioletem krystalicznym
i purpurą bromokrezolową – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

podłoże Slanetza i Bartleya – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin.

2. Badanie stosunku do tlenu szczepów

Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium

butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.

posiew metodą kłutą hodowli do słupka bulion agar bez glukozy

3. Badanie właściwości gazotwórczych szczepów

Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium

butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.

posiew 1 cm

hodowli do upłynnionego słupka bulion agar z glukozą

4. Badanie oddziaływania wybranych środków chemicznych na wzrost drobnoustrojów

Zaobserwować oddziaływanie hamujące/stymulujące lub brak oddziaływania wybranych

środków chemicznych na szczepy: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 7 -

i Candida lipolytica w posiewach metodą powierzchniową z zastosowaniem metody

dyfuzyjno-krążkowej. Wyniki zestawić w tabeli 1.

Tabela 1

Szczep

środek

dezynfekcyjny

nadtlenek

wodoru

kwas

mlekowy

kwas

octowy

alkohol

etylowy

Escherichia coli

Enterococcus
faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica

5. Badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki

Zaobserwować stopień wrażliwości szczepów badanych na wybrane antybiotyki (metoda

dyfuzyjno-krążkowa). Wyniki zestawić w tabeli 2.

Tabela 2

Szczep

Średnice stref zahamowania wzrostu [mm]

dla poszczególnych antybiotyków

penicylina

Escherichia coli

Enterococcus
faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica

6. Badanie oddziaływania pH środowiska i temperatury na wzrost drobnoustrojów

Wykonać posiewy badanych szczepów oczkiem ezy do bulionu z glukozą (każde stanowisko

bada jeden szczep):

o pH 7,0 – próba kontrolna; inkubacja w temp. optymalnej
o pH 4,5 i 9,6 – badanie oddziaływania pH środowiska na wzrost szczepów; inkubacja

w temp. optymalnej

o pH 7,0 – następnie spasteryzować w temp. 63,5ºC przez 30 min + 5 min na ogrzanie;

inkubacja w temp. optymalnej

o pH 7,0 – następnie spasteryzować w temp. 80ºC przez 10 min + 5 min na ogrzanie;

inkubacja w temp. optymalnej

o pH 7,0; inkubacja w temp. 7 ºC

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

- 9 -

Odczyty na ćwiczeniu 3

1. Odczytać wyniki posiewów, zestawić je w tabelach i zinterpretować

Tabela 1

Kultura

bulion

glukozą

pożywka

z żółcią,

laktozą

i zielenią

brylantową

pożywka

Burzyńskiej

agar

odżywczy

YGC-

agar

VRBL-

agar

podłoże

Slanetz’a

Tabela 2

Szczep

Właściwości gazotwórcze

Stosunek do tlenu

Pseudomonas fluorescens

Escherichia coli

Clostridium butyricum

Tabela 3

Szczep

Wzrost po pasteryzacji

wzrost

w temp.

7ºC

Wzrost w pH

63,5ºC/30min. 80ºC/10min.

7,0

4,5

9,6

Escherichia coli

Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica