Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Wykorzystanie elektroforezy w warunkach denaturujących do 
analizy stopnia oczyszczenia białek i wyznaczania ich masy 
cząsteczkowej

Cel ćwiczenia
Celem   ćwiczenia   jest   ocena   skuteczności   wstępnych   etapów   oczyszczania 

dehydrogenazy   glutaminianowej   z   siewek   pszenżyta   i   wyznaczenie   masy   cząsteczkowej 
handlowego preparatu białka drogą elektroforezy w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) 
sodium  dodecylsulphate  polyacrylamide  gel  electrophoresis   (Laemmli   1970,   Nature   227: 
680-685).

Wprowadzenie
Elektroforeza denaturująca jest powszechnie używana w laboratoriach do separacji 

białek w zależności od ich masy cząsteczkowej, w oparciu o różną szybkość migracji białek 
przez sito (pory żelu) pod wpływem pola elektrycznego. Białka natywne o tej samej masie 
cząsteczkowej będą migrować z różną szybkością w polu elektrycznym uzależnioną zarówno 
od   ładunku   jak   i   kształtu.   Zatem,   żeby   szybkość   migracji   była   zależna   tylko   od   masy 
cząsteczkowej białek, należy zniszczyć  ich   trójwymiarową strukturę sprowadzając kształt 
cząsteczki   do   liniowego   i   zamaskować   ładunek   elektryczny   łańcuchów   bocznych 
aminokwasów. Dzieje się to za pośrednictwem SDS. SDS razem z krótkotrwałym działaniem 
wysokiej temperatury i niszczącym mostki dwusiarczkowe merkaptoetanolem, sprawiają, że 
białka   o   strukturze   czwartorzędowej   dysocjują   na   podjednostki,   a   redukcja   mostków 
dwusiarczkowych   do   grup   SH   powoduje,   że   łańcuchy   polipeptydowe   przyjmują   kształt 
pałeczkowaty.   SDS   wiąże   się   dość   równomiernie   do   zlinearyzowanych   łańcuchów 
białkowych   (ok   1,4  g   SDS/1g   białka)   co   sprawia,   że   ładunek   białka   jest   w  przybliżeniu 
proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej. Ponieważ SDS jest detergentem  anionowym 
więc nadaje ładunek ujemny wszystkim białkom. W polu elektrycznym białka opłaszczone 
ujemnie naładowanym SDS będą poruszać się w kierunku elektrody naładowanej dodatnio (w 
elektroforezie  anody)  z   różną  szybkością  zależną  już  tylko  od  masy   cząsteczkowej.  Pole 
elektryczne oddziałuje silniej na większe cząsteczki obdarzone większym ładunkiem niż na 
mniejsze cząsteczki, ale większe cząsteczki napotykają znacznie większy opór porów żelu 
poliakryloamidowego. Ostatecznie białka rozdzielają się w żelu w taki sposób, że im niższa 
masa cząsteczkowa tym szybciej migruje białko. 

Poliakryloamid  jest chemicznie inertny i co ważniejsze, łatwo przygotować żele o 

różnych   wielkościach   porów  dobierając  odpowiednio  procentowość  żelu  i  stosunek  ilości 
akryloamidu   do   bisakryloamidu.   Zastosowanie   do   elektroforezy   dwóch   rodzajów   żeli 
(zagęszczającego   i   rozdzielającego)   różniących   się   zarówno   pH   jak   i   wielkością   porów 
pozwala   na   dobry   rozdział   białek.   Typ   elektroforezy,   w   której   bufor   w   żelu   i   bufor 
elektrodowy   (rozwijający)   różnią   się   pH,   nosi   nazwę   elektroforezy   nieciągłej   ang. 
discontinuous. Stosuje się ją częściej do rozdziału białek w przeciwieństwie do elektroforezy 
ciągłej ang. continous, w której bufor w żelu i bufor elektrodowy mają takie samo pH. 

Znaczenie żelu zagęszczającego. Po włączeniu dopływu prądu, naładowana ujemnie 

glicyna   w  buforze  rozwijającym  (pH  8,3)  „ucieka”  od  ujemnie   naładowanej  elektrody  w 
kierunku żelu zagęszczającego i prób. Jednak panujące tu znacznie niższe pH (6,8) sprawia, 
że   cząsteczki   glicyny   tracą   większość   swoich   ujemnych   ładunków,   co   zmniejsza   ich 
ruchliwość.   Jony   chlorkowe   znajdujące   się   w   żelu   zagęszczającym   i   w   próbach   także 
przemieszczają   się   w   kierunku   elektrody   dodatniej.   Zachowanie   obu   rodzajów   jonów 
powoduje,   że   tworzy   się   wąski   obszar   o   małym   przewodnictwie   (czyli   bardzo   wysokiej 

1

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

oporności) na początku żelu zagęszczającego. Ponieważ z prawa Ohma V = i · R to prawie 
całe napięcie przyłożone do żelu jest ograniczone do tego wąskiego obszaru. Bardzo wysokie 
natężenie pola elektrycznego powoduje, że ujemnie naładowane białka przemieszczają się do 
przodu. Są one poprzedzane  przez jony chlorkowe, a za białkami  wędrują powolne jony 
glicyny.   W   rezultacie   przemieszczania   się   tego   wąskiego   obszaru   o   wysokim   napięciu, 
wszystkie białka przesuwają się w żelu zagęszczającym w zwartym prążku i docierają do żelu 
rozdzielającego   w   tym   samym   czasie   niezależnie   od   ich   masy   cząsteczkowej.   W   żelu 
rozdzielającym   wszystko   się   zmienia,   panuje   tu   wyższe   pH   (8,8)   i   glicyna   staje   się 
naładowana   bardziej   ujemnie,   co   powoduje,   że   zwiększa   się   jej   ruchliwość,   natomiast 
ruchliwość  białek  zmniejsza  się  dzięki   działaniu  żelu  jako  sita.  W   rezultacie   glicyna   nie 
utrzymuje   już   białek   w   wąskim   obszarze   o   wysokiej   oporności   i   dużym   natężeniu   pola 
elektrycznego. Teraz białka znajdują się w jednorodnym polu elektrycznym i poruszają się we 
własnym tempie; następuje ich rozdział według masy cząsteczkowej.

Elektroforeza   denaturująca   jest   stosowana   obok   sączenia   molekularnego,   do 

wyznaczania   masy   cząsteczkowej   białek.   Obydwie   metody   uzupełniają   się,   bo   technika 
sączenia molekularnego pozwala na wyznaczenie masy cząsteczkowej białek natywnych, a 
dzięki   SDS-PAGE   możemy   dowiedzieć   się,   czy   badane   białko   jest   monomerem,   czy 
przeciwnie jest zbudowane z podjednostek i jaka jest liczba tych podjednostek.

Odczynniki.

1.

Gotowy do użycia 30% w/o roztwór mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu – w 

proporcji odpowiednio 29,2% : 0,8%

2. 1,5 M bufor Tris-HCl pH 8,8
3. 0,5 M bufor Tris-HCl  pH 6,8
4. TEMED – N,N,N’,N’-tertrametyloetylenodiamina,
5. APS- nadsiarczan amonowy - 10% roztwór  w/o 
6. Woda dejonizowana,

7.

Bufor rozwijający – Tris-glicyna-SDS (0,025 M Tris) pH 8,3 zawierający 0,1% SDS

8. Bufor do prób zawierający 1% błękit bromofenolowy, 25% glicerol, 2% SDS, 0,7 M 

merkaptoetanol i 0,05 M bufor Tris-Gly pH 6.8.  

9. 10% SDS
10. 0,1% błękit Comassi brillant blue R-250 w 40% metanolu i 10% kwasie octowym

11.

 Roztwór odbarwiający: 40% metanol w 10% kwasie octowym.

Wykonanie.
Przygotowanie aparatu 
Do   wszystkich   prac   zaleca   się   stosowanie   rękawiczek   jednorazowych.   Aparat   do 

elektroforezy (np. wyprodukowany przez Firmę Bio-Rad) przygotować zgodnie z zaleceniami 
prowadzącego  ćwiczenia,  zwykle  należy upewnić się czy

 

mamy  do dyspozycji  wszystkie 

ruchome elementy aparatu oraz odtłuścić szybki przy pomocy stężonego etanolu lub acetonu. 
Kolejnym etapem jest złożenie szybek w statywie, aby powstały komory do wylania płytek z 
żelem poliakryloamidowym.  W komorach umieścić grzebienie i w odległości około 1 cm 
poniżej   zębów   grzebienia   zaznaczyć   pisakiem   poziom   napełnienia   komór   żelem 
rozdzielającym. Wyjąć grzebienie.

Przygotowanie 12% żelu rozdzielającego 
Do   czystej   probówki   typu   Falcon   lub   zlewki   o   objętości   25-50   ml   odmierzyć 

następujące odczynniki (objętość całkowita wynosić będzie 16,0 ml):  6.4  ml 30% roztworu 
mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 4,0 ml 1,5 M buforu Tris-HCl (pH 8,8), 0,16 ml 
10% SDS, 5,36 ml wody dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować 

2

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

pipetę do nakładania żelu wyskalowaną na 3,75 ml z czysta końcówką. Następnie dodać 8 

µ

l 

TEMED`u   (inicjuje   reakcję   polimeryzacji)   oraz  80  

µ

l  10%   nadsiarczanu   amonu   (APS, 

katalizuje proces polimeryzacji), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść do komór 
formujących żel po 7,5 ml do każdej (2 x 3,75 ml pipetą automatyczną na 5 ml). Na koniec,  
na wylane między szybkami żele nawarstwić 0,5 ml dejonizowanej wody w celu odcięcia 
dopływu powietrza i pozostawić bez ruchu, możliwie nie narażając polimeryzujących żeli na 
szybkie zmiany temperatur (np. otwarte okno), na 45 minut do polimeryzacji. 

Przygotowanie 4% żelu zagęszczającego 
Po   spolimeryzowaniu   żelu   rozdzielającego,   zlać   ostrożnie   nawarstwioną   wcześniej 

wodę do zlewu – przechylając ostrożnie zablokowane w statywie komory do formowania żelu 
(wcześniej   przechylając   delikatnie   przekonać   się,   czy   zaszła   polimeryzacja).   Do   komór 
włożyć pod kątem ok. 30-45 stopni grzebienie, tak aby po wlaniu żelu można było łatwo 
wcisnąć je do komory – czynność tą przećwiczyć „na sucho”. Następnie do czystej probówki 
typu  Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć  następujące odczynniki (objętość 
całkowita   wynosić   będzie   10,0   ml):  1,33  ml   30%   roztworu   mieszaniny   akryloamidu   i 
bisakryolamidu,  2,5  ml   0,5   M   buforu   Tris-HCl   (pH   6.8),  6,1  ml   wody   dejonizowanej. 
Składniki te dobrze razem wymieszać,  przygotować  pipetę wyskalowaną  np. na 4,0 ml  z 
czysta końcówką. Następnie dodać  10 

µ

l TEMED`u oraz 100 

µ

l 10% nadsiarczanu amonu. 

Wszystkie składniki szybko wymieszać i nanieść na żel rozdzielający poniżej 1-2 mm górnej 
krawędzi niższej płytki. Płynnie wcisnąć grzebień, począwszy od końca niżej zanurzonego w 
żelu, tak aby pod krawędziami grzebienia nie zebrały się pęcherzyki powietrza, nadmiar żelu 
powinien   wypłynąć   z   komory.   Tak   przygotowane   płytki   pozostawić   na   45   minut   do 
polimeryzacji.

Przygotowanie prób do nanoszenia na żel

Na   każdy   żel   zostaną   nałożone   następujące   preparaty:   wzorzec   białek   o   znanych 

masach   cząsteczkowych,   roztwór   białka   do   oznaczenia   masy   cząsteczkowej   i   próby   z 
kolejnych etapów oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej. Jeśli oprócz homogenatów z 
liści były także oczyszczane homogenaty z korzeni to koniecznie trzeba je nałożyć na żel.

  Zamrożone próby z kolejnych etapów oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej 

rozmrozić na stole laboratoryjnym. Dokładnie wymieszać i wstawić do lodu. Przygotować 
naważki albuminy i trypsyny każda o zawartości białka 1mg/ml i rozpuścić w 0.5 M buforze 
Tris-HCl pH 6,8. Do 80 

µ

l każdej z prób i roztworów albuminy i trypsyny dodać 20 

µ

l buforu 

do przygotowania prób ( stosunek 4:1). Wzorzec białek ogrzać w termobloku w 70º C  przez 
30-60 sek. Wszystkie próby ogrzać w 95º C przez 5-7 min. Obliczyć objętość prób jaką trzeba 
nałożyć  na żel, tak  żeby do każdej  studzienki odpipetować  30-40  

µ

g białka.  Albuminę  i 

trypsynę nałożyć w ilości 10-20 

µ

g na studzienkę. Wzorzec białek w ilości 5 

µ

l na studzienkę. 

Rozdział elektroforetyczny ekstraktów

Upewniwszy się że nastąpiła polimeryzacja żelu wyciągnąć grzebienie, na podstawie 

wskazówek prowadzącego ćwiczenia umieścić płytki z żelem w aparacie do elektroforezy 
zaznaczając, która płytka należy do której grupy studentów.  Przepłukać studzienki buforem 
rozwijającym, wlać bufor rozwijający do takiego poziomu aby zakrył studzienki. Nanieść do 
studzienek odpowiednie objętości wzorca białkowego, albuminy lub trypsyny i preparatów 
pochodzących z oczyszczania dehydrogenazy glutaminianowej. Tak samo postąpić z drugim 
żelem.   Wstawić  aparat   do pojemnika  na  bufor, wlać  bufor  do poziomu   przykrywającego 

3

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

dolną   elektrodę.   Aparat   przykryć   pokrywą   i   podłączyć   do   zasilacza.   Włączyć   zasilacz. 
Elektroforezę prowadzić  przy stałym napięciu 150 V do momentu gdy barwnik znajdzie się 
około   5   mm   od   końca   żelu.   Następnie   wyłączyć   zasilacz,   zdjąć   pokrywę   i   wylać   bufor 
rozwijający. Wyjąć płytki i delikatnie podważając zdjąć jedną z nich z powierzchni żelu. Żel 
zsunąć do szalki z barwnikiem i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 12 godz. 
Następnie odbarwić tło wymieniając kilkakrotnie roztwór odbarwiający.

Opracowanie wyników

Wyznaczenie masy cząsteczkowej.  Obliczyć wartość R

f

  czyli

 

stosunek odległości na 

jaką przesunęły się od początku żelu rozdzielającego poszczególne prążki białek wzorca do 
odległości na jaką przemieścił się barwnik. Na tej podstawie sporządzić krzywą kalibracyjną 
odkładając   na   osi   rzędnych   logarytmy   mas   cząsteczkowych   wzorców   białek,   a   na   osi 
odciętych odpowiadające im wartości R

f

. Następnie na podstawie wyznaczonych wartości R

f 

dla albuminy i trypsyny odczytać dla nich logarytmy mas cząsteczkowych i przeliczyć je na 
masy cząsteczkowe. 

Analiza   oczyszczenia   dehydrogenazy   glutaminianowej.  Porównać   liczbę   i 

intensywność prążków na poszczególnych etapach oczyszczania enzymu. Na podstawie masy 
cząsteczkowej   monomeru   dehydrogenazy   glutaminianowej   z   pszenżyta   (44   kD)   wskazać 
prawdopodobne położenie prążka pochodzącego od oczyszczanego enzymu. Sprawdzić czy 
intensywność   tego   prążka   zwiększa   się   w   miarę   puryfikacji.   Porównać   obraz   rozdziału 
elektroforetycznego preparatów z korzeni i części nadziemnych pszenżyta, czy widać różnice 
we wzorach prążków? 

4