Endonukleazy restrykcyjne 

– molekularne nożyczki 

 

1869 Odkrycie DNA (Miescher). 

 

1944 Funkcja DNA: przechowywanie informacji genetycznej (Avery) 

 

1953 Podwójna helisa - odkrycie struktury DNA (Crick, Watson)  

 

1955 Arthur Kornberg wyizolował polimerazę DNA 

 

1966 Odczytanie kodu genetycznego (Khorana, Nirenberg i in.) 

1966 Weiss i Richardson wyizolowali ligazę DNA 

 

1974 Początek inżynierii genetycznej: przeniesienie genu do bakterii 

(Boyer i in.) 

  

Odkrycie enzymów restrykcyjnych 

 
1962 r. 

Arber i Dussoix

 – wyjaśnili zjawisko restrykcji – ograniczenia 

 

rozwoju fagów w 

E. coli. 

Zidentyfikowali  endonukleazę, 

 

która trawiła niechroniony ( o innym wzorcu metylacji)  DNA. 

 

Metylacja charakterystyczna dla gospodarza bakteryjnego 

 

chroniła DNA przed restrykcją (trawieniem) 

 
1968 r.  

Arber i Linn

 oczyścili enzym 

EcoB 

i wykazali jego działanie in 

 

vitro. Enzym ten trawił DNA 

E.coli 

K ale nie trawil 

E.coli 

B

. 

 
1968 r. 

Smith, Wilcox, Kelly

 (John Hopkins Univeristy) wyizolowali 

pierwszy enzym II klasy i określili charakterystykę miejsca 

rozpoznania dla 

Hind

 II 

 
1972 r. Enzym ten został użyty do sporządzenia 

pierwszej mapy 

 

restrykcyjnej wirusa SV40 prez D. Nathansa 

 

1978 r.

 Nagroda Nobla dla Arbera, Smitha i Wilcoxa 

za odkrycie 

 

enzymów restrykcyjnych 

Transformation 

Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja 

zrekombinowanej insuliny w bakteriach 

Enzymy restrykcyjne

 to endonukleazy 

–  

przecinają szkielet cukier-fosforan w DNA 

  

 

 

 

 

 

 

Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III 

Główna różnica dotyczy enzymów 

II klasy

, gdzie system restrykcji jest 

oddzielony od systemu metylacji

. 

W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu 
enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych 
podjednostek. 

Enzymy poszczególnych klas różnią  się także wymaganiami co do kofaktorów 

Enzyme   Organism from which derived  

Target sequence 
(cut at *) 5' -->3'  

Ava I  

Anabaena variabilis  

C* C/T C G A/G G  

Bam HI  

Bacillus amyloliquefaciens  

G* G A T C C  

Bgl II  

Bacillus globigii  

A* G A T C T  

Eco RI  

Escherichia coli RY 13  

G* A A T T C  

Eco RII  

Escherichia coli R245  

* C C A/T G G  

Hae III  

Haemophilus aegyptius  

G G * C C  

Hha I  

Haemophilus haemolyticus  

G C G * C  

Hind III  

Haemophilus inflenzae Rd  

A* A G C T T  

Hpa I  

Haemophilus parainflenzae  

G T T * A A C  

Kpn I  

Klebsiella pneumoniae  

G G T A C * C  

Mbo I  

Moraxella bovis  

*G A T C  

Mbo I  

Moraxella bovis  

*G A T C  

Pst I  

Providencia stuartii  

C T G C A * G  

Sma I  

Serratia marcescens  

C C C * G G G  

SstI  

Streptomyces stanford  

G A G C T * C  

Sal I  

Streptomyces albus G  

G * T C G A C  

Taq I  

Thermophilus aquaticus  

T * C G A  

Xma I  

Xanthamonas malvacearum  

C * C C G G G  

Nazewnictwo 
(Smith i 
Nathans) 

Nazewnictwo 
enzymów 
restrykcyjnych 
opiera się na 
literowych 
skrótach, w 
których 
pierwsza litera 
pochodzi od 
rodzaju bakterii, 
a druga i trzecia 
od gatunku. 
Następna litera 
oznacza szczep 
lub typ, a 
kolejne enzymy 
z danego typu 
lub szczepu 
otrzymują 
liczby rzymskie.  

 

Endonukleazy restrykcyjne II klasy 

 

•Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy, ich geny zwykle 
sąsiadują w genomie 
 
•Substratem jest dwuniciowe DNA - 

dsDNA

 

(nieliczne enzymy mogą przecinać 

określone sekwencje w  jednoniciowym ssDNA).  
 
•W większości przypadków enzymy przecinają obydwa pasma DNA w obrębie 
krótkiej sekwencji (4 -12 nukleotydów), która nazywa się 

miejscem rozpoznania 

(recognition site).  
 

•Większość miejsc rozpoznania jest

 

ścisłym palindromem 

4, 5, 6, 7, 8 nt z 

symetrią rotacyjną

. 

 
Niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt  
np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC 

Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na 
jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania, 

choć nieliczne wymagają 

metylacji 
 

•do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jonów magenzu 

Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje 
częstość trawienia DNA  

np.: (zakładając że G+C = 50%)  

enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok.. 65 
kpz (slużą np. do konstrukcji bibliotek genomowych) 

z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (4

6

) 

(wygodne do klonowania genów) 

4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 
256 bp (4

4

) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA – 

fingerpinting)  

Enzymy rzadkotnące

:  

•Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.: 

SapI  

5’- GCTCTTC -3’ 

Sgf1 

5’-  GCGATCGC -3’ 

 

•Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT 

 

SmaI 

rozpoznaje 5’ – CCCGGG -3’, trawi co 78 kb; 

NotI rozpoznaje 

5’ –GCGGCCGC – 3’ , trawi co 10 MB

. 

Niektóre enzymy pochodzące 
z różnych bakterii rozpoznają 
identyczne sekwencje, są to 
tzw. 

izoschizomery

 

i mogą 

przecinać te sekwencje w 
dokładnie taki sam sposób 

 

 

 

Neoizoschizomery

 

– enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale 

przecinające ją w inny sposób. 
 

Przykłady

: 

 

SmaI  

 

5’…CCC▼GGG…3’ 

XmaI 

 

5’…C▼CCGGG…3’ 

 

SacI 

 

5’…GAGCT▼C…3’ 

SstI 

 

5’…GAGCT▼C…3’ 

 

EcoICRI  

5’…GAG▼CTC…3’ 

Ecl136   

5’…GAG▼CTC…3’ 

 

Lepkie końce

 

mogą być różnej długości (

zwykle są 2 lub 4 nt, ale 

mogą być także 1 lub 3 nt

) i mogą mieć nadmierności typu 5’ lub 3’, 

w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego. 

Mogą też tworzyć tępe końce 

Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy 

wolne końce DNA  

Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5’- fosforanem lub 
3’ –OH (wyjątek np. 

Nci 

I tworzy końce: 3’-fosforan i 5’-OH)

 

Jeśli lepkie końce są komplementarne, 

ligaza

 

może je 

łączyć 

niezależnie od pochodzenia DNA,

 

tworząc formy rekombinacyjne. 

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych 

1. Izolacja i identyfikacja genów 
2. Rekombinowanie i klonowanie genów 
3. Mapowanie fizyczne genomów 
4. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np. 

ustalanie pokrewieństwa 

Mapowanie restrykcyjne 

 
Mapa restrykcyjna

 

zawiera dokładną lokalizację miejsc restrykcyjnych w 

obrębie fragmentu (cząsteczki) DNA.  
 
Najprostszą metodą jest trawienie próbek DNA pojedynczymi enzymami, a 
następnie parami tych enzymów. Produkty trawienia są rozdzielane w żelu 
agarozowym dla określenia wielkości fragmentów, a następnie odtwarza się 
kolejność ułożenia enzymów danym fragmencie lub cząsteczce.  
 

Pojedyncze trawienie zwykle mówi ile jest fragmentów restrykcyjnych w 
badanym DNA, a podwójne trawienie mówi o kolejności i orientacji 
fragmentów. 

 

Warunkiem jest całkowite strawienie fragmentów.  
 

Nakładanie się dwóch identycznych pod względem wielkości fragmentów jest 
widoczne jako jaśniejsze świecenie. 
 

 

 

 

 

Zastosowanie enzymów w diagnostyce

 

chorób genetycznych 

Analiza polimorfizmu DNA  

RFLP 

– 

restriction fragment length polymorphism.  

Różnice w dłg. 

fragmentów restrykcyjnych tworzonych po cięciu DNA restryktazami II 
typu.  
Wykrywa się głównie przez trawienie DNA amplifikowanego w reakcji 
PCR i elektroforezę agarozową produktów reakcji (PCR-RLFP). 

Polimorfizm restrykcyjny  może być stosowany do oznaczania ojcostwa 

Normalny gen globiny

 

 

Zmutowany gen globiny 

 
___________________ 

 

___________________ 

____CTG

A

G_________                  ______CTG

T

G_______ 

____GAC

T

C_________                   _____ GAC

A

C_______ 

 
 

 

Trawienie enzymem Dde I 

 

 

 

   

 
 

 

  Elektroforeza agarozowa 

 
 
 

Dwa

 

fragmenty o dłg: 

         

Jeden

 

fragment o dłg. 376 bp 

201 i 175 bp 
 

Wykrywanie mutacji przy pomocy enzymów restrykcyjnych 

np.: anemia sierpowata