0105; 23.03.2009, ćwiczenia nr 5., - Jąderko, budowa, funkcja, upakowanie DNA
w chromosomy, metody badan cytogenetycznych .

Jąderko

−

najlepiej widoczne w interfazie

−

odkryte już dawno

−

chromatyna jąderkowa jest elementem najbardziej stałym (jedyny stały element jąderka)

−

kuliste, owalne, rozpłaszczone, nieregularne

−

w ludzkiej komórce można znaleźć do 10 jąderek

−

jest wysoce wyspecjalizowaną wewnątrzkomórkową organellą

−

jedna z najmniej stabilnych struktur komórki

−

liczba jąderek determinowana jest przez liczbę chromosomów z NOR (nuclear organisacion regions) (może
być od niej mniejsza zmienia się znacznie, zależnie od organizmu, typu komórki oraz jej stanu
fizjologicznego)

−

wielkość jąderek zależy od aktywności metabolicznej komórki

−

jeśli komórka jest aktywna metabolicznie to i wielkość jąderka będzie większa

−

co jakiś czas dochodzi do eksportu tych „ziarenek” czyli prekursorów z jąderka

−

miejsce syntezy rybosomowych prekursorów pre-rRNA oraz montażu prerybosomowych cząstek RNP(pre-
RNP)

−

Jest niestabilne, zanika w profazie a pojawia się w telofazie mitozy

−

Jest ich różna liczba w jądrze ale maksymalnie może ich być 10 – w interfazie wszystkie się ze sobą zlewają

−

Jego wielkość zależy od tego czy w komórce przeważają reakcje anaboliczne czy kataboliczne

−

Jąderko nie ma otaczającej błony

−

Jąderka komórek nowotworowych mają duże rozmiary i sznurowate struktury

−

Typy morfologiczne jąderek: zwarte, siateczkowate, spoczynkowe, segregowane

−

W skład jąderka wchodzą: chromatyna, włókienka, ziarna, wakuole, centra fibrylarne i białka

−

Chromatyna – jest jedyną stałą strukturą, jest ona zdekondensowaną formą satelitów i okolic przewężeń
wtórnych (regionów jąderkotwórczych – NOR) chromosomów 13,14,15,21,22

−

Wyróżniamy chromatynę:

−

Okołojąderkową – otacza jąderko ale nie wchodzi w jego skład

−

Wewnątrzjąderkową – in. przegrodowa – tworzy w jąderku rodzaj przegrody oddzielającej inne składniki

−

Jąderkową transkrypcyjną – charakteryzuje się dużym rozluźnieniem struktury, ma bardzo duży potencjał
transkrypcyjny

−

Ziarna – to prekursory podjednostek rybosomów, występują w skupiskach bądź rozproszone, powstają poprzez
fragmentację włókien

−

Włókienka – mogą być rozrzucone lub tworzyć skupiska, składają się głównie z RNA

−

Centra fibrylarne – miejsca nieaktywne transkrypcyjnie, bez nRNA

−

Wakuole – przejaśnienia których zadaniem jest synteza składnika globularnego, kiedy występuje nadmiar
fibrylarnego

−

Białka – białka swoiste związane są z wytwarzaniem rybosomów:

−

polimeraza RNA I – katalizuje transkrypcję rRNA z rDNA

−

nukleolina – odpowiada za łączenia podjednostek rybosomów

−

białka B23 (numatryna) – w transporcie rybosomów do cytoplazmy

−

fibrylaryna – odpowiada za obróbkę hnRNA

−

białka AG-NOR – mają właściwości reukujące soli srebra

Składniki ultrastrukturalne jąderka:

−

centra fibrylarne, inaczej włókniste (FC, fibrillar centers)

−

gęsty składnik fibrylarny, inaczej: włóknisty (DFC, dense fibrillar component)

−

składnik granularny, inaczej: ziarnisty (GC, granular component)

−

wakuole jąderkowe (NI, nucleolar interstices)

−

chromatyna zasocjowana z jąderkiem (NAC, nucleolus assiociated chromatin)

−

nukleolonema

−

organizator jąderkowy (NOR)

−

macierz jąderkowa

Charakterystyka niektórych struktur jąderkowych:

Element strukturalny

Lokalizacja

Funkcje

FC

DFC

GC

RNM

NAC

strefa centralna jąderek zanurzona w DFC

otoczenie FC

strefa korowa jąderka

warstwa korowa i nukleoplazma

strefa peryferyjna i śródjąderkowa

montowanie i rozmontowywanie
chromatyny zawierającej rDNA

transkrypcja rDNA i produkowanie
włókien pre-rRNP zawierających pre-
rRNA

przetwarzanie prerybosomów w duże i
małe cząstki rRNP

konstrukcja strukturalnej podpory

oddziaływanie z otaczającą chromatyną

Chromatyna jąderkowa:

−

zdekondensowana forma chromosomów 13,14, 15, 21,22 pary, a ściślej ich satelitów i przewężeń wtórnych,
któe są regionami organizuyjaącymi jąderko – NOR

Postaci Chromatyny jąderkowej:

−

chromatyna okołojąderkowa (odpowiedzialna za przepływ informacji)

−

chromatyna wewnątrzjąderkowa (tkz. przegrodowa – żeby w poszczególnych częściach jąderka mogły
zachodzić rożne procesy; tworzy przedziały w jąderku)

−

chromatyna transkrypcyjna (duży potencjał transkrypcyjny)

Centra fibrylarne:

−

przestrzenie wypełnione mniej lub bardziej skondensowanymi fibrylami chromatynowymi

−

zawierają rDNA i wykazują aktywność polimerazy RNA I

−

są obszarami nieaktywnymi transkrypcyjnie ponieważ nie wykazano w nich obecności RNA ani włączenie
radioaktywnych prekursorów RNA

Gęsty składnik fibrylarny:

−

zawiera RNA i stanowi miejsce intensywnej transkrypcji rRNA

−

otacza w formie muszli centra fibrylarne

−

występuje w postaci pasm lub zajmuje centralną część (w jąderkach tkz. Zwartych)

Składnik granularny:

−

ziarnistości o średnicy ok. 15-20 nm

−

zbudowane z rybonukloprotein

−

są prekursorami rybosomów cytoplazmatycznych

−

zawierają one rRNA i białka rybosomowe

Wakuola jąderkowa:

−

występuje w jąderkach, w których nastąpił gwałtowny eksport składnika granularnego, nie zrekompensowany
przez odpowiednio szybką syntezę nowych prekursorów rybosomów

−

stanowi jasną przestrzeń o kształcie zbliżonym do kulistego

−

znajdują się tam luźno rozmieszczone fibryle i ziarenka

Macierz (matriks) jąderkowa:

−

materiał budulcowy, podporowy

−

składa się z białek szkieletowych

−

zanurzone są tam wymienione wyżej składniki jąderka

Białka jąderka:

−

jąderko jest zbudowane głównie z białek, które stanowi 80-90% jego masy, 3-13% RNA i 3-18% DNA

−

białka swoiste i nieswoiste, te pierwsze związane są z wytwarzaniem rybosomów: polimeraza RNA I,
nukleolina, białko B23 (numatryna), fibrylarna, białka Ag-NOR

Najważniejsze białka jąderkowe.

Nazwa

Funkcja

polimeraza RNA I

B23; NO38

numatryna

C23

fibrylaryna

rybocharyna

transkrypcja rDNA

dojrzewanie rRNP

regulacja komórkowej mitogenezy

aktywacja transkrypcji rDNA, pakowanie pre-rRNA,
montowanie rybosomów

dojrzewanie pre-rRNA

dojrzewanie podjednostek 60S i transport jądrowo-
cytoplazmatyczny

Funkcja jąderka:

−

miejsce syntezy rybosomowych prekursorów pre-rRNA jego dojrzewania oraz montażu, rRNA syntetyzowany
jest na matrycy DNA (rDNA)chromatyny jąderek

−

zawiera ono maszynerię wymaganą do transkrypcji wielokrotnych kopii prekursorów genów rybosomowych
(ok,. 45S u ssaków 40S u płazów)

−

ponadto posiada molekularne wyposażone niezbędne do przetworzenia tych prekursorów w ostateczne
cząsteczki 18S; 5,8S i 28S rRNA

−

zawiera również białka, które łączą się z pre-rRNA i rRNA, w tym 5SrRNA tworząc RNPs będące
prekursorami mniejszej większej podjednostki dojrzałego rybosomu

−

Synteza rRNA i jego obróbka

−

RRNA (45S) powstaje na matrycy DNA, odcinki rDNA znajdują się w regionach NOR i charakteryzują się
wysoką powtarzalnością sekwencji nukleotydów

−

Polimeraza RNA I wytwarza pierwotny transkrypt RNA (45S), który jest cięty na fragmenty 28S, 5,8S i 18S. Z
fragmentów 28S i 5,8S i 48 białek tworzy się szkielet dużej podjednostki, mała podjednostka łączy się z 33
białkami

−

Podjednostki są transportowane do cytoplazmy gdzie ulegają dalszej reorganizacji tworząc mała (40S) i dużą
podjednostkę rybosomu (60S)

Typy morfologiczne jąderek:

−

jąderka zwarte

−

jąderka siateczkowate (występują w większości komórek nowotworowych)

−

jąderka spoczynkowe (zahamowanie aktywności transkrypcyjnej)

−

jąderka segregowane (zahamowanie aktywności transkrypcyjnej)

W formowaniu się jąderka uczestniczą pętla chromatyny, zawierające geny rRNA, a pochodzące z 10 różnych
chromosomów interfazowych.

Chromosomy

Budowa chromosomu:

−

ramiona chromosomu

−

przewężenie pierwotne

−

przewężenie wtórne

−

satelita

−

chromatydy

−

chromomery

−

telomery

Podział chromosomów ze względu na występowanie przewężenie pierwotnego (centromeru):

−

metacentryczne

−

submetacentryczne

−

akrocentryczne

−

telocentryczne (nie występują u ludzi)

Grupy chromosomów:

−

Grupa A - duże, metacentryczne (pary 1-3)

−

Grupa B - duże, submetacentryczne (pary 4 i 5)

−

Grupa C - średnie, submetacentryczne (pary 6-12 oraz chromosom X)

−

Grupa D - średnie, akrocentryczne (pary 13-15)

−

Grupa E - małe, submetacentryczne (pary 16-18)

−

Grupa F - małe, metacentryczne (pary 19-20)

−

Grupa G - małe, akrocentryczne (pary 21-22 oraz chromosom Y)

Metody prążkowe:

−

GTG (z udziałem barwnika Giemsy)

−

RHG (z udziałem barwnika Giemsy)

−

CBG (z udziałem barwnika Giemsy)

−

THG (z udziałem barwnika Giemsy)

−

NOR (wysrebrzanie; wybarwiają się białka Ag-NOR)

Metody prążkowe posiadają pewną niedogodność – jest zbyt małą rozdzielczość żeby rozstrzygnąć niektóre sytuację jak
na przykład mikrodelecje.

Barwienie chromosomów:

−

Najczęstsze metody dotyczą sprawdzenia występowania na chromosomach prążków G (GTG), Q (QFQ),
R(RBA), C(CGB)

−

Prążki G – wybarwia się enzymami proteolitycznymi np. trypsyną, otrzymujemy regiony ciemne
poprzedzielane jasnymi. Ciemne prążki G odpowiadają regionom o dużej ilości par zasad A-T, prążki jasne
odpowiadają miejscom z dużą zawartością par G-C

−

Prążki Q – używa się fluorochromy: mające zdolność do jonowego wiązania się z DNA np. oranż akrydynowy
lub/i fluorochromy dołączające się do podwójnego łańcucha DNA; silnie fluoryzujące prążki mają dużo par A-
T a wygaszona fluorescencja świadczy o zawartości par C-G

−

Prążki C – wybarwia się je barwnikiem Giemsy w obszarze heterochromatyny centromerowej gdzie znajduje
się heterochromatyna konstytutywna, wybarwiają się te rejony na ciemno

−

Prążki R – stanowią odwrotność prążków G, tutaj ciemne prążki R wskazują na dużą zawartość par G-C a
jasne prążki mają dużo par A-T

Inne rodzaje chromosomów:

−

chromosomy olbrzymie, genetyczne chromosomy powstające w wyniku wielu kolejnych replikacji zespołu
chromosomów bez rozejścia się replik do nowych komórek (jak to odbywa się w mitozie). Zob. też
politeniczne chromosomy.

−

chromosomy politeniczne (ang. polytene chromosomes) - chromosomy, które powstają w wyniku
kilkakrotnej replikacji chromosomowego DNA, po której nie następują zwyczajowe podziały komórkowe.
Powstałe w ten sposób chromatydy nie rozchodzą się (nie ulegają dekondensacji). Chromosomy politeniczne
zostały pierwotnie zaobserwowane przez Balbianiego w 1881 roku w gruczołach ślinowych ochotek
Chironomus ale ich prawdziwa natura została odkryta dopiero w latach 30. podczas badań nad genetyką
drozofili. Tkz. Pierścienie Balbianiego czy „puffy Balbianiego”

−

chromosomy szczoteczkowe - duże chromosomy zawierające liczne pętle boczne, będące miejscem
intensywnej syntezy RNA, pętle nadają chromosomom wygląd "szczoteczki", występują podczas rozwoju
oocytów niektórych zwierząt (ryb, płazów, gadów, ptaków).

Metoda Feulgena:

−

wynaleziona przez Roberta Feulgena

−

pozwala na selektywne barwienie DNA lub materiału chromosomowego

−

oparta na kwasowej hydrolizie DNA, które barwi się na czerwono.

−

wykorzystywana do półilościowego lub ilościowego oznaczania DNA w tkankach

−

reakcja przebiega w dwóch etapach

−

najpierw badaną próbkę poddaje się działaniu HCl przez 8-10 min. w podwyższonej temperaturze. następnie
natychmiast traktuje się ją odczynnikiem Schiffa w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min

−

do momentu gdy tkanka nabierze purpurowego zabarwienia

−

dalej materiał jest ugniatany w obecności acetoorceiny

Kolchicyna

−

organiczny związek chemiczny z grupy alkaloidów o silnie trującym działaniu

−

dawka śmiertelna to ok. 1 mg/kg masy ciała.

−

w dawkach terapeutycznych wykazuje działanie przeciwzapalne, antymikrotubularne

−

zatrzymując podział komórki na etapie metafazy poprzez uniemożliwienie wytworzenia mikrotubul wrzeciona
kariokinetycznego i zmniejszające wytwarzanie kwasu moczowego

−

oddziaływanie na cytoszkielet

−

upośledzanie segregacji chromosomów podczas podziału komórki co doprowadza do powstania komórek o
zduplikowanym garniturze chromosomów

W ten sposób daje się stosunkowo łatwo uzyskać rośliny poliploidalne, interesujące zarówno ze względów użytkowych
jak i teoretycznych. Kolchicyna jest stosowana w leczeniu napadów zapalenia stawów w przebiegu dny moczanowej
oraz w leczeniu rodzinnej gorączki śródziemnomorskiej (ang. FMF).