Nowiny Lekarskie 2007, 76, 1, 70-72
MAGDALENA RUTKOWSKA, MARIA ISKRA
HISTORIA BADAŃ NAD WPŁYWEM STRESU OKSYDACYJNEGO
NA MODYFIKACJĘ BIAŁEK
HISTORY OF THE EFFECT OF OXIDATIVE STRESS ON MODIFICATION OF PROTEINS
Zakład Chemii Ogólnej
Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Maria Iskra
Streszczenie
Artykuł ukazuje historię badań nad wpływem stresu oksydacyjnego i reaktywnych form tlenu na utleniającą modyfikację białek od 1906 roku
do współczesności. Szczególna uwaga poświęcona została mechanizmom powstawania pochodnych karbonylowych w uszkodzonych wolnych
aminokwasach i białkach.
SŁOWA KLUCZOWE: historia stresu oksydacyjnego, reaktywne formy tlenu, utleniająca modyfikacja białek.
Summary
This paper presents a history of the effect of oxidative stress, and reactive oxygen species on oxidative modification of proteins since 1906 until
now.
KEYWORDS: history of oxidative stress, reactive oxygen species, oxidative modification of proteins.
Historia badań
nad wpływem stresu oksydacyjnego
na modyfikację białek
Tlen
Pojęcie stresu oksydacyjnego pojawiło się w świecie
nauki w połowie lat 80-tych ubiegłego stulecia. Jednak
procesy związane z tym zagadnieniem były znane i
badane dużo wcześniej. Pojęcie stresu oksydacyjnego
jest ściśle związane z tlenem i jego reaktywnymi
formami (RFT). Jako pierwiastek wszechobecny, jest
on niezbędny komórkom do wytwarzania energii w
procesach utleniania, z drugiej strony, jest czynnikiem,
który je również uszkadza. Tlen obecny w atmosferze
jest cząsteczką trypletową, co oznacza, że jego orbitale
molekularne posiadają dwa niesparowane elektrony o
tym samym spinie [1]. Konsekwencje tego są niezwykle
istotne, ponieważ nie ma praktycznie drugiej cząstki, która
mogłaby sparować takie dwa elektrony. Jedynie 4-elektro-
nowa redukcja jest procesem całkowitej redukcji cząsteczki
tlenu, w wyniku której powstają dwie cząsteczki wody.
Niestety, bardzo często ma miejsce niepełna, częściowa
redukcja tlenu poprzez przyłączenie jednego elektronu,
co w rezultacie owocuje powstaniem anionorodnika
ponadtlenkowego, inicjującego powstawanie szeregu
aktywnych pochodnych oraz niebezpiecznych uszkodzeń
cząsteczek biologicznych. Około 2% tlenu jest
przekształcana w organizmie do RFT z czego w ciągu
sekundy 1/100 uszkadza związki biologicznie czynne, a
w szczególności białka [1, 2].
Stres oksydacyjny i wolne rodniki
Historia badań nad wolnymi rodnikami sięga roku
1948, kiedy to Stein i Weiss opublikowali w Nature
wyniki badań wskazujące, że podczas radiolizy wody
generowany jest rodnik hydroksylowy, a kilka lat
później w 1954 roku Commoner zidentyfikował go
w żywej materii [3, 4]. Chemik Pryor prowadzący w
latach 50-tych badania kliniczne nad wolnymi rodnikami
sugerował, że wytwarzane są one w organizmie w czasie
przebiegu szeregu procesów biochemicznych lub pod
wpływem czynników zewnętrznych [5]. Nie skłaniał się
on jednak w kierunku teorii Harmana, który w 1956 roku
wysunął hipotezę jakoby organizmy żywe generowały
wolne rodniki tlenowe przy okazji enzymatycznych
reakcji redoks [6]. Sugerował, że enzymy biorące udział
w tych reakcjach zawierają żelazo, ponadto uważał,
że śladowe ilości jonów żelaza lub innych metali
katalizują reakcje utleniania in vivo. Harman twierdził,
że wolne rodniki przyspieszają procesy starzenia
oraz powstawanie schorzeń degeneracyjnych [6].
Większość z tych przypuszczeń potwierdziła się w ciągu
kilkudziesięciu następnych lat. Identyfikacja dysmutazy
ponadtlenkowej (SOD) przez Fridovicha i McCorda w
1968 roku uwiarygodniła wolnorodnikową teorię starzenia
się Harmana [7]. Badając redukcję cytochromu c przez
oksydazę ksantynową stwierdzili, że nie jest ona następstwem
bezpośredniego kontaktu obu białek, lecz zachodzi pod
wpływem uwalnianego przez oksydazę ksantynową
anionorodnika ponadtlenkowego. Odkrycie to dowiodło
71
Historia badań nad wpływem stresu oksydacyjnego na modyfikację białek
w pełni, że głównymi utleniaczami komórki są rodniki
tlenowe, szczególnie rodnik hydroksylowy tworzący się w
reakcji Fentona [8] przy udziale jonów metali przejściowych.
Dopiero rok 1985 przyniósł definicję stresu oksydacyjnego
utworzoną przez Siesa, opisującą stan fizjologiczny związany
z wytwarzaniem wolnych rodników i reaktywnych form
tlenu. Obecność tych czynników powoduje zaburzenia
równowagi prooksydacyjnej i antyoksydacyjnej organizmu
z przewagą stanu prooksydacyjnego [9]. Powoduje to w
efekcie powstanie niekontrolowanych zmian prowadzących
do szeregu komplikacji w funkcjonowaniu organizmu, a
nawet do jego degeneracji.
Utleniająca modyfikacja białek
Wolne aminokwasy i białka są niezwykle wrażliwe na
utlenianie przez RFT znajdujące się w atmosferze, generowane
jako produkty uboczne w procesach metabolicznych lub
tworzących się podczas ekspozycji na promieniowanie
X-, γ- lub UV [10]. Zainteresowanie mechanizmami tych
procesów niezwykle wzrosło po opublikowaniu w Nature
wyników badań identyfikujących rodniki tlenowe w żywej
materii w połowie lat 50-tych [4].
Badania nad uszkodzeniem białek prowadzone były
już w pierwszej dekadzie XX wieku. Dużą część wiedzy
chemicznej dotyczącej utleniania białek powstała dzięki
Dakinowi, który w roku 1906 badał mechanizmy zmian,
jakim ulegają produkty degradacji białek w organizmie
zwierzęcym [11]. Prowadził on proste eksperymenty na
leucynie i innych aminokwasach poddając je działaniu
jonu metalu przejściowego w obecności nadtlenku wodoru,
reakcji Fentona. Dakin zauważył, że aminokwasy ulegają
transformacji do pochodnych z grupą karbonylową.
Przypuszczał, że w organizmie żywym reakcje te
katalizowane są przez specyficzne enzymy [11]. Ze
względu na stan ówczesnej wiedzy nie brał pod uwagę
roli jaką odgrywają w nich RFT. W roku 1925, wkrótce po
odkryciu glutationu, Hopkins badając jego właściwości
pro- i antyoksydacyjne zaobserwował, że obecność
jonów metali przejściowych sprzyja charakterowi
prooksydacyjnemu glutationu, a tym samym – inaktywacji
białek [12]. Rok 1954 przyniósł nowe fakty związane
z rodnikiem hydroksylowym (OH
•
) w żywej materii,
co zachęciło wielu badaczy do podążenia tym śladem.
Wpływ OH
•
na modyfikacje aminokwasów aromatycznych,
w tym tyrozyny i fenyloalaniny, badali w tym czasie
Dale i Jayson [13, 14]. Wyniki ich badań wskazywały
na powstanie hydroksypochodnych aminokwasów
aromatycznych. Na początku lat 60-tych Garrison
rozpoczął ilościowe badania utleniającej modyfikacji
białek. Zaproponował mechanizm, utleniającego rozpadu
wiązania peptydowego w łańcuchu bocznym tzw. peptide
α-amidation, z utworzeniem grup amidowych [15, 16].
Uważa się, że schemat ten występuje najczęściej podczas
fragmentacji łańcucha polipeptydowego. W roku 1963
Kopodlova i współpracownicy odkryli, że utlenianie
alifatycznych aminokwasów rodnikiem hydroksylowym
również prowadzi do powstania hydroksypochodnych
w łańcuchu bocznym aminokwasu [17]. W 1976
roku Aeschelbach wykazał, że podczas utleniania
aromatycznych aminokwasów w tym tyrozyny, dochodzi
do powstania rodnika fenoksylowego, a także rodników
tyrozylowych, które mogą ulegać dalszym reakcjom, np.
tworząc dityrozynę i inne związki [18]. Sytuacja ta ma
miejsce szczególnie wtedy, gdy nie są obecne związki
redukujące (tiole lub wit. E), które mogłyby zregenerować
tyrozynę. Lata 80-te przyniosły ogromną liczbę badań
nad utleniającą modyfikacją białek, prowadzonych
na różnych płaszczyznach tego zagadnienia. Szcze-
gólna uwaga poświęcona została mechanizmom
powstawania pochodnych karbonylowych, nad którymi
pracowali w latach 1983–1990 Levine, Stadtman i
Amici. Badali oni mechanizm utleniania łańcuchów
bocznych aminokwasów w białkach katalizowany
jonami metali (MCO, metal–catalyzed oxidation) [10,
19, 20]. Dowiedli, że modyfikacja łańcucha z lizyną,
argininą, tyrozyną lub proliną prowadzi do powstania
karbonylowych pochodnych tych aminokwasów. Badania
prowadzone na E. coli wykazały, że łańcuchy boczne
aminokwasów w enzymie syntetaza glutaminowa są szcze-
gólnie wrażliwe na utlenianie jonami metali [21].
Niezwykle ważną rolę odegrały badania zainicjowane
przez Cerami i Lee, którzy śledzili powstawanie grup
karbonylowych w reakcji pierwszorzędowej grupy
aminowej lizyny z cukrami redukującymi lub ich
pochodnymi [22]. Reakcja ta przebiega drugorzędowo z
etapem pośrednim, w którym tworzy się zasada Schiffa
a produkt końcowy, nazwany produktem Amadoriego,
jest związkiem ketoaminowym. Badania przeprowadzone
w latach 1986–1987 przez Gutteridge’a i innych nad
utleniającą modyfikacją białek przez MCO wyjaśniają,
że katalityczne właściwości żelaza i miedzi są powodem,
dla którego komórki posiadają białka chelatujące jony
metali, np. ferrytyna i transferyna, redukujących stężenia
tych reaktywnych metali [23]. W roku 1995 Koster
zaobserwował u ludzi, że zawartość żelaza wzrasta wraz z
wiekiem [24]. Sugeruje się, że proces ten może zwiększać
ryzyko utleniającego uszkodzenia białek a w rezultacie
przyspieszenia rozwoju chorób degeneracyjnych i procesu
starzenia się.
Pochodne karbonylowe stały się w ciągu ostatnich
lat jednym z najczęściej stosowanych markerów stresu
oksydacyjnego, a dokładniej – utleniającej modyfikacji
białek [25]. Przeprowadzone badania wskazują na istotną
rolę uszkodzenia białek w etiologii szeregu chorób.
Wzrost stężenia grup karbonylowych zaobserwowano w
miażdżycy, zapaleniu jelit, chorobie Alzheimera, zespołach
przyspieszonego starzenia oraz wielu innych [25–30].
Dalsze badania nad mechanizmami uszkodzenia białek oraz
udoskonalanie metod oznaczania produktów utleniania są
prowadzone w wielu laboratoriach na całym świecie.
72
Magdalena Rutkowska i inni
Piśmiennictwo
1. Beckman K., Ames B.: The free radical theory of aging ma-
tures. Physiol. Rev., 1998, 78, 2, 547-581.
2. McCord J.: The evolution of free radicals and oxidative stress.
Am. J. Med., 2000, 108, 652-659.
3. Stein G., Weiss J.: Chemical effects of ionizing radiations. Na-
ture, 1948, 161, 650.
4. Commoner B., Townsend J., Pake G.: Free radicals in biologi-
cal materials. Nature, 1954, 174, 689-691.
5. Pryor W.: Free radical reactions and their importance in bio-
chemical systems. Fed. Proc., 1953, 32, 1862-30.
6. Harman D.: Aging: a theorybased on free radical and radiation
chemistry. J. Gerontol., 1956, 2, 298-300.
7. McCord J., Fridovich I.: Superoxidae dismutase. An enzymic
functionfor erythrocuprein (hemocuprein), J. Biol. Chem.
1969, 244, 6049-6055.
8. Fenton J.: Oxidation of tartaric acid in presence of iron.
J. Chem. Soc., 1894, 65, 899-910.
9. Sies H., Cadenas E.: Oxidative stress:damage ti intact cells and
organs; Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1985, 1152,
617-31.
10. Stadtman E., Levine R.: Free radical-mediated oxidation of
free amino acids and amino acisd residues in proteins. Amino
Acids, 2003, 25, 207-218.
11. Dakin H.: The oxidation of amido-acids with theproduction of
substances of biological importance. J. Biol. Chem., 1906, 1,
171-176.
12. Hopkins F.: Glutathion. Ist influence in the oxidation of fats and
proteins. Biochem. J. 1925, 19, 787-819.
13. Dale W., Davies J., Gilbert C.: The formation of hydrogen
peroxide by alpha-radiation in the presence of the enzyme car-
boxypeptidase. Biochem. J., 1952, 51, 268-70.
14. Jayson G., Scholes G., Weiss J.: Formation of formylkynuren-
ine by the action of x-rays on tryptophan in aqueous solution.
Biochem. J., 1954, 57, 386-390k.
15. Garrison W., Jayko M., Bennet W.: Radiation-induced-
oxidation of protein in aquueous solution. Radiat. Res., 1962,
16, 483-502.
16. Garrison W.: Reaction mechanisms in radiolysis of
peptides,polipeptides and proteins. Chem. Rev., 1987, 87, 381-
398.
17. Kopodlova J., Liebster J., Babicky A.: The mechanism of ra-
diation chemical degradationof amino acids. Int. J. App. Radiat.
Isot., 1963, 14, 455-460.
18. Aeschelbach R., Amado R., Neukom H.: Formation of dityro-
sine cross-links in proteins by oxidation of tyrosine residues.
Biochim. Biophys. Acta, 1976, 439, 291-301.
19. Stadtman E.: Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: bio-
chemical mechanism and biomedical concequences. Free. Rad.
Biol. Med., 1990, 9, 315-325.
20. Amici A., Levine R., Stadtman E.: Conversion of amino acids
residues in proteins and amino acids homopolymers to car-
bonyl derivatives by metal-catalyzed oxidation reaction.
J. Biol. Chem., 1989, 264, 3341-3346.
21. Levine R.: Oxidative modification of gluthamine synthetase.
J. Biol. Chem., 1983, 258-11828-11833.
22. Lee A., Cerami T.: Handbook of the biology of aging, 3rd edn;
Academic Press, New York, 1990, 116-130.
23. Halliwell B., Gutteridge J.: Oxygen free radicals and iron in
relation to biology and medicine: some problems and concepts.
Arch. Biochem. Biophys., 1986, 246, 501-514.
24. Koster J., Sluiter W.: Is increased tissue ferritin a risk factor for
atherosclerosis and ischaemic heart disease? Br. Heart J., 1995,
73, 208-209.
25. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D. et al.: Protein carbonyl
groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta,
2003, 329, 23-38.
26. Fu S., Davies M., Stocker R. et al.: Evidence for roles of radi-
cals in protein oxidation in advanced human atherosclerotic
plaque. Biochem. J., 1998, 333, 519-525.
27. Berlett B., Stadtman E.: Protein oxidation in aging, disease, and
oxidative stress. J. Biol. Chem., 1997, 272, 20313-6.
28. Smith C., Carney J., Starke-Reed P. et al.:: Excess brain protein
oxidation and enzyme dysfunction in normal aging and in Al-
zheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10540-
4.
29. Dominguez C., Ruiz E., Gussinye M. et al.: Oxidative stress
at onset and in early stages of type 1 diabetes in children and
adolescents. Diabetes Care, 1998, 21, 10, 1736-42.
30. Lih-Brody L., Powell S., Collier K. et al.: Increased oxidative
stress and decreased antioxidant defenses in mucosa of inflam-
matory bowel disease. Dig. Dis. Sci., 1996, 41, 2078-86.
72