Reaktywne formy tlenu (RFT)
Reactive oxygen species (ROS)
Stres oksydacyjny w komórkach roślinnych, H
2
O
2
jako cząsteczka sygnalna
Reaktywne formy tlenu (RFT)
Reactive oxygen species (ROS)
Stres oksydacyjny w komórkach roślinnych, H
2
O
2
jako cząsteczka sygnalna
Cząsteczki sygnałowe
– reaktywne formy tlenu (ROS):
H
2
O
2
(nadtlenek wodoru)
O
2
-.
(rodnik ponadtlenkowy)
OH
-
(rodnik hydroksylowy)
– reaktywne formy azotu (RNS):
NO (tlenek azotu)
ONOO
-
(rodnik peroksynitrylowy)
GSNO (nitrozoglutation)
Co to są reaktywne formy tlenu ?
• Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem: reagując ze związkami
organicznymi, utlenia je, pobierając od nich elektrony, a sam
ulega redukcji.
• Całkowita redukcja O
2
oznacza przyłączenie 4 protonów i
4 elektronów, powstają wówczas 2 cząsteczki H
2
O.
• Cząsteczka tlenu, nie zawsze ulega pełnej, 4-elektronowej
redukcji.
Rodnik
– atom lub cząsteczka zdolna do
samodzielnego istnienia, mająca 1 lub więcej
niesparowanych elektronów.
Wolne rodniki
są reaktywne, ponieważ dążą do
sparowania elektronów (pozbycia się nadmiaru, lub
przyłączenia dodatkowego elektronu).
Reaktywne formy tlenu
są produktami kolejnych
stopni redukcji cząsteczki tlenu.
Reaktywne formy tlenu (ROS)
• wolne rodniki
• nie
rodnikowe
pochodne tlenu
O
2
.-
ponadtlenkowy
.
OH
hydroksylowy
H
2
O
2
nadtlenek wodoru
O
3
ozon
1
O
2
tlen singletowy
Anionorodnik ponadtlenkowy
O
2
-
–Stosunkowo szybko
reaguje ze związkami zawierającymi grupy tiolowe, i białkami
zawierającymi centra żelazowo-siarkowe
Szybko reaguje ze związkami redukującymi: askorbinianem, NADH,
jonami metali Fe i Cu, a więc też z metaloproteinami.
Jest dość trwały w fizjologicznym pH, może dyfundować na znaczne
odległości, jak też przenikać przez błony komórkowe (niezbyt łatwo).
Rodnik hydroksylowy •HO
-
jeden z najbardziej
reaktywnych utleniaczy.
Ma bardzo wysoki potencjał redoks, a więc silne właściwości utleniające.
Reaguje praktycznie ze wszystkimi substancjami występującymi w
organizmie i to bardzo szybko.
Nadtlenek wodoru H
2
O
2
– Cząsteczka sygnalna
Nie jest zbyt reaktywną formą tlenu
. Przy pH zbliżonym do
obojętnego może utleniać grupy tiolowe, indolowe,
imidazolowe, fenolowe i tioestrowe.
Biologicznie istotne znaczenie ma utlenianie grup tiolowych
oraz utlenianie jonów metali przejściowych (Fe
2+
do Fe
3+
i Cu
+
do Cu
2+
), co prowadzi do powstawania rodnika
hydroksylowego.
Fe
2+
+ H
2
O
2
→
•
OH + OH
-
+ Fe
3+
Cu
+
+ H
2
O
2
→
•
OH + OH
-
+ Cu
2+
H
2
O
2
–
jest stosunkowo mało reaktywny, łatwo
przenikający przez błony biologiczne, może się
pojawiać w dużych odległościach od miejsca
powstania.
Ozon
Ozon w stratosferze (15-50 km od powierzchni Ziemi)
pochłania promieniowanie nadfioletowe C (200-280 nm) i
nadfioletowe B (280-320)
Ozon w atmosferze zadymionych miast – jako
składnik smogu - ma działanie niszczące jak inne
reaktywne formy tlenu
Niektóre efekty działania ROS na komórki i ich
składniki:
• Utlenianie związków niskocząsteczkowych: glutation,
askorbinian, NADH
• Inaktywacja enzymów
• Inaktywacja białek transportowych
• Uszkodzenia kwasów nukleinowych
• Peroksydacja lipidów błonowych
• Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej
• Zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca
2+
• Zaburzenia struktury cytoszkieletu (polimeryzacja aktyny,
rozerwanie mikrofilamentów)
• Powstawanie mutacji
Miejsca produkcji ROS w komórce
roślinnej
Chloroplasty
Mitochondria
Peroksyzomy
, Endoplazmatyczne Reticulum,
Glioksyzomy
Błona komórkowa (oksydazy NADPH),
Apoplast (peroksydaza)
Główne źródła ROS w fotosyntetyzującej
komórce mezofilowej roślin o fotosyntezie C3
Uproszczony schemat powstawania ROS w komórce mezofilowej rośliny o
fotosyntezie C3 zmodyfikowane w.g. Ślesak i inni 2007 Acta Biochim. Pol. 54: 39-50.
mitochondrium
peroksysom
chloroplast
PSII
PSI
O
2
•-
H
2
O
2
SOD
Wiązanie CO
2
fotooddychanie
glikolan
gliksalan
glicyna
H
2
O
2
glicyna
seryna
NADH
NADH
Cykl
TCA
O
2
•-
H
2
O
2
Oksydaza
NADPH
O
2
•-
H
2
O
2
Peroksydazy ściany komórkowej
światło
Ściana komórkowa
4030 nmol m
-2
s
-1
10 000 nmol m
-2
s
-1
200 nmol m
-2
s
-1
Stężenie ROS w komórce roślinnej
• Produkcja ROS w
nie pobudzanych
komórkach
240 µM s
-1
O
2
-
• W czasie stresu
produkcja ROS
240-720 µM s
-1
O
2
-
• stężenie H
2
O
2
0,5 µM
• stężenie H
2
O
2
5 -15 µM
W czasie jakich reakcji powstają ROS w
odpowiedzi na stres ?
• Fotooddychanie
• Oddychanie mitochondrialne
• Oksydaza NADPH
(błony komórkowe, plazmalema)
• Peroksydazy w apoplaście
• Peroksydacja lipidów
Stres oksydacyjny to stan
braku równowagi
pomiędzy produkcją
reaktywnych form tlenu
(ROS), a zdolnością do
ich szybkiej detoksykacji,
detoksykacji powstających
toksycznych produktów
lub naprawy wyrządzonych
szkód.
Nadprodukcja i
nagromadzanie ROS
powoduje oksydacyjne
uszkodzenia składników
komórki, a szczególnie
białek, lipidów i DNA.
Co to jest stres oksydacyjny?
Mechanizmy
detoksykacji ROS i
naprawy uszkodzeń
ROS
Stres
oksydacyjny
Zmodyfikowane w.g. Bartosz 2003
Źródła powstawania ROS w komórkach
roślinnych
ROS
Miejsce syntezy i reakcja w której powstaje ROS
Tlen singletowy
1
O
2
Chloroplast, fotoukład PSII
Anionorodnik
ponadtlenkowy O
2
•-
Mitochondria – łańcuch transportu elektronów
Chloroplasty – reakcja Mehlera, fotoukład PSII
Ściana komórkowa- peroksydazy ściany komórkowej
Błona komórkowa – oksydaza NADPH
Nadtlenek wodoru H
2
O
2
Peroksysomy – fotooddychanie
Chloroplasty – łańcuch transportu elektronów
Glioksysomy - β-oksydacja kwasów tłuszczowych
Ściana komórkowa – redukcja anionorodnika
ponadtlenkowego
Rodnik hydroksylowy
•
HO
Chloroplast – fotoukład PSII, reakcja Fentona redukcja
H
2
O
2
w obecności Fe
2+
Stresy
stymulują produkcję ROS w komórce
roślinnej wywołując
wtórny stres oksydacyjny
.
Poziom stresu zależy od funkcjonowania systemu
antyoksydacyjnego.
ROS
susza
Intensywne PAR
Uszkodzenia mechaniczne, zranienie
metale ciężkie
niska lub wysoka temperatura
patogeny
nodulacja
starzenie
lignifikacja
postanoksja,
posthypoksja
Stres
oksydacyjny
Enzymy komórkowego systemu
antyoksydacyjnego
•
Dysmutaza ponadtlenkowa
(SOD),
•
Katalaza (CAT),
•
Peroksydaza glutationowa,
(GPX)
•
Peroksydaza askorbinianowa
(APX),
•
Reduktaza glutationowa (GR)
•
Reduktaza
monodehydroksyaskorbinian
u (MDHAR)
•
Reduktaza
dehydroksyaskorbinianu(DHA
R)
Systemy antyoksydacyjne współdziałające
w usuwaniu ROS w chloroplastach tzw. cykl
Halliwella-Asady (askorbinianowo-
glutationowy).
SOD
APX
MDHAR
GR
DHAR
askorbinian
H
2
O
2
H
2
O
CAT
Podstawowe mechanizmy enzymatyczne
usuwania ROS w komórkach roślinnych
enzym
Usuwana forma
ROS (produkt
reakcji)
Lokalizacja
komórkowa
Dysmutaza ponadtlenkowa
O
2
•-
(H
2
O
2
)
Chl, Cyt, Mit,
Per
katalaza
H
2
O
2
(H
2
O)
Mit? Per
peroksydaza
H
2
O
2
(H
2
O)
Wiele lokalizacji
cykl
glutationowo/askorbinianowy
H
2
O
2
(H
2
O)
Chl, Mit, Per
peroksydaza glutationowa
H
2
O
2
(H
2
O)
Chl, cyt, ER, Mit
Reduktaza glutationowa, redukuje GSSG do GSH i zapewnia funkcjonowanie
peroksydazy glutationowej
Reakcje katalizowane przez podstawowe
enzymy systemu antyoksydacyjnego
Dysmutaza ponadtlenkowa:
O
2
•-
+O
2
•-
+ 2H+ → H
2
O
2
+ O
2
Katalaza:
2H
2
O
2
→ 2H
2
O+ O
2
Peroksydaza glutationowa:
2GSH+ H
2
O
2
→GSSG+2H
2
O
Reduktaza glutationowa
GSSG+NADPH + H
+
→2GSH+H
+
GSSG – utleniona forma glutationu (związek niebezpieczny dla komórki bo utlenia
grupy tiolowe białek, prowadząc do powstawania mostków disulfidowych.
GSH - zredukowana forma glutationu (antyoksydant).
Peroksydaza askorbinianowa:
askorbinian + H
2
O
2
→ dehydroaskorbinian + 2 H
2
O
Enzymy antyoksydacyjne i opis ich aktywności
katalitycznej
katalaza
Odpowiada za zmiatanie H
2
O
2
, do swej aktywności
nie wymaga antyoksydantów cząsteczkowych
Peroksydaza
glutationowa
Odpowiada za zmiatanie H
2
O
2
,
wymaga obecności GSH
Odpowiada za zmiatanie O
2
•-
, nie potrzebuje
antyoksydantów cząsteczkowych
Dysmutaza ponadtlenkowa
Reduktaza glutationowa
Zapewnia odtwarzanie GSH z
GSSG, zużywa NADPH
• ASKORBINIAN (ASA- witamina C)
• GLUTATION (GSH)
• TOKOFEROL (α-tokoferol-witamina E)
• FLAWONOIDY
• KAROTENOIDY
Stosunek zawartości zredukowanej formy
antyoksydanta do utlenionej formy antyoksydanta
jest sygnałem modulującym mechanizmy
zmiatania ROS.
Antyoksydanty cząsteczkowe
(nieenzymatyczne) pełniące rolę zmiataczy lub
wychwytywaczy ROS
Stężenie H
2
O
2
w komórce
jest kontrolowane przez
system antyoksydacyjny,
który składa się z:
■
szeregu enzymów
i
■
antyoksydantów
.
Transport H
2
O
2
przez:
• peroksypory
• akwaporyny
ROS odgrywają podwójną
rolę - cząstek
toksycznych i
sygnalnych.
ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych
H
2
O
2
uczestniczy w regulacji
szeregu procesów
fizjologicznych np. takich jak:
• Ruchy aparatów szparkowych
indukowane obecnością kwasu
abscysynowego (ABA)
• Reakcja grawiropiczna korzeni
w odpowiedzi na auksynę (IAA)
• Kiełkowanie nasion
• Starzenie liści i nasion
• Reakcja rośliny na patogeny
bodziec
ROS
Czynnik
transkrypcyjny
Fosfatazy +
Kinazy MAP
Odpowiedź
fizjologiczna
Aktywacja genu
Udział stresu oksydacyjnego w biotycznych i
abiotycznych stresach
• Stres abiotyczny – wzrost produkcji ROS, natychmiastowa
aktywacja systemu antyoksydacyjnego
, zmiatanie ROS
• Stres biotyczny – nadprodukcja ROS (oksydaza NADPH),
wygaszenie systemu antyoksydacyjnego
, miejscowa
realizacja PDC (programowanej śmierci komórki),
POWSTANIE NEKROZ, oraz uruchomienie mechanizmów
obronnych
Różnica: strategia modulowania aktywnością
systemu antyoksydacyjnego
Podsumowanie
Toksyczna i regulacyjna funkcja ROS
ROS
Błony komórkowe
Endoplazmatyczne
reticulum
chloroplasty
mitochondria
peroksysomy
Funkcja sygnałowa
Działanie toksyczne
Kaskadowa reakcja
z udziałem kinaz
białkowych MAP
Aktywacja czynników
transkrypcyjnych
Indukcja stresu
oksydacyjnego
Uszkodzenia białek, kwasów
nukleinowych lipidów
błonowych
Modyfikacja
ekspresjii genów
Utrata funkcji organelli
komórkowych
Uszkodzenie lub
śmierć komórki
Odpowiedź fizjologiczna
komórki
Zmodyfikowane
w.g. Szymańska i
Strzałka 2010.
Postępy Biochemii
56: 182- 190.
Johansson, 2004
Sygnałowe funkcje ROS
związane są nie tylko z
odpowiedzią na stres
Przejściowy wzrost produkcji ROS
(sygnał ?) i białek utlenionych przed
zakwitnięciem rośliny
Zawartości białek utlenionych
w trakcie rozwoju rośliny
(Arabidopsis) jest zmienna.
ROS
pełnią wiele sygnałowych funkcji
(nie tylko toksycznych) w roślinie:
• wtórne przekaźniki podczas stresu
• powodują powstawanie białek utlenionych
SYGNAŁOWYCH podczas kiełkowania,
kwitnienia…i innych procesów życiowych.
Życie jest bilansem pomiędzy aktywnością
ROS i antyoksydantami
Hallaiwell 2006, Plant Physiol. 141, 312-322
Skutki stresu oksydacyjnego w chloroplastach
Niekorzystne
czynniki środowiska
Stres oksydacyjny
Odporność = mechanizmy naprawcze
a/ system antyoksydacyjny:
• Glutation
• Askorbinian
• Karotenoidy antoksydanty
• Tokoferol
b/ enzymy antyoksydacyjne:
SOD, GR, APOX, GPOX
Uszkodzenia (destrukcja chloroplastów)
1. Pęcznienie chloroplastów
2. Akumulacja skrobi
3. Destrukcja błon otaczających
chloroplasty
4. Destrukcja barwników asymilacyjnych
naturalne
antropogeniczne
Zapobieganie
hamowania fotosyntezy
Hamowania fotosyntezy
Sygnał ROS jest kontrolowany przez
procesy syntezy i zmiatania ROS
Istnieje równowaga pomiędzy syntezą ROS i aktywnością
komórkowego systemu antyoksydacyjnego
(oba procesy
zachodzą zawsze).
Zakłócenie tej równowagi prowadzi do powstania
stresu
oksydacyjnego,
t.z.n. zmiatanie ROS nie nadąża za
produkcją ROS.
Procesy biologiczne regulowane
przez H
2
O
2
-Stres abiotyczny
-Zamykanie aparatów szparkowych w
odpowiedzi na ABA
-Stres biotyczny -infekcja patogenu –
indukcja PCD
-Allelopatia
Neill et al. 2002, Laloi et al. 2004
ROS (H
2
O
2
)
i
RNS (NO)
biorą udział w
regulacji tych samych procesów:
- indukują reakcje obronne przeciwko patogenom,
- indukują programowaną śmierć komórki (PCD),
- kontrolują procesy wzrostu i rozwoju (kiełkowanie).
Prokukcja
NO
w komórce roślinnej
NO jest produkowany
:
- na drodze enzymatycznej
(syntaza NO (NOS), reduktaza
azotanowa (NR), reduktaza
nitrozowa (Ni-NOR)
- na drodze nie enzymatycznej
(uwalnianie z azotynów)
Neill et al. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.
Nitrate
reductase (NR)
Arginine
mitochondria
peroxisomes
cytoplasm
chloroplasts
NO
NO synthase
(AtNOS1/AtNOA1)
cytoplasm
NO
2
-
NO
2
-
NO
2
-
NO
2
-
chloroplast
mitochondria
Plasma
membrane
(root)
Nitrite:NO
reductase
(Ni-NOR)
Usuwanie
NO
z komórki
NO
reaguje z rodnikiem
ponadtlenkowym i powstaje
rodnik peroksynitrylowy
NO
reaguje z glutationem –
powstaje S-nitrozoglutation
(GSNO).
NO
może być metabolizowany
przy udziale hemoglobin.
Neill et al.. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.
haemoglobins
NO
NO
2
-
, NO
3
-
O
2
GSNO
GSSG + NH
2
GSNO reductase
glutathione
ONOO
-
(peroxynitrite)
O
2
-
.
(superoxide)
aminokwasy
nitrozylacja
nitracja
utlenianie
cysteiny do:
SS-, SOH-,
SO
2
-, SO
3
-
tyrozyny
histydyny
tryptofanu
R-NO
2
S-nitrozylacja
cysteiny: R-S-NO
przyłączenie NO
2
lub ONOO- do
pierścienia
aromatycznego
przyłączenie NO do
grupy tiolowej
cysteiny
H
2
O
2
O
2
.-
Modyfikacje białek wywołane przez
RNS
(NO,NO
2
i ONOO-)
i
ROS
przyłączenie O
2
do
grupy tiolowej lub
pobranie ē
ROS
argininy
lizyny
proliny
treoniny
utworzenie
grupy
karbonylowej
karbonylacja
RNS
NO
modyfikacja
posttranslacyjna
białek
wpływa na aktywność enzymów:
• katalazy
• peroksydazy ksantynowej
• peroksydazy askorbinianowej
• kinazy
• oksydazy alternatywnej
• akonitazy
• ferrytyny
aktywuje
cGMP
cyklazę
guanylową
aktywacja drogi
sygnalnej
uwalnia Ca
2+
kinazy
kanały jonowej
fosfodiesterazy
RNS
w transdukcji sygnału
Podobny mechanizm działania
RNS
i
ROS
w regulacji
ekspresji genów
NO
motyw palców
cynkowych
inaktywacja
represorów
transkrypcji
modyfikuje aktywność
czynników transkrypcyjnych
NO
wnika do jądra
komórkowego
aktywuje drogi sygnalne przez:
produkcje
SA, cGMP
uwalnianie
Ca
2+
MAPK
kinaza
transdukcja sygnału
ekspresja genów
H
2
O
2
utlenienie i
karbonylacja
białek
H
2
O
2
wnika do jądra
komórkowego
utlenienie,
nitracja i
nitrozylacja białek
ROS
i
RNS (NO)
współdziałają z hormonami
roślinnymi
ROS
RNS
etylen
GA
ABA
JA
BR
Wzrost i rozwój
-
?
?
Współdziałanie („cross-talk”)
ROS
i
RNS
w regulacji
wzrostu i rozwoju
miejsce syntezy
czas
syntezy
szlak transdukcji
sygnału
funkcje
ROS
(H
2
O
2
)
RNS
(NO)
Askorbinian
Glutation
p o d o b i e ń s t w a
Podsumowanie
Podsumowanie
Regulacyjna rola
ROS
i
RNS
w kontroli procesów wzrostu i rozwoju
Sygnał egzo- lub
endogenny
stres oksydacyjny
stres nitrozacyjny
Wzrost
i
rozwój
ROS
RNS
utlenienie,
karbonylacja białek
peroksydacja lipidów
S-nitrozylacja
białek
nitracja białek i lipidów
glutation
askorbiniann
RNS
NO modyfikuje aktywność białek
Zmienia to strukturę przestrzenną białek co wpływa na
modyfikację ich aktywności
nitrozylacja
przyłączanie grupy
NO do tyrozyny
R-NO
S-nitrozylacja
przyłączanie
NO do reszty
siarkowej
R-S-NO
przyłączenie sie
do cześci
hemowej białka
reaguje z
Fe lub Zn
w białku