Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Badanie składników kwasów nukleinowych

Cel ćwiczenia

Ćwiczenie ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla 

kwasów nukleinowych. Na ćwiczeniu zostaną wykonane reakcje pozwalające na wykrycie: 

pentozy   (reakcja   Biala),   deoksyrybozy   (reakcja   Dischego),   tyminy   i   reszty   kwasu 

fosforowego.

Wprowadzenie

Kwasy nukleinowe są podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych, roślinnych i 

drobnoustrojów. Występują one w jądrze komórkowym, chloroplastach, mitochondriach oraz 

w  cytoplazmie.   Wśród kwasów  nukleinowych  wyróżnia  się:  kwas deoksyrybonukleinowy 

(DNA), który stanowi informację genetyczną we wszystkich organizmach żywych (wyjątek 

wirusy   RNA)   oraz   kwasy   rybonukleinowe   (RNA),   które   uczestniczą   między   innymi   w 

ekspresji genów i biosyntezie białka. 

Kwasy   nukleinowe   są   biopolimerami   składającymi   się   z   monomerów,   zwanych 

nukleotydami.  Nukleotyd, składa się z: cząsteczki cukru – pentozy, zasady azotowej, oraz 

reszty kwasu fosforowego. Cukier wchodzący w skład nukleotydu to: ryboza (β-D-ryboza), 

charakterystyczna   dla   nukleotydów   budujących   kwasy   rybonukleotydowe   (RNA)   lub 

deoksyryboza  (β-D-2-deoksyryboza)   występująca   w   cząsteczkach   DNA.   Obie   cząsteczki 

cukru występują w formie hemiacetalowego pierścienia. Deoksyryboza różni się od rybozy 

tylko brakiem grupy hydroksylowej przy drugim atomie węgla w pierścieniu (rys 1).

Rysunek 1. Wzory cukrów występujących w kwasach nukleinowych

.

Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych są związkami organicznymi, 

heterocyklicznymi o charakterze aromatycznym. Zasady te to pochodne purynowe: adenina i 

guanina   oraz   pirymidynowe:   cytozyna,   tymina   i   uracyl.   Zarówno   w   DNA,   jak   i   RNA 

występują   zasady   purynowe   –  adenina  (6-aminopuryna)   i  guanina  (2-amino-6-

hydroksypuryna)   oraz   pochodna   pirymidynowa   –

 cytozyna 

(2-hydroksy-4-

1

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

aminopirymidyna).   Poza   tym   w   RNA   występuje   pochodna   pirymidynowa   –  uracyl  (2,4-

dihydroksypirymidyna),   a   w   DNA   pochodna   pirymidynowa   –  tymina  (2,4-dihydroksy-5-

metylopirymidyna). Wzory tych zasad są podane na rysunku 2. 

Rysunek 2. Wzory zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych.

Zasada azotowa połączona z pentozą wiązaniem N-glikozydowym tworzy nukleozyd. 

Wyróżniamy następujące nukleozydy: adenozyna, guanozyna, cytydyna, tymidyna i urydyna. 

Na rysunku 3 pokazano przykładowe nukleozydy.

Rysunek 3. Wzory nukleozydów występujących w kwasach nukleinowych.

Nukleotydy należą do grupy estrów fosforanowych. Są to estry nukleozydów i kwasu 

fosforowego. Typowym  miejscem estryfikacji jest grupa hydroksylowa przy piątym  (C-5) 

atomie węgla pentozy. Ze względu na rodzaj pentozy wyróżniamy dwa typy nukleotydów: 

rybonukleotydy   zawierają   β-D-rybozę,   a   deoksyrybonukleotydy   -   β-D-2-deoksyrybozę. 

Natomiast   w   zależności   od   rodzaju   zasady   azotowej   istnieje   5   typów   nukleotydów: 

adenozyno-5'-monofosforan,   guanozyno-5'-monofosforan,   cytydyno-5'-monofosforan, 

tymidyno-5'-monofosforan, urydyno-5'monofosforan. Na rysunku 4 pokazano przykładowe 

nukleotydy. 

2

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Rysunek 4. Wzory nukleotydów występujących w kwasach nukleinowych.

Sąsiednie   nukleotydy   w   łańcuchach   kwasów   nukleinowych   połączone   są   ze   sobą 

wiązaniem 3’,5’-fosfodiestrowym. W wiązaniu tym fosforan jest podwójnie zestryfikowany 

grupami hydroksylowymi cukru. Pierwsze wiązanie estrowe utworzone jest pomiędzy resztą 

fosforanową, a grupą hydroksylową przy C-3’ pentozy jednego nukleotydu. Drugie wiązanie 

estrowe   łączy   ten   sam   fosforan   z   grupą   hydroksylową   przy   C-5’   pentozy   następnego 

nukleotydu.   Jest   to   kowalencyjne   wiązanie   reszty   fosforanowej   między   grupą   5’-

hydroksylową jednej rybozy i 3’ hydroksylową następnej. 

Wyróżnia się dwa sposoby badania składników kwasów nukleinowych. Pierwszy z 

nich wymaga wcześniejszej hydrolizy tych związków do składników podstawowych, tj. do 

kwasu fosforowego, pentozy oraz zasady azotowej. Hydrolizę przeprowadza się z udziałem 

odczynników   chemicznych   lub   enzymatycznie.   Degradacja   chemiczna   zachodzi   pod 

wpływem kwasów i zasad. DNA i oligodeoksyrybonukleotydy ulegają degradacji tylko w 

środowisku   kwaśnym,   natomiast   RNA   i   oligorybonukleotydy   zarówno   w   środowisku 

kwaśnym,   jak   i   zasadowym.   W   przypadku   środowiska   alkalicznego,   hydrolizie   ulegają 

jedynie wiązania 3’,5’-fosfodiestrowe między fosforanem, a grupą hydroksylową. Ponieważ 

hydroliza   ta   wymaga   wytworzenia   wiązania   estrowego   między   fosforanem,   a   grupą 

hydroksylową w pozycji 2’ cukru, ulega jej tylko RNA i oligorybonukleotydy. Chemicznie 

najczęściej   wykonuje   się   hydrolizę   traktując   kwasy   nukleinowe   mocnymi   kwasami 

mineralnymi np. 60 % kwasem nadchlorowym w temperaturze 100°C przez 1 godzinę. W 

takich warunkach w pierwszej kolejności hydrolizie ulega wiązanie N-glikozydowe miedzy 

puryną  a pentozą.  Uwalniane  są wolne puryny  i tzw. kwas apurynowy.  Dalsza hydroliza 

prowadzi do rozpadu wiązania estrowego między pentozą, a resztą kwasu fosforowego w 

efekcie,   czego   uwalniany   jest   cukier   i   fosforan.   Następnie   hydrolizie   ulegają   wiązania 

fosfodiestrowe między nukleotydami zawierającymi zasady pirymidynowe. Pełna hydroliza 

3

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

prowadzi do rozpadu wiązań N-glikozydowych miedzy zasadami pirymidynowymi, a pentozą 

i wiązań estrowych między tym cukrem a fosforanem.

Całkowitą   hydrolizę   kwasów   nukleinowych   można   też   przeprowadzić   stosując 

specyficzne   enzymy.   Nukleazy   hydrolizują   wiązanie   3’,5’-fosfodiestrowe   uwalniając 

pojedyncze   nukleotydy,   natomiast   glikozydazy   hydrolizują   wiązania   N-glikozydowe, 

prowadząc do odłączenia zasad azotowych od szkieletu cukrowo-fosforanowego. Fosforan 

może być  uwolniony od reszty cukru przez działanie fosfataz, które hydrolizują wiązania 

estrowe. Wspólne działanie wszystkich tych enzymów prowadzi do otrzymania mieszaniny 

wolnych zasad azotowych (puryn i pirymidyn), fosforanu i cukru (β-D-rybozy lub β-D-2-

deoksyrybozy). 

Reakcje barwne, wykonane na ćwiczeniach charakterystyczne  dla hydrolizowanych 

preparatów kwasów nukleinowych to reakcje pozwalające wykryć obecność fosforanów oraz 

tyminy. 

Drugi sposób badania składników kwasów nukleinowych związany jest z wykonaniem 

reakcji barwnych bez konieczności ich hydrolizy. W niehydrolizowany preparacie kwasów 

nukleinowych   można   wykryć  pentozy  dzięki   reakcji   Biala   oraz  obecność  β-D-2-

deoksyrybozy wykonując reakcję Dischego. 

Odczynniki

1.

Wodny roztwór kwasów nukleinowych.

2. 0,1 M NaOH 

3.

60% w/o HClO

4

4. Odczynnik Biala 

5. 1% w/o roztwór difenyloaminy

6.

10,6% w/o roztwór molibdenianu amonu

7. 5 M NaOH

8.

1,1% w/o Na

2

CO

3

9. Odczynnik diazowy

10. 3 M NaOH

11.

20% w/o roztwór hydroksyloaminy.

12.

96% w/o alkohol etylowy skażony 3% w/o acetonem.

4

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Wykonanie

Wszystkie   barwne   reakcje   studenci   wykonują   na   ćwiczeniach   4   godzinnych 

indywidualnie,   na   ćwiczeniach   3   godzinnych   wykonują   parami.   Natomiast   wytrącanie 

etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego oraz ich hydrolizę kwaśną w grupach 

czteroosobowych.

1. Wytrącanie etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego. 

Do   cylindra   o   objętości   100   ml   zawierającego   20   ml   wodnego   roztworu   kwasów 

nukleinowych   (1)   został   wlany   po   bagietce   alkohol   etylowy   (12).   Wytrącony   w   tych 

warunkach   osad   kwasów   nukleinowych   należy   nawinąć   na   bagietkę,   nadmiar   alkoholu 

usunąć, przyciskając bagietkę z nawiniętym osadem do ścianki cylindra. Delikatnie obracając 

bagietkę rozpuścić preparat kwasów nukleinowych w 3 ml 0,1 M NaOH (2). Tak otrzymany 

preparat kwasów nukleinowych podzielić na dwie części. Do szklanej probówki odpipetować 

1   ml   kwasów   nukleinowych   i   dodać   4   ml   0,1   M   NaOH   (2).   Otrzymany   w   ten   sposób 

rozcieńczony   preparat   zostanie   wykorzystany   do   przeprowadzenia   reakcji   Biala   i   reakcji 

Dischego. Pozostałą część preparatu wykorzystać do hydrolizy.

2. Hydroliza kwasów nukleinowych.

Do probówki zawierającej 2 ml roztworu kwasów nukleinowych w 0,1 M NaOH dodać 2 ml 

HClO

4

 (3) (hydrolizat, próba pełna). Do drugiej probówki odpipetować 2 ml 0,1 M NaOH (2) 

i 2 ml HClO

4

  (3) (próba odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. 

Następnie obie probówki inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę, do probówek 

włożyć   chłodniczki,   które   zapobiegają   parowaniu   zawartości   probówek.   Po   zakończonej 

hydrolizie do czystej probówki odpipetować 2 ml hydrolizatu, a do kolejnej probówki 2 ml 

roztworu próby odczynnikowej, obie próby zobojętnić dodając 2 ml 5M NaOH (7). Zawartość 

obu   probówek   dokładnie   wymieszać.   Otrzymane   zobojętnione   roztwory   wykorzystać   do 

wykonywania   reakcji   na   obecność   tyminy.   Do   pozostałych   niezobojętnionych   2   ml 

hydrolizatu i 2 ml  próby odczynnikowej  dodać po 4 ml wody.  Otrzymane  w ten sposób 

zhydrolizowane,  kwaśne roztwory wykorzystać  do wykonania  reakcji na obecność kwasu 

fosforowego.

3. Reakcje wykonywane na preparacie DNA niehydrolizowanym.

a. Reakcja charakterystyczna dla pentoz – reakcja Biala. 

W reakcji Biala pentozy połączone z zasadami purynowymi  występujące w nukleotydach 

podczas ogrzewania z odczynnikiem Biala przekształcają się w furfural. Powstały furfural 

5

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

tworzy z orcyną w obecności jonów Fe

3+

 kompleks o trwałej barwie zielonej (rys. 5). W tych 

warunkach β-D-2-deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy. 

Rysunek 5. Reakcja Biala.

Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml odczynnika Biala (4) i wstawić do wrzącej łaźni 

wodnej na 5 minut. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml rozcieńczonego preparatu 

kwasów nukleinowych (próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1-M NaOH (2) (próba 

odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni 

wodnej na 5 minut.

b. Reakcja charakterystyczna dla β-D-2-deoksyrybozy – reakcja Dischego.

Reakcja Dischego pozwala  odróżnić  dwa typy  kwasów nukleinowych  (DNA i  RNA). W 

środowisku kwaśnym deoksyryboza tworzy z difenyloaminą produkt kondensacji o barwie 

niebieskiej.   Ta   reakcja   barwna   jest   konsekwencją   powstania   aldehydu   ω-

hydroksylewulinowego z β-D-2-deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i 

octowego. 

Rysunek 6. Reakcja Dischego.

6

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Do   jednej   probówki   odmierzyć   0,5   ml   rozcieńczonego   preparatu   kwasów   nukleinowych 

(próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1 M NaOH (2) (próba odczynnikowa). Następnie 

do obu probówek dodać po 2 ml roztworu difenyloaminy (5), dokładnie wymieszać i wstawić 

do wrzącej łaźni wodnej na 5 min.

4. Reakcje wykonywane na preparacie hydrolizowanym DNA.

a. Wykrywanie tyminy.

Reakcja służąca do wykrywania tyminy, odróżniająca oba typy kwasów nukleinowych (DNA 

i RNA), polega ona na wytworzeniu przez tyminę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego 

kompleksu o barwie czerwono-różowej, dodatek hydroksyloaminy, w środowisku zasadowym 

wzmacnia barwę kompleksu.

Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml Na

2

CO

3

 (8) i po 1 ml odczynnika diazowego (9), 

zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Następnie do jednej z tych probówek dodać 

0,5 ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych (próba pełna), a do drugiej 0,5 ml 

zobojętnionego   roztworu   próby   odczynnikowej,   zawartość   obu   probówek   dokładnie 

wymieszać. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do obu probówek dodać po 1 

ml   3   M   NaOH   (10)   i   2-3   krople   hydroksyloaminy   (11),   zawartość   probówek   dokładnie 

wymieszać i po 5 min obserwować zabarwienia roztworów w próbie pełnej i odczynnikowej.

b. Wykrywanie reszt fosforanowych.

Reakcja charakterystyczna  dla  fosforanów  polega na łączeniu  się molibdenianu  amonu  z 

jonem fosforanowym, w wyniku czego powstaje żółty osad fosfomolibdenianu amonu.

Do   jednej   probówki   odmierzyć   1   ml   rozcieńczonego   kwaśnego   hydrolizatu   kwasów 

nukleinowych, a do drugiej 1 ml rozcieńczonego kwaśnego roztworu próby odczynnikowej. 

Następnie do obu probówek dodać po 2 ml roztworu molidbenianu amonu (6), zawartość obu 

probówek dokładnie wymieszać. 

Opracowanie wyników

W sprawozdaniu należy podać otrzymane zabarwienia po przeprowadzeniu poszczególnych 

reakcji oraz opisać zasady metod wykorzystywanych w tych reakcjach. Wyjaśnić celowość 

wykonywania prób odczynnikowych.

Pytania

1. Napisać i podać wzory zasad purynowych i pirymidynowych. Podać ich nazwy 

systematyczne.

7

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. 

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

2.

Co to jest nukleozyd, a co nukleotyd? Jakie charakterystyczne typy wiązań w nich 

występują? Nazwać i przedstawić wzory nukleozydu i nukleotydu, zawierających 

odpowiednio β-D-rybozę i β-D-2-deoksyrybozę.

3. Z jakich jednostek strukturalnych zbudowany jest kwas deoksyrybonukleinowy, a z 

jakich kwas rybonukleinowy? 

4.

Jak można hydrolizować kwasy nukleinowe i w jaki sposób była wykonana hydroliza 

na ćwiczeniach?

5.

Jakie związki uwalniają się w wyniku całkowitej hydrolizy DNA, a jakie po hydrolizie 

RNA?

6.

Jakie reakcje charakterystyczne są wspólne dla DNA i RNA, a które pozwalają 

odróżnić te związki?

Literatura:

J. Marmur (1961) A procedure for the isolation of DNA from microorganisms. J Mol Biol 3: 208-218.

Z. Dische, E.Borenfreund (1951) A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto 

sugars and trioses. J. Biol. Chem. 192: 583-587. 

Z. Dische, E. Landsberg (1957) A color reaction of pentose phosphate esters substituted in position 5. 

Biochimica et Biophysica Acta 24: 193-195.

G Miller, R Golder, E Miller (1951) Determination of Pentoses. Effect of Varying Proportions of Components of 

Bial's Color Reagent. Anal. Chem. 23: 903–905.

G. Hunter (1936) A test for thymine, with observations on the keto-enolic type of diazo-test. Biochem J. 30: 

745–749.

8