Genetyka zwierząt

Autorzy

Prof. dr hab. Krystyna Małgorzata Charon

Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt,

Wydział Nauk o Zwierzętach, SGGW, Warszawa

Prof. dr hab. Marek Świtoński

Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Wydział

Hodowli i Biologii Zwierząt, Akademia Rolnicza, Poznań

Okładkę i strony tytułowe projektował

Edwin Radzikowski

Redaktor

Krystyna Kruczyńska

Redaktor techniczny

Jolanta Cłbor

Podręcznik akademicki dotowany przez

Ministerstwo Edukacji Narodowej i Sportu

Warszawa 2000, 2004

ISBN 83-01-14022-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10

tel. (O-prefiks-22) 69-54-321

faks (O-prefiks-22) 69-54-031

e-mail: pwn @pwn.com.pl

http://www.pwn.pl

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Wydanie drugie unowocześnione

Arkuszy drukarskich 20 + 12 stron ilustracji

Druk ukończono w marcu 2004 r.

Skład i łamanie: Fototype, Warszawa

Druk i oprawa: WDG Drukarnia w Gdyni Sp. z o.o.

ul. Sw. Piotra 12, Gdynia

Przedmowa

Coraz większe wykorzystywanie w hodowli zwierząt najnowszych osiągnięć

genetyki sprawia, że uaktualnianie programów nauczania tego przedmiotu

na kierunkach studiów związanych z nauką o zwierzętach staje się

koniecznością. Cytogenetyczna i molekularna identyfikacja mutacji, kontrola

pochodzenia za pomocą markerów związanych z polimorfizmem DNA czy

budowanie map genomów, to tylko niektóre przykłady obrazujące obszary

genetyki istotnie rozbudowane w ostatnich latach. W niniejszym podręczniku

podjęto próbę zaprezentowania, obok podstawowych wiadomości z zakresu

genetyki klasycznej, najnowszych osiągnięć, które znajdują zastosowanie

w hodowli zwierząt.

Podręcznik jest adresowany przede wszystkim do studentów kształcących

się na kierunkach: zootechnika, weterynaria, biotechnologia i biologia.

Mamy także nadzieję, że podręcznik będzie przydatny specjalistom, którzy

profesjonalnie zajmują się hodowlą zwierząt lub prowadzeniem badań

z tego zakresu.

Ważną częścią niniejszego opracowania są oryginalne ilustracje, które

ściśle nawiązują do wybranych zagadnień z cytogenetyki, genetyki mo-

lekularnej czy zmienności klasycznych cech jakościowych (np. umasz-

czenie). W przygotowaniu tej dokumentacji pomogli nam PT Współ-

pracownicy z Katedry Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt AR w Po-

znaniu: A. Pietrzak, J. Klukowska, A. Pieńkowska, M. Zając, D. Lechniak,

D. Ładoń i J. Sosnowski oraz J. Gruszczyńska, Z. Nowak i M. Gajewska

z Katedry Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt SGGW w Warszawie.

Ponadto, kilka zdjęć zostało nam udostępnionych przez E. Słotę i B. Danielak--

Czech z Instytutu Zootechniki w Balicach, H. Geringera z AR we Wroc-

ławiu, K. Jaszczaka i R. Paradę z Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt

PAN w Jastrzębcu. Niektóre zdjęcia pochodzą z archiwum Redakcji

Przeglądu Hodowlanego. Za okazaną pomoc serdecznie dziękujemy.

Spis treści

1 Wstęp — zarys historii genetyki ..........................

2 Chromosomy

podziały jądra komórkowego ..

2.1. Budowa chromosomu .........................................................................

2.2. Barwienie prążkowe chromosomów ....................................................

2.3. Mitoza..............................................................................., ......................

2.4. Kariotyp ..............................................................................................

2.5. Mejoza .................................................................................................

2.6. Gametogeneza ......................................................................................

3 Gen i jego ekspresja .......................................... 48

3.1. Budowa kwasów nukleinowych ..............................................................

3.1.1. DNA .................................................................................................

3.1.2. RNA .................................................................................................

3.2. Replikacja DNA ....................................................................................

3.3. Kod genetyczny ....................................................................................

3.4. Transkrypcja ..........................................................................................

3.5. Translacja .................................................................................................

3.6. Budowa genu...........................................................................................

3.7. Regulacja ekspresji genu ....................................................................... .

3.7.1. Czynniki transkrypcyjne ..................................................................

3.7.2. Geny homeotyczne ..........................................................................

3.7.3. Metylacja DNA ....................................................................................

3.7.4. Piętno gametyczne .........................................................................

3.7.5. Inaktywacja chromosomu X w zarodkach żeńskich ......................

4 Metody analizy i modyfikacji genomu ................. 69

4.1. Endonukleazy restrykcyjne .................................................................

4.2. Wektory....................................................................................................

4.3. Rekombinacja molekularna i klonowanie ............................................

4.4. Amplifikacja DNA za pomocą łańcuchowej reakcji połimerazy (PCR) . .

4.5. Techniki hybrydyzacji i sondy molekularne ...........................................

4.6. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLP) ......................... 86
4.7. Biblioteki genomowe i genowe ............................................................

4.8. Sekwencjonowanie DNA .......................................................................

4.9. Badanie ekspresji genów ......................................................................

4.10. Transgeneza ......................................................................................

5 Mutacje .............................................................

5.1. Mutacje genomowe ..............................................................................

5.2. Mutacje chromosomowe .....................................................................

100

5.3. Mutacje genomowe i chromosomowe zidentyfikowane u zwierząt

hodowanych w Polsce ..............................................................................

111

5.4. Mutacje genowe ...................................................................................

112

5.4.1. Przyczyny i rodzaje mutacji genowych .............................................

112

5.4.2. Skutki mutacji genowych ................................................................... 118
5.4.3. Mutacje genowe wpływające na cechy produkcyjne zwierząt . . .

123

5.4.4. Mutacje genowe wywołujące choroby genetyczne ........................

124

5.4.4.1. Geny letalne, semiletalne i subwitalne .....................................

124

5.4.4.2. Choroby monogenowe wywołujące wrodzone wady rozwojowe

127

5.4.4.3. Choroby monogenowe wywołujące zaburzenia procesów bio

chemicznych ..........................................................................................

132

5.4.4.4. Ograniczanie występowania chorób genetycznych.......................

135

5.4.5. Mutacje genowe odpowiedzialne za odporność/podatność zwierząt

na patogeny ............................................................................................

143

5.5. Mutacje w mitochondrialnym DNA .................................................... 144

6 Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech ..

146

6.1. Dziedziczenie cech warunkowanych jedną parą alleli ...........................

147

6.1.1. Współdziałanie alleli ......................................................................

147

6.1.2. Niezależne dziedziczenie cech (II prawo Mendla) .........................

150

6.1.3. Dziedziczenie cech sprzężonych ................................................... 152
6.1.4. Cechy sprzężone z płcią .................................................................

157

6.1.5. Plejotropia .......................................................................................

160

6.2. Współdziałanie genów z różnych lód w kształtowaniu fenotypu . . .

160

6.2.1. Komplementarność ............................................................................. 161

6.2.2. Epistaza ...........................................................................................

162

6.2.3. Geny modyfikujące ............................................................................ 163

6.2.4. Sumujące działanie genów .................................................................

164

6.3. Dziedziczenie umaszczenia.....................................................................

164

6.4. Penetracja i stopień ekspresji (ekspresywność) genów ...........................

175

6.5. Dziedziczenie pozajądrowe .................................................................

176

7 Zmienność cech.....................................

179

7.1. Rodzaje zmienności i czynniki ją wywołujące ........................................ 179
7.2. Miary zmienności .................................................................................... 182

7.2.1. Miary skupienia .............................................................................

182

7.2.2. Miary rozproszenia ........................................................................

185

7.3. Zmienność cech ilościowych ....................................................................

187

7.3.1. Dziedziczenie cech ilościowych .......................................................

187

7.3.2. Zmienność transgresywna ..............................................................

189

7.3.3. Geny o dużym efekcie ....................................................................

190

8 Podstawy genetyki populacji ............................... 198

8.1. Prawo równowagi genetycznej ............................................................

198

8.2. Frekwencja genów i genotypów w przypadku dominowania ...........

201

8.3. Frekwencja genów i genotypów w przypadku cech uwarunkowanych

szeregiem (serią) alleli wielokrotnych .......................................................

201

8.4. Frekwencja genów ł genotypów w przypadku cech sprzężonych z płcią

204

8.5. Czynniki naruszające równowagę genetyczną ....................................

205

8.6. Wykorzystanie frekwencji alleli do szacowania zmienności genetycznej

wewnątrz i między populacjami .............................................................. .

210

9 Determinacja i różnicowanie płci oraz

interseksualizm .................................................. 210

9.1. Determinacja płci ssaków ....................................................................

216

9.2. Interseksualizm ....................................................................................

221

1 0 Genetyczne podstawy odporności i oporności ..

227

10.1. Genetyczne podłoże różnorodności przeciwciał ...................................

227

10.2. Genetyczne podłoże różnorodności receptorów limfocytów T . . . .

230

10.3. Główny układ zgodności tkankowej — MHC ...................................

231

10.3.1. Struktura i funkcje głównego układu zgodności tkankowej . . .

233

10.3.1.1. Główny układ zgodności tkankowej myszy ...........................

236

10.3.1.2. Główny układ zgodności tkankowej człowieka ......................

237

10.3.1.3. Główny układ zgodności tkankowej zwierząt gospodarskich

239

10.3.2. Identyfikacja cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej

243

10.3.3. Znaczenie głównego układu zgodności tkankowej ...................

243

10.3.3.1. Związek MHC z odpornością na choroby ..............................

243

10.3.3.2. Związek MHC z cechami produkcyjnymi i reprodukcyjnymi

244

10.4. Zarys przebiegu reakcji odpornościowej ...........................................

245

10.5. Genetyczna oporność na choroby ......................................................

247

1 1 Markery

genetyczne

............................................. 253

11.1. Antygeny erytrocytarne (grupy krwi) .................................................

254

11.2. Białka surowicy krwi, erytrocytów i leukocytów ...............................

259

11.3. Allotypy immunoglobulin i lipoprotein ...............................................

263

11.4. Białka mleka .......................................................................................

263

11.5. Polimorfizm DNA ..............................................................................

265

11.6. Wykorzystanie markerów genetycznych w hodowli zwierząt...............

268

1 2 Mapy genomowe ............................................... 275

12.1. Organizacja DNA jądrowego ................................................................. 275
12.2. Organizacja DNA mitochondrialnego .................................................

277

12.3. Markerowa mapa genomu .................................................................

279

12.3.1. Fizyczna mapa genomu ...............................................................

280

12.3.2. Genetyczna mapa genomu ........................................................

284

12.3.3. Strategia mapowania genomu......................................................... 287
12.3.4. Aktualny stan map genomowych zwierząt gospodarskich . . . .

289

12.3.5. Wykorzystanie markerowych map genomowych w hodowli . . .

292

Literatura uzupełniająca ............................................ 293

Podręczniki ................................................................................................

298

Artykuły przeglądowe .................................................................................... 298

Skorowidz ................................................................... 301

Rozdział

Wstęp - zarys historii genetyki

Genetyka stanowi wyodrębnioną dyscyplinę nauk biologicznych, której

przedmiotem badań jest zmienność i dziedziczenie cech organizmów

żywych. Powstanie tej dyscypliny stało się możliwe dzięki intensywnemu

rozwojowi biologii w wieku XIX. Postęp ten znaczony był z jednej strony

poznawaniem struktury i funkcji organizmów, tkanek, komórek i ich

organelli, a z drugiej formułowaniem przełomowych hipotez i teorii, wśród

których część miała epokowe znaczenie dla rozwoju wiedzy o świecie

ożywionym. Opis struktury i funkcji organizmów na poziomie komórkowym

lub wewnątrzkomórkowym jest zależny od dostępnych urządzeń i metod

badawczych. Tym samym rozwój nauk biologicznych opiera się na osiągnię-

ciach fizyków, chemików, konstruktorów, a ostatnio również informatyków.

W wieku XIX sformułowano trzy teorie o ogromnym znaczeniu dla

dalszego rozwoju biologii. Autorami pierwszej z nich — teorii komórkowej

budowy organizmów, ogłoszonej w 1838 roku, byli Schwann i Schleiden.

Główną tezą tej teorii było twierdzenie, że wszystkie rośliny i zwierzęta są

zbudowane z komórek, korę mogą powstawać jedynie przez podział innych

komórek. Okazało się to niezwykle stymulujące dla rozwoju cytologii, czyli

nauki o budowie i funkcji komórek. Dwadzieścia lat później — w 1859

roku — Darwin opublikował dzieło pt. O powstawaniu gatunków drogą doboru

naturalnego, które stało się początkiem nauki o ewolucji. Zgodnie z teorią

Darwina, podstawą ewolucji organizmów żywych jest dobór naturalny,

który faworyzuje osobniki najlepiej przystosowane do środowiska bytowania,

umożliwiając im nie tylko przeżycie, ale także przekazanie tych korzystnych

właściwości potomstwu. W ten sposób powstają organizmy coraz lepiej

przystosowane do danego środowiska. Kilka lat później — w 1866 roku —

Mendel opublikował skromną pracę pt. Badania nad mieszańcami roślin,

stanowiącą zaczątek genetyki. Była ona syntezą kilkuletnich obserwacji

dziedziczenia siedmiu cech u grochu (Pisum sativum), rośliny samopylnej.

Każda z analizowanych cech miała dwie łatwo odróżnialne formy: kwiaty

czerwone lub białe, nasiona gładkie lub pomarszczone, nasiona żółte lub

zielone itd. Dokonując krzyżowania między ustalonymi formami przeciw-

stawnymi, Mendel uzyskał pierwsze pokolenie mieszańców (F

), które

rozmnażając się w sposób naturalny (samopylnie) dawało drugie pokolenie

mieszańców (F

). Bardzo skrupulatna analiza cech w obu pokoleniach dała

podstawy do sformułowania wniosków, że dziedziczenie cech przebiega na

drodze przekazywania zawiązków dziedzicznych (genów) od rodziców do

potomstwa za pośrednictwem gamet, przy czym jedna gameta zawiera

tylko jeden taki element. Spostrzeżenia te ostatecznie pozwoliły na sfor-

mułowanie praw dziedziczenia. Niestety doniosłość tego odkrycia nie

została doceniona przez ówcześnie żyjących biologów.

Wiek XIX przyniósł także ważne odkrycia dotyczące budowy komórki,

w tym struktur związanych z dziedziczeniem. Jądro komórkowe zastało po

raz pierwszy opisane przez Browna już w 1831 roku. Pierwsze doniesienia

o „pałeczkowatych" strukturach, nazwanych w 1888 roku przez Waldeyera

chromosomami, zostały podane przez polskiego botanika Strasburgera

w 1880 roku. Podziały jądra komórkowego zostały opisane pod koniec XIX

wieku. Opis mitozy przedstawił w 1882 roku Flemming, a opis mejozy

powstał w 1883 roku i zawdzięczamy go van Bendenowi i Boveriemu.

Na początku XX wieku podjęto wiele badań, których celem było poznanie

praw rządzących dziedziczeniem cech. Dopiero wówczas zrozumiano

genialność odkryć Mendla. Stało się to za sprawą trzech badaczy: Corrensa,

de Yriesa i Tschermacka, którzy niezależnie od siebie doszli do wniosków,

które kilkadziesiąt lat wcześniej podał Mendel. Następne lata to lawinowy

rozwój nauki nazwanej przez Batesona w 1906 roku genetyką. W ślad za

tym terminem w 1909 roku Johannsen zaproponował określenie „gen" dla

czynnika dziedzicznego warunkującego pojawienie się cechy. W 1909 roku

Hardy i Weinberg stworzyli podstawy genetyki populacji. Badacze ci

niezależnie od siebie sformułowali prawo równowagi genetycznej. Rok

później Morgan ogłosił chromosomową teorię dziedziczenia, którą można

uważać za początek cytogenetyki. W latach 20. Fischer, Wright i Haldane

wprowadzili do genetyki metody statystyczne, które okazały się bardzo

istotnymi narzędziami badawczymi, za pomocą których możliwe stało się

poznawanie mechanizmów odpowiedzialnych za zmienność i dziedziczenie

tzw. cech ilościowych. Ten dział genetyki określa się często jako genetykę

cech ilościowych. Niektórzy autorzy uważają, że zagadnienia genetyki

populacji i genetyki cech ilościowych są na tyle sobie bliskie, że można je

określać tylko jednym terminem — genetyka populacji.

Pomimo ogromnego zaangażowania się wielu naukowców w badania

genetyczne, do końca pierwszej połowy XX wieku niewiele można było

powiedzieć o chemicznej naturze informacji genetycznej. Przez wiele lat

przypuszczano, że nośnikiem informacji genetycznej są białka, o których

różnorodności wiedziano już wówczas dość dużo. Przełom nastąpił w 1944

roku, kiedy to trzej badacze: Avery, MacLeod i McCarty wykazali, że

nośnikiem informacji genetycznej jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA).

Do wniosku tego doszli na podstawie wyników eksperymentu, w którym

do niechorobotwórczych szczepów bakterii na drodze transformacji wpro-

wadzili DNA pochodzący z zabitych bakterii wywołujących zapalenie płuc

u myszy. W wyniku tego bakterie niechorobotwórcze nabyły cech zjadliwo-

ści. W doświadczeniu tym można upatrywać początku genetyki molekular-

nej. Odkrycie to nie zostało od razu zaakceptowane przez środowisko

biologów. Początek lat 50. to czas usilnych badań, których celem było

poznanie struktury chemicznej DNA. Model cząsteczki DNA przedstawili

w 1953 roku Watson i Crick. Po tym odkryciu przyszedł czas żmudnych

prac zmierzających do rozszyfrowania kodu genetycznego. Zostały one

zakończone w pierwszej połowie lat 60., a wiodącą rolę w tych badaniach

odegrali między innymi Khorana, Nirenberg i Ochoa. W tym czasie podjęto

również molekularne badania nad regulacją ekspresji genów. Doniosłym

osiągnięciem stało się ogłoszenie w 1960 roku przez Jacoba i Monoda tzw.

teorii operonu, która wyjaśniała mechanizm ekspresji genów u bakterii.

Rozwój genetyki molekularnej i związanych z nią wyrafinowanych

metod badawczych umożliwił przejście od opisu materiału dziedzicznego

do prowadzenia na nim manipulacji i w ten sposób wyodrębniła się nowa

dyscyplina — inżynieria genetyczna. Odkrycie enzymów restrykcyjnych

(1962 r.) oraz enzymu odwrotnej transkryptazy (1970 r.), opracowanie

techniki rekombinacji i klonowania DNA (1972 r.), sekwencjonowania DNA

(1975 r.) czy amplifikacji fragmentów DNA za pomocą łańcuchowej reakcji

polimerazy — PCR (1983 r.) to tylko najważniejsze przykłady współczesnych

narzędzi i metod badawczych wykorzystywanych obecnie powszechnie

w genetyce molekularnej i inżynierii genetycznej. Warto podkreślić, że

molekularne poznanie genomów człowieka, zwierząt, roślin czy mikroor-

ganizmów ma ogromne znaczenie aplikacyjne związane z diagnostyką

i terapią chorób genetycznych, hodowlą zwierząt i roślin, wykrywaniem

1 zwalczaniem patogenów, przetwórstwem żywności, ochroną środowiska

itp. Dążenie do jak najgłębszego poznania informacji genetycznej zwierząt

gospodarskich doprowadziło w ostatnich łatach do uruchomienia interdys

cyplinarnych prpgramów mapowania genomów takich gatunków, jak świnia,

bydło, koń, owca, kura czy pies. Celem tych programów jest wskazanie

położenia genów w chromosomach oraz ustalenie odległości między genami

umiejscowionymi w tym samym chromosomie. W przypadku człowieka

celem jest nie tylko mapowanie genomu, ale również jego sekwencjo-

nowanie, tzn. ustalenie kolejności par nukleotydów w całym DNA ludzkim,

liczącym ponad trzy miliardy par nukleotydów. Program ten został urucho

miony w 1987 roku, a w lutym 2001 roku ogłoszono na łamach dwóch

renomowanych czasopism: Naturę oraz Science zakończenie podstawowego

etapu tych badań. Warto zaznaczyć, że przedsięwzięcie to przez kilka

ostatnich lat było prowadzone przez dwa niezależne zespoły: 1) między

narodowe konsorcjum HUGO (ang. Human Genome Organisation Project)

oraz 2) prywatną firmę CELERA. W grudniu 2002 roku ustalono sekwencję

genomu myszy, a we wrześniu 2003 roku ogłoszono wstępną sekwencję

genomu psa. Przewiduje się, że do 2005 roku zostaną zsekwencjonowane

genomy bydła, świni i kury.

Osiągnięcia z zakresu genetyki stały się motorem postępu nauk bio-

logicznych i ich aplikacji, czego jednym z licznych przykładów jest hodowla

zwierząt. Głównymi metodami hodowlanymi są selekcja i krzyżowanie, dla

których podstawą teoretyczną jest wiedza z zakresu genetyki cech iloś-

ciowych oraz genetyki populacji. Istotnym elementem pracy hodowlanej

jest kontrola pochodzenia, którą prowadzi się z wykorzystaniem wiedzy

dotyczącej grup krwi i polimorfizmu białek, a ostatnio także polimorfizmu

DNA. Identyfikacja i eliminacja z populacji hodowlanych nosicieli niepożą-

danych mutacji chromosomowych lub genomowych wymaga zastosowania

metod cytogenetycznych, a w przypadku mutacji genowych — metod

genetyki molekularnej. Wytwarzanie zwierząt mających wprowadzony

sztucznie obcy gen (zwierzęta transgeniczne) związane jest z zastosowaniem

technik inżynierii genetycznej. Ostatnio duże nadzieje są pokładane w wy-

korzystaniu map genomowych do molekularnej identyfikacji genów mają-

cych znaczący wpływ na kształtowanie się cech użytkowych zwierząt.

Wykrycie takich genów stworzy nowe warunki do prowadzenia selekcji,

bowiem zamiast oceny genotypu za pomocą metod statystycznych można

będzie ustalać genotyp osobnika na podstawie badań molekularnych.

Pierwsze osiągnięcia zostały już opublikowane. Ustalono, jakie mutacje są

odpowiedzialne za hipertrofię mięśniową bydła, wysoką plenność owiec

rasy boorola i inverdale, wysoką mięsność świń czy wydajność tłuszczu

w mleku krów.

Obecny poziom wiedzy genetycznej i możliwości jej wykorzystania

wywołują czasami również niepokój. Wydaje się, że za postępującym

w oszałamiającym tempie rozwojem genetyki nie nadąża niestety świado-

mość niektórych twórców i wielu odbiorców tych osiągnięć. Możliwość

ingerowania metodami inżynierii genetycznej i komórkowej w informację

genetyczną drobnoustrojów, roślin, zwierząt, a także człowieka powinna

wywołać głębokie zastanowienie się nad tym, gdzie jest granica, której dla

wspólnego dobra wszystkich organizmów zamieszkujących Ziemię nie

można przekroczyć.

Rozdział

Chromosomy i podziały jądra

komórkowego

W podziale systematycznym organizmów żywych wyróżnia się, biorąc

pod uwagę organizację informacji genetycznej i budowę komórki, dwie

podstawowe grupy organizmów: prokarionty (Procaryota) i eukarionty

(Eucaryota).

Prokarionty nie mają wyodrębnionego jądra komórkowego, zdolnego do

podziałów (kariokinezy). Odpowiednikiem jądra komórkowego jest nu-

kleoid, zbudowany z „nagiej" kolistej cząsteczki DNA. Tym samym organi-

zmy te zawierają pojedynczy zestaw genów, czyli są haploidalne. Do

prokariontów zalicza się bakterie i sinice. Niektórzy systematycy zaliczają do

tej grupy także wirusy i riketsje.

Eukarionty zbudowane są z komórek mających jądra komórkowe, które

podlegają podziałom (mitoza, mejoza). W jądrze komórkowym występują

chromosomy, które są zbudowane z kwasów nukleinowych i białek. Podczas

podziału jądra komórkowego chromosomy podlegają procesowi kondensacji

i dzięki temu możliwe jest prowadzenie ich obserwacji za pomocą mikro-

skopu. Chromosomy w stadium metafazy podziału mitotycznego mają

charakterystyczną dla siebie wielkość i morfologię, a za pomocą barwienia

różnicującego możliwe jest ujawnienie wzoru prążków poprzecznych

pojawiających się wzdłuż chromosomu. Do eukariontów zalicza się wszystkie

organizmy komórkowe, oprócz bakterii i sinic.

Odkrycie chromosomów i opis ich zachowania się podczas podziałów

jądra komórkowego oraz wiedza o mechanizmach dziedziczenia cech u roślin

i zwierząt wskazywały już na początku XX wieku na istotne znaczenie

chromosomów w procesie dziedziczenia informacji genetycznej. Komplek-

sowe ujęcie tego problemu zostało dokonane przez Morgana, który w 1910

roku ogłosił chromosomową teorię dziedziczenia. Głównymi tezami tej

teorii było twierdzenie, że: 1) geny zlokalizowane są w chromosomach,

2) każdy gen ma stałe położenie (locus) w chromosomie i 3) loci genów

uszeregowane są liniowo w chromosomie. Należy jednak podkreślić, że nie

wiedziano wówczas, z jakich związków chemicznych zbudowany jest

chromosom i co jest rzeczywistym nośnikiem informacji genetycznej oraz

jak przedstawia się struktura wewnętrzna chromosomu.

2.1. Budowa chromosomu

Chromosom jest strukturą jądra komórkowego zbudowaną z kwasu deok-

syrybonukleinowego (DNA), kwasów rybonukleinowych (RNA), białek

histonowych i niehistonowych.

Chromosomy są łatwym obiektem do obserwacji mikroskopowej podczas

podziałów jądra komórkowego. Dzięki kondensacji cząsteczki DNA, która

następuje za pomocą białek histonowych i niehistonowych, chromosom

Ryć. 2-1. Fazy (GO, Gl, S, G2 i podział jądra

komórkowego) cyklu życiowego komórki

w powiązaniu ze zmianami struktury chromosomu. Oznaczenia: P — profaza,

M — metafaza, A — anafaza i T — telofaza

osiąga najmniejsze rozmiary podczas metafazy mitotycznej bądź mejotycznej.

Wówczas to chromosom ma długość rzędu kilku mikrometrów, a jego

morfologia jest bardzo wyrazista i dzięki temu mikroskop świetlny jest

wystarczająco czułym instrumentem pozwalającym prowadzić szczegółową

analizę cytogenetyczną, która obejmuje nie tylko ustalenie liczby chromo-

somów, ale także opis ich morfologii i charakterystycznego układu prążków

poprzecznych. Chromosom w stadium metafazy mitotycznej jest zbudowany

z dwóch chromatyd połączonych w przewężeniu pierwotnym, określanym

jako centromer. O chromatydach mówi się, że są siostrzane, ponieważ

powstały w wyniku replikacji DNA w fazie S cyklu komórkowego (ryć. 2-1).

Chromatydy siostrzane zawierają po jednej cząsteczce DNA o identycznej

sekwencji nukleotydów i tym samym niosą dokładnie taką samą informację

genetyczną. Centromer dzieli chromosom na ramię krótkie (p) oraz ramię

długie (q). Część końcowa ramienia chromosomowego nazywana jest

telomerem. Telomery są zbudowane z powtarzającej się 6-nukleotydowej

sekwencji TTAGGG/AATCCC. Zależnie od położenia centromeru wyróżnia

się cztery typy morfologiczne chromosomów: meta-, submeta-, subtelo-i

akro-(telocentryczny) (ryć. 2-2). Stosunek długości ramienia długiego do

długości ramienia krótkiego jest parametrem określającym morfologię

chromosomu. Wartość tego parametru dla wymienionych wyżej typów

morfologicznych chromosomu mieści się odpowiednio w przedziałach:

(1,00-1,70), (1,71-3,00), (3,01-7,00) i (7,01-oo). Niektóre chromosomy mają,

oprócz przewężenia pierwotnego, także przewężenie wtórne, określane

inaczej jako obszar jąderkotwórczy — NOR (ang. nucleolar organizer

region), który jest odpowiedzialny za uformowanie jąderek podczas inter-

fazy. W jąderkach budowane są podjednostki rybosomów. W obszarze

jąderkotwórczym umiejscowione są geny kodujące rybosomowe kwasy

rybonukleinowe (rRNA) o stałej sedymentacji 5.8S, 18S i 28S. Czwarta

chromarydy
siostrzane

Ryć. 2-2. Morfologia chromosomów obserwowanych podczas metafazy mitotycznej. Typy
morfologiczne są wyodrębniane na podstawie wielkości stosunku długości ramion q: p

frakcja rRNA — 5S rRNA jest kodowana przez geny występujące w innych

miejscach genomu. Fragment ramienia chromosomu, który występuje za

przewężeniem wtórnym, nazywa się satelitą.

Chromosomy dzielone są na dwie podstawowe grupy: autosomy i hetero-

somy (chromosomy płci). W grupie autosomów występują identyczne pary

homologiczne zarówno u płci męskiej, jak i żeńskiej. Chromosomy homo-

logiczne mają identyczne uszeregowanie loci tych samych genów. W każdej

parze jeden chromosom pochodzi od matki, a drugi od ojca danego

osobnika. Podobieństwo molekularne występujące w obrębie pary chromo-

somów homologicznych umożliwia ich koniugację podczas profazy I po-

działu mejotycznego. Heterochromosomy, oznaczane u ssaków symbolami

X oraz Y, występują w układzie XX u samic oraz XY u samców. Chromosomy

X i Y różnią się między sobą pod względem długości (chromosom X jest

przeciętnie dwa razy dłuższy niż chromosom Y), morfologii, układu prążków

poprzecznych oraz, co najważniejsze — zestawu loci genów, które są w nich

położone. Chromosom Y jest znacznie mniejszy niż chromosom X i przez

to również uboższy w informację genetyczną (ryć. 2-3). Konsekwencją tych

różnic jest szczątkowa homologia chromosomów X i Y, która ogranicza się

do niewielkiego fragmentu określanego jako obszar pseudoautosomalny.

Oznacza to, że w tym obszarze występuje homologia pozwalająca na

mejotyczną koniugację, podobnie jak występuje to w obrębie par homo-

logicznych autosomów lub pary X-X. Kwestia funkcji heterochromosomów

będzie poruszona w rozdziale: Determinacja i różnicowanie płci oraz

interseksualizm.

Chromosomy podlegają w każdym cyklu komórkowym procesowi

kondensacji — na początku podziału jądra komórkowego oraz dekonden-

sacji — po zakończeniu podziału. W tełofazie i pierwszym okresie interfazy

(faza Gl) chromosomy są zbudowane z jednej chromatydy, która z kolei

zawiera jedną cząsteczkę DNA. Podczas fazy S następuje replikacja —

Ryć. 2-4. Struktura wewnętrzna chromosomu metafazowego (wg Biotechnologia zwierząt,

1997, PWN)

samoodtworzenie DNA, która prowadzi do powstania w obrębie chromo-

somu dwóch chromatyd siostrzanych. Wejście komórki w stadium podziału

wiąże się z uruchomieniem procesu kondensacji chromosomu, w wyniku

czego podczas metafazy staje się on strukturą maksymalnie skróconą.

Przyjmuje się, że stosunek długości cząsteczki DNA do długości chromosomu

w stadium metafazy wynosi około 8000:1. Kondensacja i dekondensacja

cząsteczki DNA zachodzi wielostopniowo, a procesy te, ze względu na ich

powtarzalność w kolejnych cyklach życiowych komórki, charakteryzują się

niezwykłą precyzją (ryć. 2-4).

Podstawową jednostką organizacji wewnętrznej chromosomu jest nukleo-

som. Jest on zbudowany z rdzenia białkowego (oktamer histonowy,

zawierający po dwie cząsteczki histonów: H2A, H2B, H3 i H4), na który jest

nawinięty fragment DNA długości od 165 do 245 par nukleotydów, inaczej

par zasad (pz). Fragment DNA owinięty na oktamerze histonowym (1,8

obrotu DNA na oktamerze) jest nazywany rdzeniem nukleosomu i składa

się ze 146 pz. Fragment cząsteczki DNA pomiędzy nukleosomami ma

długość około 60 pz, w zakresie od 0 do 80 pz.

Nić nukleosomowa jest z kolei zwinięta spiralnie tworząc solenoid.

W jego powstaniu istotną rolę odgrywają cząsteczki histonu Hl, które

odpowiadają za zbliżenie się sąsiednich nukleosomów. Solenoid podlega

dalszej spiralizacji, a jej ostatecznym etapem jest utworzenie domen

pętlo wych, które są zakotwiczone w rdzeniu białkowym chromatydy,

zbudowanym z białek niehistonowych. Sekwencje DNA leżące u podstaw

pętli są bogate w pary nukleotydów A-T i wiążą się z białkami rdzenia

chromosomu, należącymi do rodziny białek HMG (ang. high mobility

group). Dlatego te sekwencje DNA określane są terminem S AR (ang.

scaffold attachment region), czyli regionami wiążącymi się ze szkieletem

chromosomu. Przedstawiony proces kondensacji chromosomu metafazowego

prowadzi do skrócenia jego długości, z jednoczesnym bardzo wydatnym

zwiększeniem średnicy — z 2 nm w przypadku średnicy cząsteczki DNA do

700 nm w przypadku średnicy chromatydy chromosomu metafazowego.

Dzięki tym zmianom chromosomy są dobrze widoczne w mikroskopie

świetlnym.

W obrębie chromosomu wyróżnia się dwie frakcje chromatyny: euchro-

matynę i heterochromatynę. Euchromatyna podlega cyklicznym procesom

kondensacji i dekondensacji. W niej zlokalizowane są kodujące sekwencje

DNA, czyli geny. Podlega ona replikacji w początkowym okresie fazy S.

Heterochromatyna jest frakcją skondensowaną i dzieli się na dwa typy:

heterochromatynę fakultatywną i heterochromatynę konstytutywną. Hete-

rochromatyna fakultatywna jest częścią chromatyny, która może ulec

trwałej kondensacji; przykładem jest jeden z chromosomów X u osob-

ników żeńskich, który ulega kondensacji i występuje w jądrze inter-

fazowym w postaci tzw. ciałka Barra. Heterochromatyna konstytutywna

jest frakcją chromatyny, która zawsze występuje w stanie skonden-

sowanym. Zbudowana jest z niekodującycK. sekwencji nukleotydowych,

głównie powtarzalnych sekwencji DNA. Jej replikacja występuje w póź-

nym okresie fazy S.

Chromosomy występujące w jądrze interfazowym są zdespiralizowane

i w obrazie mikroskopowym są widoczne w postaci mało zróżnicowanej

chromatyny, rozprzestrzenionej równomiernie na pbszarze całego jądra

komórkowego. Wiadomo jednak, że chromatyna pojedynczych chromo-

somów zajmuje wyodrębnione-przestrzenie — tzw. domeny, przy czym

domeny chromosomów homologicznych nie mają tendencji do łączenia się.

Tendencje takie natomiast wykazują regiony heterochromatyny konstytutyw-

nej różnych chromosomów, które tworzą większe chromocentra. Chromo-

somy interfazowe zachowują strukturę nukleosomowa.

Liczba chromosomów występująca w jądrze prawidłowej komórki

somatycznej jest określana terminem diploidalnej (2n) liczby chromosomów.

Pojawia się ona podczas zapłodnienia, wtedy bowiem haploidalny (n)

zestaw chromosomów pochodzenia ojcowskiego — zawarty w plemniku —

łączy się z haploidalnym zestawem pochodzenia matczynego — obecnym

stawu A, charakteryzują się niestabilnym zachowaniem w podziałach

mitotycz-nych i mejotycznych. Efektem tego jest zmienność ich liczby

zarówno między osobnikami, jak i pomiędzy komórkami w obrębie

jednego osobnika. Do tej pory nie poznano funkcji tych chromosomów,

chociaż wiadomo, że często są zbudowane z heterochromatyny

konstytutywnej, czyli można przypuszczać, iż są nieaktywne genetycznie.

Drugim przykładem braku stałości liczby chromosomów w obrębie gatunku

jest szerokie rozprzestrzenienie mutacji chromosomowej, np. fuzji

centrycznej u lisów polarnych. Konsekwencją tego jest występowanie u

lisów osobników, które mogą mieć 50,49 lub 48 chromosomów.

2.2. Barwienie prążkowe chromosomów

Zróżnicowanie wewnętrzne chromosomu, wynikające ze stopnia

spiralizacji nici chromatynowej oraz wzajemnego stosunku ilościowego

par nukleo-tydów G-C oraz A-T, może być uwidocznione za pomocą

technik barwienia różnicującego. Zastosowanie przez Casperssona w

1969 roku kwinakryny do barwienia chromosomów otworzyło nowy

rozdział w cytogenetyce. Okazało się, że różnorodne techniki barwienia

chromosomów pozwalają nie tylko na opis ich wielkości i morfologii, ale

także na ujawnianie na nich charakterystycznych wzorów prążków

poprzecznych. Prążki mają identycz-

pojawiają się prążki ciemne i jasne (ryć. 2-8). Prążki ciemne występują

w tych samych miejscach, gdzie przy barwieniu QFQ obserwowane

są prążki świecące, a prążki jasne odpowiadają nie świecącym prąż-

kom Q.

Prążki R, pojawiające się w układzie prążków świecących i nie

świecących (opisywane symbolem RBA) powstają po wbudowaniu bromo-

deoksyurydyny do DNA chromosomów podczas ich replikacji i barwieniu

oranżem akrydyny (ryć. 2-7b). Wzór ten można również uwidocznić

w postaci prążków ciemnych i jasnych (opisywane symbolem RBG), po

zastosowaniu barwnika Giemsy zamiast oranżu akrydyny. Układ prążków

R na danym chromosomie jest odwrotny "do układu prążków GTG oraz

QFQ. Oznacza to na przykład, że prążek R świecący (lub ciemny przy

barwieniu RBG) pojawia się na chromosomie w miejscu, gdzie przy

barwieniu QFQ występuje prążek nie świecący, a przy barwieniu GTG

prążek jasny. Pozytywne prążki R (świecące lub ciemne) są bogatsze

w pary nukleotydów G-C. Zależność ta jest szczególnie interesująca,

ponieważ ponad 50% genów u ssaków poprzedzonych jest sekwencją

powtarzających się niezmetylowanych dinukleotydów CpG (tzw. wysepki

CpG). Zależnie od zawartości par G-C wyróżnia się pięć klas regionów

DNA (izochor) w chromosomach, są to izochory lekkie: LI i L2 oraz

izochory ciężkie: Hl, H2 i H3. Największe zagęszczenie genów występuje

w obrębie izochor H3, w których jest też najwięcej wysepek CpG. Izochory

H3 są lokalizowane przede wszystkim w obrębie prążków T. Wskazuje to

zatem, że prążki R są głównymi regionami, w których zlokalizowane są

geny, a miejscami szczególnie bogatymi w loci genów są prążki T. Są one

podklasą prążków R i powstają po dodatkowym ogrzaniu preparatów

w 90°C.

Powyższe trzy rodzaje wzorów prążkowych wykorzystywane są do

identyfikacji chromosomów homologicznych lub ich fragmentów w przypad-

ku nieprawidłowości chromosomowych. Ponadto, są one niezbędne przy

mapowaniu fizycznym genów, które polega na wskazaniu locus genu (lub

anonimowej sekwencji DNA) w konkretnym chromosomie. Za pomocą

barwień prążkowych możliwe jest również śledzenie zmian ewolucyjnych,

które zaszły w kariotypach zwierząt.

Oprócz opisanych wyżej metod prążkowych, wykorzystywanych do

identyfikacji chromosomów homologicznych, znane są metody, które

pozwalają na uwidocznienie charakterystycznych regionów chromosomu,

takich jak heterochromatyna konstytutywna i obszary jąderkotwórcze.

Prążki C (CBG) wykorzystywane są do ujawnienia miejsc na chromo-

somach bogatych w heterochromatynę konstytutywną. Chromosomy pod-

dawane są działaniu kwasu solnego oraz wodorotlenku baru. W takich

warunkach znaczna część euchromatyny zostaje usunięta, a pozostają

trudne do usunięcia, silnie skondensowane obszary heterochromatynowe,

które się wybarwiają roztworem Giemsy. Heterochromatyna konstytutywna

Bydło, 2n - 60 (ryć. 2-5b). Wszystkie autosomy są akrocentryczne. Chromo-

somy płci są łatwe do identyfikacji, ponieważ są to jedyne w kariotypie

chromosomy dwuramienne: chromosom X jest dużym submetacentrykiem,

a chromosom Y jest małym metacentrykiem. Heterochromatyna konstytu-

tywna (prążki C) występuje w okolicach centromeru we wszystkich

autosomach, natomiast w chromosomie X pojawia się jedynie jako blady

prążek interstycjalny w ramieniu długim, a chromosom Y wykazuje

ciemniejsze zabarwienie na całej długości (ryć. 2-9a). Obszary jąderkotwórcze

(NOR) występują w pięciu parach autosomów na końcu ramion długich.

Koza, 2n = 60. Podobnie jak w przypadku bydła, także koza ma wszystkie

autosomy akrocentryczne. Również akrocentryczny jest chromosom X,

a chromosom Y jest małym metacentrykiem. Prążki C pojawiają się w okolicy

centromerowej wszystkich autosomów. W chromosomie X brak jest centro-

merowego prążka C. Obszary jąderkotwórcze występują, podobnie jak

u bydła, w części telomerowej ramion długich pięciu par autosomów.

Owca, 2n = 54 (ryć. 2-6a). Wśród autosomów występują trzy pary dużych

chromosomów metacentrycznych oraz 23 pary akrocentryków. Chromosom

X jest dużym akrocentrykiem, a chromosom Y jest małym metacentrykiem.

W stadium prometafazy, w którym nie jest jeszcze zakończona kondensacja

chromosomów, w chromosomie X widoczne są krótkie ramiona, co odróżnia

go od autosomów akrocentrycznych o podobnej wielkości. Układ prążków

C, a także rozmieszczenie obszarów jąderkotwórczych są podobne do

obserwowanego w kariotypie bydła i kozy.

Świnia, 2n = 38 (ryć. 2-5a). Grupa chromosomów autosomalnych składa się

z 12 par chromosomów dwuramiennych (meta- i submetacentrycznych)

oraz 6 par akrocentrycznych. Chromosom X jest średniej wielkości metacen-

trykiem, trudnym do odróżnienia na podstawie morfologii od autosomów.

Chromosom Y jest najmniejszym chromosomem metacentrycznym. Prążki

C występują w okolicy centromeru wszystkich autosomów i chromosomu

X, natomiast chromosom Y ma całkowicie heterochromatynowe ramię

długie. W grupie chromosomów akrocentrycznych często obserwowane jest

zjawisko polimorfizmu wielkości prążków C. Obszary jąderkotwórcze

występują w dwóch parach autosomów dwuramiennych, w ramionach

krótkich, w pobliżu centromeru (ryć. 2-10a).

Koń, 2n = 64 (ryć. 2-6b). Wśród autosomów można wyróżnić grupę 13 par

chromosomów dwuramiennych oraz grupę 18 par akrocentryków. Chromo-

som X jest dużym chromosomem metacentrycznym, a chromosom Y jest

akrocentrykiem. Chromosomy płci są trudne do odróżnienia od autosomów

o podobnej wielkości i morfologii. Prążki C występują w okolicach centro-

meru wszystkich autosomów i chromosomu X, który ma dodatkowy prążek

interstycjalny w ramieniu długim. Chromosom Y jest w znacznej części

heterochromatynowy. Obszary jąderkotwórcze występują w trzech parach

autosomów: w części terminalnej ramienia krótkiego największego chromo-

somu oraz w części przycentromerowej dwóch małych akrocentryków

(ryć. 2-10b).

Kura, 2n = 78. W kariotypie kury, podobnie jak u innych ptaków, występuje

liczna grupa bardzo małych chromosomów, nazywanych mikrochromoso-

mami, dla których określenie morfologii oraz wzoru prążkowego jest

niemożliwe. Dlatego szczegółową analizę cytogenetyczną prowadzi się

jedynie w odniesieniu do dużych chromosomów autosomalnych (makro-

chromosomów) i chromosomów płci Z oraz W. W grupie dużych autosomów

analizuje się najczęściej 8 par, wśród których jest 5 par chromosomów

dwuramiennych i 3 pary akroćentryczne. Chromosom Z jest dużym

metacentrykiem, a chromosom W jest małym metacentrykiem. Obszar

jąderkotwórczy występuje tylko w jednej parze autosomów, z grupy

mikrochromosomów.

Lis pospolity, 2n = 34 +B (ryć. 2-7a). Wszystkie autosomy z grupy A są

chromosomami dwuramiennymi, a chromosomy z grupy B są akroćentryczne

lub subtelocentryczne. Chromosom X jest dużym metacentrykiem, a chromo-

som Y bardzo małym akrocentrykiem, którego na podstawie wielkości bądź

morfologii nie można odróżnić od chromosomów B. Liczba chromosomów

B waha się od O do 7, przy czym najczęściej obserwowano l, 2 lub

3 chromosomy B. Kariotyp lisa pospolitego jest wyjątkowo ubogi w hetero-

chromatynę konstytutywną, którą można zidentyfikować barwieniem CBG

jedynie w trzech parach dużych autosomów, w okolicach centromeru, oraz

w chromosomie Y. W chromosomach B ciemny prążek C nie pojawia się

i dzięki temu barwienie CBG pozwala na odróżnienie chromosomu Y od

chromosomów B. Obszary jąderkotwórcze występują w części telomerowej

ramion długich trzech par autosomów z grupy A.

Lis polarny, 2n = 50, 49 lub 48. W związku z szerokim rozprzestrzenieniem

fuzji centrycznej (translokacji robertsonowskiej) obserwuje się trzy formy

kariotypowe różniące się dipłoidalną liczbą chromosomów. U formy pod-

stawowej (2n = 50) występują 22 pary autosomów dwuramiennych i dwie

pary akrocentryków. Chromosom X jest dużym metacentrykiem, a chromo-

som Y bardzo małym akrocentrykiem. Kariotyp tego gatunku jest bardzo

bogaty w heterochromatynę konstytutywną. Wszystkie chromosomy, łącznie

z chromosomami płci, mają bloki heterochromatynowe w okolicy centro-

meru. Ponadto, 10 par dwuramiennych autosomów ma całkowicie hetero-

chromatynowe ramiona krótkie (ryć. 2-9b). Obszary jąderkotwórcze wy-

stępują w sześciu parach autosomów w części telomerowej krótkich ramion

heterochromatynowych.

Pies, 2n = 78 (ryć. 2-8b). Wszystkie autosomy są akrocentryczne. Chromosom

X jest dużym metacentrykiem, a chromosom Y jest małym metacentrykiem.

Heterochromatyna konstytutywna jest umiejscowiona tylko w kilku parach

autosomów. Wyraźne prążki C pojawiają się w okolicach centromerowych

w czterech parach autosomów, chromosomie X (prążek centromerowy i inter-

stycjalny w ramieniu q) i Y. Obszary jąderkotwórcze są obecne w trzech

parach autosomów i chromosomie Y, w części terminalnej ramion długich.

2.3. Mitoza

Mitoza to proces podziału jądra komórkowego, który prowadzi do powstania

dwóch komórek potomnych, mających genotyp identyczny z tym, jaki

miała komórka rodzicielska. Komórki potomne mają nie tylko taką samą

liczbę chromosomów, ale także identyczną sekwencję nukleotydów w DNA.

Podziały mitotyczne są nierozłącznie związane z procesem wzrostu organiz-

mu, odnawianiem niektórych komórek u dorosłych organizmów (np.

komórki krwi, nabłonka), proliferacją limfocytów przy reakcji odpornościowej

organizmu, a także z pierwszymi etapami gametogenezy.

Podział mitotyczny jest jedną z czterech faz występujących w cyklu

życiowym komórki. Fazy Gl, S i G2 tworzą okres międzypodziałowy —

interfazę, a czwartą fazą jest podział. W fazie Gl występuje ekspresja genów

związanych z funkcją danej komórki, a faza S jest związana z procesem

samoodtworzenia się DNA (replikacja). Rozpoczęcie fazy S oznacza, że

komórka zmierza do podziału i dlatego faza G2 jest traktowana jako okres

przygotowywania się komórki do podziału. W cyklu życiowym komórki

zmianie ulega zawartość DNA w jądrze. Jeżeli ilość DNA wyrazimy za

pomocą umownych wartości C, to w jądrze komórkowym po replikacji jest

4C, a począwszy od telofazy do początku fazy S zawartość DNA wynosi 2C.

W trakcie omawiania podziału mej etycznego pokazane zostanie, że naj-

mniejszą zawartość DNA (1C) mają gamety (ryć. 2-11).

Mitoza składa się z czterech faz: profazy, metafazy, anafazy i telofazy (ryć.

2-12). W profazie rozpoczyna się proces kondensacji chromosomów. Istotnym

zmianom podlegają również inne organelle komórkowe. Centriołe, odpowie-

dzialne za powstanie wrzeciona podziałowego, rozchodzą się do przeciwleg-

łych biegunów komórki. W obrębie jądra komórkowego zanikają jąderka,

organelle komórkowe odpowiedzialne za wytwarzanie rybosomów. W końcu,

dezintegracji ulega błona jądrowa. Po zajściu powyższych procesów i osiągnię-

ciu stanu maksymalnej kondensacji chromosomów następuje metafaza. W tej

fazie chromosomy są rozprzestrzenione w całej komórce. Następuje formowa-

nie się wrzeciona podziałowego, którego włókienka, wychodzące z centroso-

mu (obszar wokół centrioli), łączą się z centromerami chromosomów w taki

sposób, że do każdego chromosomu dochodzą włókienka z dwóch przeciw-

ległych biegunów. Chromosomy w tej fazie są łatwym obiektem do badań

z użyciem mikroskopu świetlnego — są krótkie (ich długość jest rzędu kilku

(im) oraz mają wyraźną morfologię. Chromatydy siostrzane są ze sobą

połączone tylko w centromerze. Po ustawieniu się chromosomów w płaszczy-

źnie równikowej komórki rozpoczyna się proces podziału centromeru wzdłuż

osi podłużnej chromosomu. Z chwilą zakończenia tego procesu rozpoczyna

się anafaza. Po podzieleniu chromosomu chromatydy siostrzane stają się

chromosomami siostrzanymi, które pod wpływem kurczących się włókienek

wrzeciona podziałowego przesuwają się do przeciwległych biegunów

komórki. Po ich osiągnięciu rozpoczyna się ostatni etap kariokinezy

— telofaza. W telofazie zachodzą procesy odwrotne do tych, jakie występują

w profazie. Chromosomy ulegają dekondensacji, odbudowuje się błona

jądrowa oraz jąderka, a centriole dzielą się na dwie parzyste struktury.

W wyniku kariokinezy w komórce powstają dwa jądra potomne, mające

taką samą — diploidalną — liczbę chromosomów jak komórka rodzicielska,

w których każdy z chromosomów jest zbudowany z jednej chromatydy. Po

zakończeniu podziału jądra komórkowego następuje cytokineza, czyli

podział cytoplazmy i rozdział organelli komórkowych. Komórka dzieli się

ostatecznie na dwie komórki potomne przez przewężenie w części środ-

kowej. Po zakończeniu podziału komórki potomne odbudowują do nie-

zbędnego poziomu liczbę organelli komórkowych.

2.4. Kariotyp

Uszeregowanie chromosomów, występujących w jądrze komórki somatycz-

nej, w pary homologiczne określane jest terminem kariotyp. Układanie

kariotypu dla danego osobnika polega na zestawieniu par homologicznych

Chromosomy homologiczne rozpoznawane są na podstawie charak-

terystycznych cech morfologicznych, do których zalicza się: długość chromo-

somu, położenie centromeru wyznaczające typ morfologiczny chromosomu

(meta-, submeta-, subtelo- lub akrocentryczny) oraz wzór prążkowy uzys-

kiwany metodami Q, G lub R. Podstawowe znaczenie w układaniu kariotypu

przypisuje się wzorowi prążkowemu, ponieważ posługiwanie się wyłącznie

kryteriami wielkości i typu morfologicznego chromosomu nie pozwala na

precyzyjną identyfikację wszystkich par homologicznych. Jest to spowodo-

wane tym, że często chromosomy z różnych par są podobnej wielkości

i reprezentują ten sam typ morfologiczny. Skrajnym tego przykładem mogą

być zestawy chromosomowe bydła, kozy i psa, w których wszystkie

Ryć. 2-13. Kariotyp knura (barwienie metodą prążków G) uszeregowany zgodnie ze

wzorcem ustalonym przez Komitet ds. Standaryzacji Kariotypu Świni. Chromosomy

pochodzą z płytki metafazowej przedstawionej na ryć. 2-8a

zróżnicowane pod względem morfologicznym, precyzyjne sporządzenie

kariotypu z pominięciem technik prążkowych jest niemożliwe. Przykładem

może być kariotyp świni (2n = 38), w którym rozróżnienie niektórych par

wymaga zastosowania technik prążkowych (ryć. 2-13).

Graficzne przedstawienie kariotypu, obejmujące schematyczne obrazy

poszczególnych chromosomów z zaznaczonym położeniem centromeru

i układem prążków, nazywa się idiogramem (ryć. 2-14).

Opracowanie kariotypu, czasami określanego kariogramem, dla konkret-

nego osobnika polega na uszeregowaniu par chromosomów homologicznych

zgodnie z międzynarodowym wzorcem, przyjętym dla danego gatunku. We

wzorcu poszczególnym parom chromosomowym przyporządkowane są

kolejne numery, w zakresie wyznaczonym przez liczbę par dla danego

gatunku. Każda para homologiczna ma opisaną morfologię, wielkość oraz

wzór prążkowy (najczęściej prążki G lub R). Ponadto, dla poszczególnych

par mogą być wskazane prążki charakterystyczne (ang. landmarks). Prążek

taki (lub prążki) dzieli (-ą) ramię chromosomowe na regiony, które są

numerowane (ryć. 2-14). W obrębie regionów numerowane są także kolejne

prążki, które zależnie od zastosowanej metody barwienia mogą być ciemne

i jasne lub świecące i nie świecące. Tak opracowany idiogram stanowi

bardzo ważne narzędzie służące do opisywania mutacji chromosomowych

oraz mapowania genów w chromosomach.

Pierwsze wzorce kariotypów opracowano podczas Konferencji Standary-

zacyjnej, która odbyła się w 1976 roku w Reading (W. Brytania). Opracowano

wówczas wzorce kariotypów barwionych metodą prążków G dla: bydła, świni,

konia, owcy, kozy i kota. W latach 80. powstały wzorce dla lisa polarnego

i pospolitego oraz opublikowano ulepszone wzorce dla świni, bydła, owcy, kozy

i konia. Natomiast w drugiej połowie lat 90. opracowano częściowo wzorce

kariotypu psa (obejmujący 22 pary spośród 39) i kury (obejmujący 9 najwięk-

Tabela 2-11

Wykaz gatunków, dla których uzgodniono międzynarodowe wzorce kariotypów

Gatunek

Wzory
prążkowe

Źródło

Bydło

G, Q, R

Cytogenetics and Celi Genetks 92:283-299, 2001

Owca

G, Q, R

jw. i 85:317-324, 1999

Koza

Świnia

G, R

Hereditas 109:151-157, 1988

Koń

G, R

Chromosome Research 5:433-443, 1997

Lis polarny

G, C, Ag-I

Hereditas 103:33-38, 1985

Lis pospolity

G, C, Ag-I

Hereditas 103:171-176, 1985

Królik

Cytogenetics and Celi Genetks 31:240-248, 1981

Pies

Chromosome Research 4:306-309, 1996

Kura

G, R

Cytogenetics and Celi Genetks 86:271-276, 1999

szych par spośród 39) oraz poprawiono wzorzec kariotypu konia. Obecnie

są prowadzone prace nad uzgodnieniem wzorca kariotypu norki. W tabeli

2-II zestawione są gatunki, dla których opracowano wzorce, z zaznaczeniem

zastosowanych metod prążkowego barwienia chromosomów.

2.5. Mejoza

Podział mejotyczny prowadzi do powstania komórek, w których liczba

chromosomów jest zredukowana o połowę, czyli osobniki o dipoidalnej

liczbie chromosomów wytwarzają gamety z haploidalną ich liczbą. Komórki

po podziale mejotycznym mają zrekombinowaną informację genetyczną, tzn.

w ich genomie powstają unikatowe kombinacje alleli pochodzenia ojcowskie-

go i matczynego. Ponadto, komórki te mają zmniejszoną do poziomu 1C

zawartość DNA. Przedstawiona wyżej ogólna charakterystyka mejozy

wskazuje równocześnie na najważniejsze różnice między mitozą i mejozą.

Mejoza składa się z dwóch podziałów, w których występują takie same

fazy jak w mitozie, tzn.: profaza, metafaza, anafaza i telofaza (ryć. 2-15).

Wejście komórki w podział mejotyczny poprzedzone jest, podobnie jak

w przypadku podziałów mitotycznych, replikacją DNA w fazie S. Komórka

rozpoczynająca podział mejotyczny zawiera 4C DNA.

W profazie pierwszego podziału mejotycznego wyróżnia się pięć stadiów:

leptoten, zygoten, pachyten, diploten i diakinezę. Podczas profazy I zachodzą

ogólne zmiany o charakterze cytologicznym, które występują również

w mitozie. Należą do nich: kondensacja chromosomów, dezintegracja błony

jądrowej, zanik jąderek oraz rozchodzenie się centrioli do przeciwległych

biegunów komórki. Oprócz tego w profazie I zachodzą bardzo ważne

procesy mające podstawowy wpływ na dalszy przebieg podziału. W zygo-

tenie rozpoczyna się koniugacja chromosomów homologicznych, polegająca

na łączeniu się i ścisłym przyleganiu na całej długości chromosomów

homologicznych. Koniugacja chromosomów zachodzi dzięki specjalnej

strukturze białkowej, pojawiającej się w zygotenie i pachytenie profazy I,

która jak spoiwo łączy ze sobą dwa ułożone równolegle chromosomy

homologiczne. Strukturą tą jest kompleks synaptonemalny (ang. synapto-

nemal complex — SC), który składa się z dwóch elementów lateralnych oraz

występującego pomiędzy nimi elementu centralnego (ryć. 2-16 i 2-17).

Między elementami lateralnymi występują guzki (ciałka) rekombinacyjne,

które są zespołem białek odpowiedzialnych za przeprowadzenie crossing

over. Element lateralny przylega do rdzeni białkowych chromatyd sios-

trzanych chromosomu, a element centralny powstaje w miejscu, gdzie

włókienka poprzeczne wychodzące z elementów lateralnych zazębiają się.

Każdy element lateralny zakończony jest tarczką przylegającą, która mocuje

chromosom do wewnętrznej strony błony jądrowej. Elementy lateralne

łączą się tylko z niewielką częścią DNA chromosomów (około 1%). Pozostała

część DNA jest ułożona wzdłuż chromosomu w postaci tzw. domen

pętlowych, których długość, zależnie od gatunku, mieści się w granicach od

20 000 pz (inaczej 20 kpz) do 120 000 pz (120 kpz). Wynika z tego, że tylko

niewielka część DNA homologicznych chromosomów kontaktuje się między

sobą za pośrednictwem kompleksu synaptonemalnego. Ponieważ koniugacja

ma charakter homologiczny, to białka kompleksu synaptonemalnego łączą

się ze ściśle określonymi, chociaż jeszcze nie poznanymi, sekwencjami

DNA, występującymi w tej części domen pętlo wy ch, które są zakotwiczone

w rdzeniu białkowym chromatydy. Wiele wskazuje na to, że fragmenty

DNA kontaktujące się z białkami SC są bogate w powtarzające się tan-

demowo sekwencje mikrosatelitarne oraz rozproszone elementy nukleo-

tydowe (LINĘ i SINE). Badania białek SC pokazały, że zdecydowana ich

większość jest syntetyzowana tylko w komórkach dzielących się mejotycznie.

U ssaków dobrze poznano strukturę trzech białek SCP (ang. synaptonemal

complex protein): SCP1, SCP2 i SCP3. Białko SCP1 występuje w obrębie

elementu centralnego i spełnia podstawową rolę w spinaniu struktury

biwalentu. Białka SCP2 i SCP3 uczestniczą w budowie elementów lateral-

nych. Funkcja kompleksów synaptonemalnych była powszechnie łączona

z przeprowadzeniem koniugacji chromosomowej, która z kolei miała

umożliwiać zajście crossing over na początku pachytenu. Ostatnio prze-

prowadzone badania pokazały jednak, że crossing over może zajść, zanim

dojdzie do koniugacji za pośrednictwem SC. Koniugacja chromosomów

niewielkim regionom pseudoautosomalnym (ang. pseudoautosomal region

— PAR), które uruchamiają homologiczną koniugację. Na początku pachy-

tenu występuje zjawisko crossing over, które polega na wymianie fragmen-

tów chromatyd niesiostrzanych w obrębie biwalentu. Zasadniczo crossing

over jest zdarzeniem losowym, tzn. zachodzi w przypadkowym miejscu

biwalentu, przy czym liczba tych zdarzeń waha się od l do 5. Losowość

zachodzenia crossing over jest jednak ograniczona. Wiadomo, że wystąpienie

crossing over w określonym miejscu chromosomu wpływa ograniczająco na

możliwość zajścia crossing over w pobliżu. Zjawisko to określane jest

terminem interferencji. Przyjmuje się, że ogólna liczba crossing over

w komórce dzielącej się mejotycznie jest ograniczona. Potencjalnie mogłoby

istnieć niebezpieczeństwo, że na jednych chromosomach liczba ta byłaby

znaczna, a na innych brak byłoby takich wymian. Miałoby to bardzo

negatywny wpływ na proces segregacji chromosomów w anafazie I,

ponieważ brak crossing over pociąga za sobą brak chiazm. Ponieważ tak się

nie dzieje, dlatego poszukiwano mechanizmu gwarantującego równomier-

ność występowania crossing over. Mechanizmem tym jest wspomniane

wcześniej zjawisko interferencji, a w świetle ostatnich badań można

przypuszczać, że SC jest w to istotnie zaangażowany. Losowość crossing

over naruszona jest również przez to, że zachodzi ono rzadziej w pobliżu

centromeru, a częściej w końcowych częściach ramion chromosomowych —

w obrębie prążków T, które są podklasą prążków R. Należy podkreślić, że

crossing over jest zjawiskiem obligatoryjnym, czyli musi zajść w obrębie

każdego biwalentu. Zasada ta dotyczy także biwalentu X-Y, gdzie crossing

over występuje w obrębie regionu pseudoautosomalnego. Crossing over

prowadzi do powstania nowych układów alleli w obrębie pojedynczej

chromatydy. Chromatyda, która uczestniczyła w wymianie, uzyskuje kombina-

cję alleli pochodzenia ojcowskiego i matczynego, w przeciwieństwie do

sytuacji, jaka była przed crossing over. Wówczas to chromosom, a tym samym

i jego chromatydy, miał zestaw alleli tylko jednego z rodziców, co wynika

z zasady, że w obrębie pary chromosomów homologicznych jeden pochodzi

od ojca, a drugi od matki. Crossing over jest jednym z trzech mechanizmów

odpowiedzialnych za rekombinację genetyczną (mowa jest o tym na końcu

tego podrozdziału), której efektem jest zmienność w świecie ożywionym.

Należy jednak pamiętać, że pierwotnym źródłem zmienności są mutacje,

które — jeśli się pojawią — podlegają rekombinacjom podczas mejozy.

Po zakończeniu pachytenu — w diplotenie, następuje rozkład komplek-

sów synaptonemalnych, poza miejscami, gdzie wystąpiło crossing over,

w których powstają chiazmy, stanowiące cytologiczny dowód zajścia crossing

over. W ostatnim stadium profazy I — diakinezie kontynuowana jest

kondensacja chromosomów oraz rozpoczyna się proces terminalizacji chiazm,

tzn. ich zanikania.

W metafazie I biwalenty, składające się z maksymalnie skondensowanych

chromosomów homologicznych, zmierzają do płaszczyzny równikowej

komórki (ryć. 2-18a). Włókna wrzeciona podziałowego rozpoczynają proces

łączenia biegunów komórki z centromerami w taki sposób, że do centromeru

przyłączają się włókna tylko z jednego bieguna, natomiast do centromeru

chromosomu homologicznego wiążą się włókna z bieguna przeciwległego.

Po zakończeniu terminalizacji chiazm rozpoczyna się anafaza I, w której

chromosomy homologiczne rozchodzą się do przeciwległych biegunów

komórki (ryć. 2-18b). Oznacza to, że do każdego z biegunów zmierza po

jednym chromosomie z każdej pary homologicznej, czego wynikiem jest

zmniejszenie o połowę liczby chromosomów w jądrach powstałych po

pierwszym podziale mejotycznym. W telofazie następuje odbudowa jądra

połączona z dekondensacją chromosomów (ryć. 2-18c).

Po zakończeniu pierwszego podziału mejotycznego następuje drugi

podział, który nie jest poprzedzony replikacją DNA. Tym samym jądro

komórkowe rozpoczynające drugi podział mejotyczny zawiera 2C DNA.

Drugi podział ma przebieg zgodny z mitozą, z tym jednak że uczestniczy

w nim już tylko haploidalna liczba chromosomów, a ich chromatydy mają

zrekombinowane układy alleli. Po ustawieniu się chromosomów podczas

metafazy II (ryć. 2-18d) w płaszczyźnie równikowej następuje podział

centromeru i rozpoczyna się anafaza II. Włókna wrzeciona podziałowego

rozciągają chromatydy siostrzane do przeciwległych biegunów komórki.

Gdy jednochromatydowe chromosomy siostrzane osiągną bieguny, rozpo-

czyna się telofaza, w której zachodzą procesy odwrotne do tych, jakie

występują w profazie mitotycznej.

Po zakończeniu podziału mej etycznego zawartość DNA w jądrach

komórkowych maleje do poziomu 1C. Chromosomy haploidalnego zestawu są

zbudowane z pojedynczych chromatyd, wśród których jedne są pochodzenia

ojcowskiego, inne matczynego, a niektóre mają zrekombinowany układ alleli.

Rekombinacje genetyczne zachodzące podczas mejozy, rozumiane w sze-

rokim sensie, można podzielić na: chromosomowe, chromatydowe i we-

wnątrzchromatydowe. Podczas pachytenu profazy I w wyniku crossing

over powstają chromatydy składające się z fragmentów o pochodzeniu

ojcowskim i matczynym — jest to rekombinacja wewnątrzchromatydowa

(rekombinacja w ścisłym sensie). W trakcie anafazy I chromosomy homo-

logiczne rozchodzą się losowo do przeciwległych biegunów komórki.

W wyniku tego procesu w telofazie I powstają jądra komórkowe zawierające

kombinacje chromosomów pochodzenia ojcowskiego i matczynego, przy

czym chromatydy tych chromosomów mogą być już zrekombinowane —

jest to rekombinacja chromosomowa. Wreszcie w anafazie II do przeciwleg-

łych biegunów komórki rozchodzą się losowo chromatydy, które mogą być

zrekombinowane lub mieć układ alleli pochodzenia ojcowskiego albo

matczynego. Ten typ określany jest jako rekombinacja chromatydowa.

Trzystopniowa rekombinacja sprawia, że wśród gamet nie występują

dwie o tym samym zestawie alleli. Ten fenomen, obok mutacji, jest

główną przyczyną obserwowanej ogromnej zmienności genetycznej wśród

organizmów.

2.6. Gametogeneza

Proces tworzenia gamet jest nierozłącznie związany z podziałem mejotycz-

nym. Przebieg mejozy, a w tym czas i tempo tego podziału oraz procesy

prowadzące do powstania w pełni wykształconych gamet sprawiają, że

pomiędzy gametogenezą męską (spermatogeneza) i żeńską (oogeneza)

występują znaczne różnice.

Gametogeneza męska przebiega w kanalikach plemnikotwórczych gona-

dy męskiej — jądrach. W procesie spermatogenezy można wyróżnić trzy

główne etapy: 1) podziały mitotyczne spermatogonii (spermatogoniogeneza),

2) podział mejotyczny spermatocytów (spermatocytogeneza) oraz 3) spermio-

geneza, która prowadzi do powstania z niezróżnicowanych haploidalnych

spermatyd wyspecjalizowanych gamet męskich — plemników (ryć. 2-19).

Intensywne podziały mitotyczne spermatogonii w jądrach dojrzałych

samców umożliwiają masowe wytwarzanie plemników. Pierwszy podział

prowadzi do powstania dwóch spermatogoniów, z których jedna komórka

zajmuje miejsce pierwotnego spermatogonium, a druga podlega dalszym

podziałom. Taki sposób podziału pierwotnego spermatogonium jest typowy

dla komórek pierwotnych (ang. stem cells), czyli komórek nie w pełni

zróżnicowanych, które wykazują zdolność do samoodnawiania. Następne

podziały mitotyczne spermatogoniów, a jest ich najczęściej sześć, nie kończą się

cytokinezą. Podziały te są zsynchronizowane, a powstające kolejne pokolenia

spermatogonii są połączone mostkami cytoplazmatycznymi. Po zakończeniu

cyklu mitoz spermatogonia przekształcają się w spermatocyty I rzędu, które

rozpoczynają podział mejotyczny. Również kolejnym dwóm podziałom

mejozy nie towarzyszy cytokinezą. Ostatecznie, po zakończeniu mejozy,

powstaje grupa licząca kilkaset spermatyd połączonych mostkami

cytoplazmatycznymi, która jest określana jako syncytium. Spermatydy, jako

komórki niezróżnicowane, podlegają głębokim przeobrażeniom podczas

procesu spermiogenezy, w wyniku którego powstają plemniki. Główne

zmiany, jakie zachodzą podczas spermiogenezy, polegają na: 1) przekształceniu

aparatu Golgiego w akrosom, który okrywa górną część jądra komórkowego

znajdującego się w główce plemnika, 2) zgrupowaniu mitochondriów w

pobliżu centrioli, które są umiejscowione po przeciwnej, w stosunku do

akrosomu, stronie jądra komórkowego, 3) wykształceniu na bazie centrioli

włókna osiowego witki, 4) usunięciu prawie całej cytoplazmy obecnej w

spermatydzie i 5) zamianie białek histonowych na białka protaminowe w

chromosomach, czego skutkiem jest utrata struktury nukleosomowej przez

chromatynę jądra plemnika. Dojrzały plemnik zbudowany jest z główki, w

której jest umiejscowione jądro komórkowe i akrosom, wstawki znajdującej się

u podstawy główki, w której zgrupowane są mitochondria, oraz witki, która

stanowi przedłużenie wstawki.

Gametogeneza żeńska u ssaków rozpoczyna się już w życiu płodowym

(ryć. 2-20). Po ukierunkowaniu rozwoju osobniczego na płeć żeńską

niezróżnicowane gonady płodowe przekształcają się w jajniki, w których

komórki linii płciowej lokują się w części korowej gonad. Pierwotne oogonia po

przejściu kilku podziałów mitotycznych przekształcają się w oocyty I

rzędu, które niezwłocznie rozpoczynają podział mejotyczny. W przypadku

bydła następuje to około 60 dnia rozwoju płodowego. Oocyty I rzędu po

osiągnięciu stadium diplotenu profazy I mejozy zatrzymują rozwój. Stan ten

osiągany jest u bydła powyżej 100 dnia rozwoju płodowego. Oocyty

przechodzą w stan spoczynkowy, który jest nazywany diktiotenem. W ten

sposób wszystkie oogonia, które występowały w jajniku, zostają przekształ-

cone w oocyty I rzędu, będące w stadium diktiotenu. Umieszczone są one

zazwyczaj pojedynczo w pierwotnych pęcherzykach jajnikowych.

Dalsze etapy oogenezy następują po osiągnięciu przez samicę dojrzałości

płciowej. W kolejnych cyklach płciowych, regulowanych hormonalnie,

pewna część pęcherzyków rozpoczyna wzrost, a w nich rozrasta się również

oocyt, który jest wspomagany przez otaczające komórki pęcherzykowe.

W pęcherzykach, których wzrost był wystarczająco intensywny, przed

owulacją następuje ponowne uruchomienie podziału mejotycznego. Oocyt

I rzędu kończy pierwszy podział mejotyczny, w wyniku którego powstaje

oocyt II rzędu oraz ubogie w cytoplazmę ciałko kierunkowe. Oocyt znajduje

się w stadium metafazy II. Obie komórki umieszczone są w glikoproteinowej

osłonce przejrzystej (zona pellucida) i w takim stadium rozwoju dochodzi do

owulacji. Komórki przemieszczają się w jajowodzie i jeżeli podczas wędrówki

natrafią na plemniki, to może nastąpić dokończenie oogenezy. Tym samym

zapłodnienie jest niezbędnym warunkiem zakończenia oogenezy.

Zapłodnienie oocytu przez plemnik stymuluje dokończenie mejozy

żeńskiej, przy równoczesnym zablokowaniu dostępu innych plemników do

wnętrza oocytu. Dzieje się to na drodze wyrzucenia przez oocyt zawartości

po zakończeniu drugiego podziału mejotycznego. Chromosomy przedjądrza

żeńskiego podlegają dekondensacji i równolegle z chromatyną przedjądrza

męskiego przechodzą proces replikacji DNA. Zawartość DNA wzrasta do

poziomu 4C, co powoduje, że zygota jest gotowa do rozpoczęcia podziału

mitotycznego. Chromosomy ulegają kondensacji i początkowo nadal wy-

stępują jako dwa oddzielne zestawy chromosomów, z tym jednak że każdy

z nich jest zbudowany z dwóch chromatyd siostrzanych. W stadium

metafazy pierwszego podziału mitotycznego zygoty dochodzi do połączenia

się przedjądrzy (syngamii), a dalej następuje anafaza oraz telofaza i powstaje

zarodek zbudowany z dwóch komórek (blastomerów), który dalej będzie

wzrastał na drodze kolejnych podziałów mitotycznych.

Od przedstawionego wyżej schematu oogenezy występują odstępstwa

u niektórych gatunków. Na przykład, profaza I nie zostaje zakończona

w życiu płodowym u psa i niektórych gryzoni. U gatunków tych można

znaleźć oocyty I rzędu w stadium pachytenu w jajnikach nowo urodzonych

osobników żeńskich. Z kolei u królika owulacja jest bezpośrednio in-

dukowana przez akt krycia lub inseminacji.

Poznanie procesów gametogenezy oraz wczesnego rozwoju zarodkowego

umożliwiło rozwój biotechnologii gamet i zarodków. W hodowli zwierząt

na szeroką skalę stosowane są następujące biotechniki wspomagające rozród:

konserwacja nasienia w niskich temperaturach (kriokonserwacja), insemina-

cja, przenoszenie zarodków (stadium moruli lub blastocysty) pozyskanych

od tzw. samic dawczyń do rogów macicy tzw. samic biorczyń, kriokonser-

wacja zarodków i zapłodnienie pozaustrojowe (in vitro). Ostatnio do praktyki

hodowlanej wprowadzane są kolejne techniki, które umożliwiają uzys-

kiwanie potomstwa pożądanej płci. Należy do nich oznaczanie płci zarodków

i segregowanie plemników na frakcję z chromosomem X i frakcję z chromo-

somem Y. Warto zauważyć, że zarówno produkcja zwierząt modyfikowa-

nych genetycznie (zwierzęta transgeniczne), jak i klonowanie zwierząt

również bazują na manipulacjach prowadzonych na oocytach II rzędu,

zygotach, zarodkach, a także hodowanych w warunkach pozaustrojowych

komórkach somatycznych. Jedna z najpowszechniej obecnie wykorzysty-

wanych technik dotyczy manipulacji na oocytach II rzędu, z których

usunięto mikrochirurgicznie wrzeciono podziałowe (chromosomy w stadium

metafazy II). Do takich oocytów, które są określane jako enukleowane,

można wprowadzić techniką elektrofuzji komórkę somatyczną, pochodzącą

z hodowli pozaustrojowej (komórka taka może być zmodyfikowana gene-

tycznie). W taki właśnie sposób sklonowano słynną owcę Doiły, do uzyskania

której wykorzystano komórkę nabłonkową pochodzącą z gruczołu mleko-

wego dorosłej owcy.

Rozdział

Gen i jego ekspresja

Znaczenie kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) jako nośnika informacji

genetycznej zostało udowodnione w 1944 roku dzięki eksperymentowi,

który polegał na transformacji niepatogennych bakterii — dwoinek zapalenia

płuc z wykorzystaniem DNA wyizolowanego ze szczepu patogennego.

Efektem tego doświadczenia było nabycie przez niektóre bakterie niepatogen-

ne cech zjadliwości. Badania te przeprowadzili badacze amerykańscy

O.T. Avery, C.M. MacLeod i M. McCarty. W ślad za tym odkryciem

nastąpiły następne. W 1953 roku J.D. Watson i F. Crick przedstawili model

budowy DNA, a przez następne lata rozszyfrowywano kod genetyczny,

przypisując poszczególnym trójkom nukleotydów odpowiednie aminokwasy.

DNA charakteryzuje się trzema właściwościami, które są niezbędne do

pełnienia funkcji nośnika informacji genetycznej. Po pierwsze, w sekwencji

nukleotydów zapisana jest, za pomocą kodu genetycznego, informacja

o pierwszorzędowej strukturze białek, a także o strukturze cząsteczek

rybosomowego (rRNA), transportującego (tRNA) i niekodującego (ncRNA)

kwasu rybonukleinowego. Po drugie, DNA ma zdolność do samood-

twarzania się, czyli replikacji. Po trzecie, DNA może podlegać mutacjom,

czyli procesowi generującemu pierwotną zmienność genetyczną, które

z kolei podlegają rekombinacjom podczas mejozy.

3.1. Budowa kwasów nukleinowych

Zapis informacji genetycznej oraz jej ujawnienie się w postaci cechy

(ekspresja genu) związane są z funkcjonowaniem kwasów nukleinowych.

U zdecydowanej większości organizmów nośnikiem informacji genetycznej

jest DNA. Tylko u nielicznych wirusów (retrowirusy) informacja genetyczna

jest zawarta w kwasie rybonukleinowym (RNA). Z kolei proces ekspresji

genu jest nierozerwalnie związany z RNA, występującym w trzech pod-
stawowych wariantach: mRNA (informacyjny RNA) — powstający podczas
transkrypcji genu, rRNA (rybosomowy RNA) — stanowiący część struk-
turalną rybosomów, które są organellami komórkowymi odpowiedzialnymi
za przeprowadzenie translacji, i tRNA (transportujący RNA), który jest
zaangażowany w proces translacji poprzez dostarczanie do rybosomów
właściwych aminokwasów.

3.1.1. DNA

Cząsteczka DNA składa się z dwóch owiniętych prawoskrętnie wokół siebie
łańcuchów polinukleotydowych. Struktura ta określana jest w języku polskim
terminem podwójna helisa (ang. helix), a rzadziej podwójny heliks. Pod-
stawową jednostką struktury DNA jest deoksyrybonukleotyd, w którego
skład wchodzą: zasada azotowa, cukier deoksyryboza i reszta kwasu
fosforowego (ryć. 3-1). W DNA występują cztery zasady azotowe, które
zaliczane są do puryn: adenina (A) i guanina (G) lub pirymidyn: ty mina (T)
i cytozyna (C). W rdzeniu każdego łańcucha polinukleotydowego cząsteczki
deoksyrybozy połączone są ze sobą poprzez resztę kwasu fosforowego
wiązaniami fosfodiestrowymi między atomem węgla w pozycji 5' jednej
cząsteczki cukru i atomem węgla 3' sąsiedniej cząsteczki deoksyrybozy.
Cząsteczki zasad azotowych połączone są wiązaniami N-glikozydowymi

z atomami węgła występującymi w pozycji l' cząsteczki deoksyrybozy i są

skierowane do wnętrza podwójnej helisy. Ułożenie zasad azotowych

w łańcuchach polinukleotydowych podwójnej helisy DNA oparte jest na

zasadzie komplementarności, tzn. naprzeciw adeniny zawsze występuje

tymina, a naprzeciw guaniny znajduje się cytozyna. Taka organizacja

podwójnej helisy DNA sprawia, że sekwencja nukleotydów w jednej nici

jest różna od sekwencji nukleotydów w drugiej nici. Pomiędzy zasadami

powstają słabe wiązania wodorowe; tak więc w parze AT są dwa wiązania

wodorowe, a w parze GC trzy takie wiązania. Długość cząsteczki DNA

wyraża się liczbą par nukleotydów, lecz częściej stosuje się określenie liczba

par zasad (skrót: pz w jęz. polskim lub bp od słów angielskich base pairs),

bo skierowane do wnętrza podwójnej helisy zasady azotowe stanowią jakby

szczeble drabiny.

Łańcuchy polinukleotydowe DNA są przeciwnie spolaryzowane. Polary-

zacja łańcucha związana jest z występowaniem na jego końcach wolnych

atomów węgla, czyli każdy łańcuch ma koniec 3' i 5'. Przeciwna polaryzacja

polega na tym, że naprzeciw końca 3' jednego łańcucha znajduje się koniec

5' drugiego łańcucha. Polaryzacja łańcuchów ma bardzo ważne znaczenie

dla przebiegu procesu replikacji i transkrypcji, a w przypadku mRNA także

dla procesu translacji. Zwijające się wokół siebie łańcuchy polinukleotydowe

tworzą na powierzchni podwójnej helisy dwie bruzdy biegnące spiralnie.

Ze względu na ich szerokość określa się je jako bruzdę większą i mniejszą.

3.1.2. RNA

Kwasy rybonukleinowe są cząsteczkami zbudowanymi z pojedynczych

łańcuchów polinukleotydowych, w których zamiast deoksyrybozy występuje

ryboza oraz zamiast zasady pirymidynowej — tyminy (T) występuje inna

pirymidyna — uracyl (U).

W ogólnej puli RNA występujących w komórce najliczniej reprezen-

towany jest rybosomowy RNA (rRNA), który wraz z białkami tworzy

strukturę rybosomów i uczestniczy w przeprowadzaniu translacji. W jąderku

zlokalizowane są cztery rodzaje rRNA, które są wyróżniane ze względu na

wielkość cząsteczki, określaną wielkością S — stała sedymentacji. Trzy

rodzaje rRNA: 5.8S, 18S i 28S są kodowane przez geny umiejscowione

w obszarach jąderkotwórczych (ang. nucleolar organizer region — NOR),

inaczej nazywanych przewężeniami wtórnymi. Podczas transkrypcji, pro-

wadzonej przez polimerazę I RNA, powstaje pre-rRNA o stałej sedymentacji

45S, z której po obróbce formowane są wspomniane wyżej trzy rodzaje

rRNA. Przyjmuje się, że w obszarze jęderkotwórczym występuje nawet

kilkadziesiąt powtórzeń genu kodującego prekursorową cząsteczkę 45S

rRNA, którego długość wynosi około 14 000 pz. Liczba tych obszarów jest

cechą charakterystyczną kariotypu danego gatunku, natomiast liczba aktyw-

nych obszarów, czyli takich, które podlegają transkrypcji, jest zmienna.

Czwarty rodzaj — 5S rRNA jest kodowany przez gen, występujący w wielu

powtórzeniach w innej części genomu. Geny 5S rRNA są transkrybowane

przez polimerazę III RNA. Wymienione rodzaje rRNA uczestniczą w budo-

wie rybosomu, zatem 18S rRNA występuje w podjednostce małej (40S)

rybosomu, a trzy pozostałe rodzaje, tzn. 5S, 5.8S i 28S, zlokalizowane są

w podjednostce dużej (60S).

Dobrze poznanym rodzajem RNA jest transportujący RNA (tRNA), który

jest zaangażowany w dostarczanie aminokwasów do rybosomów. Tak jak

w przypadku innych cząsteczek RNA także i ten rodzaj zbudowany jest

z pojedynczego łańcucha polinukleotydowego. W nici takiej mogą jednak

występować fragmenty komplementarne, które po połączeniu wiązaniami

wodorowymi między komplementarnymi zasadami azotowymi tworzą struk-

turę przestrzenną takiej cząsteczki. Cząsteczka tRNA jest zbudowana z mniej

niż 100 nukleotydów, a jej struktura jest bardzo charakterystyczna i przypo-

mina liść koniczyny (ryć. 3-2). W strukturze tRNA wyróżnia się cztery pętle:

1) pętla I (licząc od końca 5') — uczestniczy w wiązaniu się z enzymem

syntetazą aminoacylową, która katalizuje związanie tRNA z.właściwym

aminokwasem;

2) pętla II — antykodonowa, zawiera układ trzech nukleotydów, które

są komplementarne do kodonu aminokwasu transportowanego przez tRNA;

3) pętla III — dodatkowa, o mało poznanej funkcji;

4) pętla IV — zaangażowana jest w wiązanie się kompleksu aminoacylo-

-tRNA z rybosomem.

Na końcu 3' cząsteczki tRNA występuje sekwencja CCA, w której do

rybozy nukleotydu adenylowego jest przyłączany aminokwas. Liczba

różnych cząsteczek tRNA występujących w komórce zawiera się w przedziale

od 40 do 60, co oznacza, że przekracza liczbę znanych aminokwasów.

Informacyjny RNA (mRNA) powstaje podczas transkrypcji genów

ulegających ekspresji w komórce i z tego względu jest to najbardziej
zróżnicowana klasa kwasów rybonukleinowych. Struktura cząsteczek mRNA
jest opisana w części dotyczącej procesu transkrypcji.

Na uwagę zasługuje jeszcze jedna klasa RNA, określana terminem

niekodujący RNA (ncRNA — ang. noncoding RNA). Ostatnie badania
wykazują, że jest to bardzo ważna grupa RNA, która bierze udział w procesie
wycinania intronów z pre-mRNA, modyfikacji nukleotydów, a także regulacji
ekspresji genów.

3.2. Replikacja DNA

Proces samoodtwarzania się (replikacji) DNA przebiega w fazie S cyklu
życiowego komórki i jest niezbędnie potrzebny do przeprowadzenia
podziału jądra komórkowego, czyli mitozy, bądź mejozy. Każdy podział
mitotyczny musi być poprzedzony replikacją. Podobnie jest w przypadku
mejozy, z tym jednak że przed drugim podziałem mejotycznym nie
dochodzi do replikacji. Z powodu ogromnej długości cząsteczek DNA
zawartych w chromosomach replikacją rozpoczyna się równocześnie w wielu
miejscach, które określane są jako replikony. Replikon zawiera miejsce
rozpoczęcia i zakończenia replikacji. Na przykład, liczba replikonów w ge-
nomie ssaków szacowana jest na około 25 000, a średnia wielkość jednego
replikonu wynosi około 150 000 par nukleotydów.

Replikacja obejmuje dwa zasadnicze etapy: rozplecenie podwójnej helisy

DNA i dobudowanie komplementarnych łańcuchów polinukleotydowych.

W ten sposób powstają tzw. widełki replikacyjne (ryć. 3-3). Rozplecione

łańcuchy polinukleotydowe stanowią matryce, na których w sposób komple-

mentarny syntetyzowane są drugie łańcuchy. Wynika z tego, że po replikacji

dwie nowo powstałe cząsteczki DNA składają się z jednego starego łańcucha

i jednego nowego. Taki sposób replikacji nazywany jest semikonserwatyw-

nym (półzachowawczym). Przyłączanie kolejnych nukleotydów katalizowane

jest przez enzym polimerazę DNA, który odpowiada za powstanie wiązania

estrowego między atomem węgla 3' (wolna grupa 3'-OH) wydłużanego

łańcucha i nowym nukleotydem (trifosforanem nukleozydu). Oznacza to, że

kierunek budowania komplementarnego łańcucha jest ściśle określony

i postępuje od końca 5' w kierunku 3' (5'

→3'). W efekcie tylko na jednym

łańcuchu matrycowym replikującej cząsteczki DNA dobudowywanie nowego

łańcucha przebiega w sposób ciągły. Na drugim łańcuchu dobudowywane są

krótkie fragmenty (tzw. fragmenty Okazaki), które następnie są łączone przez

enzym ligazę w ciągłą nić. Nić syntetyzowana w sposób ciągły jest nazywana

prowadzącą, a nić powstająca w sposób nieciągły opóźnioną.

3.3. Kod genetyczny

Informacja genetyczna jest zapisana w DNA za pomocą kodu genetycznego,

mającego charakter trójkowy, tzn. trzy kolejne nukleotydy (kodon, tryplet)

w DNA zawierają informację o aminokwasie, który ma być wbudowany

w procesie biosyntezy białka. Ponieważ każdy kodon składa się z trzech

spośród czterech nukleotydów, to ogółem możliwe jest utworzenie 64 trójek

(tab. 3-1). Wśród nich jest 61 trójek sensownych oraz trzy kodony nonsen-

sowne, tzn. takie, które nie kodują żadnego aminokwasu, a ich wystąpienie

powoduje zatrzymanie procesu biosyntezy polipeptydu. Tryplet AUG, który

odpowiada za wbudowanie metioniny w łańcuchu polipeptydowym, roz-

poczyna część kodującą genu. Komplementarne ułożenie nukleotydów

w dwóch łańcuchach polinukleotydowych cząsteczki DNA sprawia, że

sekwencje nukleotydów w tych łańcuchach, w obrębie danego odcinka

DNA, są różne. Tym samym tylko jeden z tych łańcuchów zawiera informację

i nić ta nazywana jest sensowną. Drugi, komplementarny łańcuch polinu-

kleotydowy pełni funkcję matrycy (nić matrycowa) w procesie transkrypcji.

Kod genetyczny ma kilka cech o podstawowym znaczeniu dla jego

funkcjonowania. Po pierwsze, kod ma charakter trójkowy, o czym była już

mowa wyżej. Po drugie, jest on uniwersalny, tzn. w całym świecie

ożywionym funkcjonuje ten sam system kodowania informacji genetycznej.

Od tej zasady są tylko nieliczne wyjątki, które dotyczą niektórych kodonów

w mitochondrialnym DNA, np. kodon UGA w kodzie uniwersalnym jest

kodonem stop, a w mitochondrialnym DNA ssaków odpowiada za włączenie

tryptofanu do łańcucha polipeptydowego. Po trzecie, kod genetyczny jest

zdegenerowany, co wynika z faktu znacząco większej liczby kodonów niż

aminokwasów. W rezultacie prawie każdy aminokwas, z wyjątkiem metio-

niny i tryptofanu, jest kodowany przez więcej niż jedną trójkę (maksymalnie

przez sześć kodonów, w przypadku leucyny i argininy). Po czwarte, kod

genetyczny jest nie zachodzący na siebie i bezprzecinkowy, czyli kodony są

ułożone kolejno jeden za drugim bez nukleotydów je rozdzielających.

W efekcie podczas translacji sekwencja nukleotydów w mRNA jest od-

czytywana w sposób ciągły.

3.4. Transkrypcja

Pierwszym etapem procesu ekspresji genu jest transkrypcja, która polega na

syntezie informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA) na matrycowej

nici DNA. Transkrypcja rozpoczyna się od rozplecenia podwójnej helisy

DNA i przyłączenia polimerazy RNA do sekwencji promotora, która

poprzedza część strukturalną genu. Związanie się polimerazy RNA z pro-

motorem jest uzależnione od równoczesnego przyłączenia się w tym miejscu

zespołu białek (czynniki transkrypcyjne), które kontrolują przebieg transkryp-

cji. Łańcuch mRNA jest syntetyzowany w kierunku od końca 5' do końca 3'

(5'

→3'), czyli kierunek tej reakcji jest taki sam jak przy replikacji. Z kolei

matrycowa nić DNA (komplementarna do nici sensownej) jest odczytywana

w kierunku 3'

→5'. Dzięki temu powstający mRNA ma sekwencję nukleoty-

dów zgodną z sekwencją nici sensownej DNA (ryć. 3-4). Ponieważ u organiz-

mów eukariotycznych geny zbudowane są w części strukturalnej z fragmen-

tów kodujących (eksony) i niekodujących (introny), to z pierwotnego

transkryptu FINA (pre-mRNA) muszą być usunięte introny. Proces polegający

na ich wycinaniu nazywany jest składaniem RNA (ang. splicing) i stanowi

istotną część tzw. obróbki potranskrypcyjnej pre-mRNA, która jest drugim

etapem ekspresji genu. Poza wycięciem intronów, na końcu 3' mRNA

dobudowana jest sekwencja poliA, a na końcu 5' dołączona zostaje 7-metylo-
guanozyna (tzw. czapeczka lub inaczej kapturek, ang. cap). Podczas transkryp-
cji powstają obok cząsteczek mRNA, pełniących funkcję matrycy, na której
syntetyzowany jest łańcuch polipeptydowy, także inne cząsteczki kwasów
rybonukleinowych, mających zasadniczą rolę w translacji (tRNA i rRNA).

3.5. Translacja

Po zakończeniu obróbki potranskrypcyjnej mRNA przechodzi do cytoplazmy i
tam łączy się z rybosomami, co rozpoczyna kolejny etap ekspresji genu,
jakim jest translacja. W procesie tym na matrycy mRNA budowany jest
łańcuch polipeptydowy (ryć. 3-5). Synteza łańcucha polipeptydowego
rozpoczyna się zawsze od aminokwasu metioniny, który jest kodowany
przez trójkę nukleotydów AUG znajdującą się na końcu 5' mRNA. Metionina
łączy się z tzw. inicjatorowym tRNA dla metioniny i taki kompleks jest
wiązany z rybosomem, a antykodon tego tRNA wiąże się komplementarnie
z pierwszym kodonem na końcu 5', jakim jest zawsze AUG. Następnie do
rybosomu dostarczany jest kolejny aminokwas, przez właściwy tRNA,
którego antykodon jest komplementarny do drugiego kodonu mRNA. Po
wprowadzeniu drugiego aminokwasu dochodzi do powstania wiązania
peptydowego między nim i metioniną w taki sposób, że nie związana grupa
karboksylowa pierwszego aminokwasu — metioniny łączy się z nie związaną
grupą aminową drugiego aminokwasu. Wynika z tego, że polipeptyd jest
wydłużany od końca NH

do końca COOH. Zsyntetyzowany dipeptyd

jest związany z tRNA dla drugiego aminokwasu, a rybosom przesuwa się
o jeden kodon w kierunku końca 3' uwalniając jednocześnie inicjatorowy
tRNA dla metioniny. Synteza łańcucha polipeptydowego postępuje w ten
sposób do momentu, kiedy rybosom obejmie jeden z trzech kodonów
nonsensownych, a więc kodonów stop (UAA, UAG lub UGA). Z chwilą
osiągnięcia kodonu stop następuje zakończenie translacji i uwolnienie
łańcucha polipetydowego. Uwolniony łańcuch polipeptydowy podlega
modyfikacjom potranslacyjnym, w wyniku których zostaje uformowana
ostateczna postać białka. Modyfikacje potranslacyjne obejmują zmiany
dotyczące wiązań chemicznych (np. rozerwanie wiązania peptydowego)
w obrębie polipeptydu, modyfikacje końca aminowego lub karboksylowego
polipeptydu oraz modyfikacje łańcuchów bocznych aminokwasów wcho-
dzących w skład polipeptydu. Ostatnia z wymienionych kategorii modyfi-
kacji potranslacyjnych jest najczęściej spotykana i polega na przyłączaniu
różnych grup chemicznych w wyniku np.: glikozylacji (przyłączanie reszt
cukrowych), fosforylacji (przyłączanie grup fosforanowych, głównie reszty
kwasu fosforowego), metylacji (przyłączanie grupy metylowej), acetylacji
(przyłączanie grupy reszty acetylowej) itp.

czyli alleli. Zatem, cechą genu jest także podleganie mutacjom, które

mogą się ujawniać fenotypowo. Należy jednak zaznaczyć, że nie każda

mutacja przejawia się fenotypowo. Jeśli mutacja nie zmieni sensu zapisu

genetycznego, np. zmutowany kodon odpowiada za włączenie tego

samego aminokwasu co kodon niezmutowany (kod genetyczny jest

zdegenerowany) lub mutacja wystąpi w obrębie intronu (introny są

wycinane w trakcie obróbki potranskrypcyjnej pre-mRNA), to ujawnienie

fenotypowe nie nastąpi. Mutacja nie wywołująca zmiany w budowie

kodowanego produktu doprowadzi jedynie do powstania allelu, którego

obecność może być wykryta poprzez bezpośrednie badanie DNA. W takiej

sytuacji można mówić o polimorfizmie DNA danego genu. Gen jest

również podstawową jednostką uczestniczącą w rekombinacji genetycznej

podczas podziału mejotycznego. Pod względem molekularnym gen

jest regionem DNA, który podlega transkrypcji. W ramach genu ro-

zumianego jako jednostka transkrypcyjna należy wyróżnić część struk-

turalną genu, czyli ten fragment DNA, w którym zawarta jest informacja

genetyczna o produkcie (białko, rRNA, tRNA), oraz sekwencje regu-

latorowe, które odpowiadają za uruchomienie transkrypcji (ryć. 3-6).

Część strukturalna genu składa się z eksonów, czyli sekwencji, które

po transkrypcji uczestniczą w translacji, oraz intronów, które są wycinane

z pre-mRNA podczas składania RNA (ang. splicing) i nie uczestniczą

w translacji. Oprócz tego z obu stron części strukturalnej (na końcu

5' i 3') występują sekwencje oskrzydlające (ang. untranslated region —

UTR) części kodujące pierwszego i ostatniego eksonu. Sekwencje oskrzy-

dlające nie podlegają translacji. Zgodnie z wcześniej opisanym fenomenem

polarności cząsteczki DNA należy podkreślić, że początek genu znajduje

się na końcu 5', a koniec genu na końcu 3'. Pierwszy ekson (koniec 5')

rozpoczyna sekwencja ATG, która koduje metioninę (kodon AUG w mRNA)

— pierwszy aminokwas każdego polipeptydu. Z kolei na końcu 3' genu, po

sekwencji „stop" (kodony TAA, TAG lub TGA), pojawia się sekwencja

AATAAA, która koduje sygnał rozpoczęcia poliadenylacji pre-mRNA

podczas obróbki potranskrypcyjnej, a za nią znajduje się sekwencja (GT)n

odpowiedzialna prawdopodobnie za zakończenie transkrypcji.

Część regulatorowa genu obejmuje sekwencje promotora, wzmacniacza

(ang. enhancer) i wyciszacza (ang. silencer). Promotor bezpośrednio

poprzedza część strukturalną genu i pełni kluczową rolę w rozpoczęciu

transkrypcji. W obrębie promotora występują dwie sekwencje o szcze-

gólnym znaczeniu. W odległości około 30 pz od miejsca inicjacji trans-

krypcji występuje sekwencja TATA (ang. TATA-box), której obecność

jest niezbędna do przyłączenia polimerazy II RNA. Przyłączenie polimerazy

wymaga równoczesnego powiązania grupy białek (czynniki transkryp-

cyjne) z promotorem. Sekwencja CAAT znajduje się około 70-90 pz

przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Przypuszcza się, że również

ta sekwencja bierze udział w procesie regulacji transkrypcji. Warto

wreszcie zwrócić uwagę, że większość genów (około 56%) zawiera

w obrębie promotora sekwencję składającą się z licznych powtórzeń

dinukleotydu CG, które są nazywane wysepkami CpG. Wysepki CpG

towarzyszą wszystkim genom ulegającym powszechnej ekspresji, tzn.

we wszystkich komórkach. Są to geny pełniące funkcję gospodarza

komórki (ang. housekeeping genes), czyli ich ekspresja jest konieczna

do funkcjonowania komórki.

Sekwencje regulujące typu wzmacniacza i wyciszacza mogą być położone

w znacznej odległości od genu, którego ekspresja znajduje się pod ich

kontrolą, dzięki oddziaływaniu na nie czynników transkrypcyjnych. Wzmac-

niacz jest odpowiedzialny za nasilenie transkrypcji genu, a wyciszacz za

spowolnienie tego procesu. Położenie tych sekwencji względem genu jest

bardzo zróżnicowane i może występować przed lub za genem, a nawet

w jego obrębie, w jednym z intronów.

Wielkość genu, a konkretnie jego części strukturalnej, mieści się w bardzo

szerokich granicach od kilkuset par nukleotydów (pz) do ponad dwóch

milionów pz. Przykładem bardzo małego genu jest gen SR

, który zawiera

tylko jeden ekson, składający się z 669 nukleotydów. Produktem tego genu

jest białko o długości 223 aminokwasów, odpowiedzialne za ukierunkowanie

rozwoju niezróżnicowanej gonady płodowej w jądro. Gigantycznym genem

jest ludzki gen DMD kodujący białko dystrofinę, które jest zbudowane

z 3685 aminokwasów. Gen ten jest zbudowany z około 2,5 min pz i w jego

skład wchodzi 79 eksonów i 78 intronów, ale tylko 0,6% długości tego genu

obejmuje część kodującą. Mutacje w tym genie odpowiedzialne są za rozwój

groźnej choroby genetycznej człowieka — dystrofii mięśniowej Duchenne'a,

która prowadzi do zaniku mięśni.

3.7. Regulacja ekspresji genu

W genomie ssaków występuje około 35 tysięcy genów. Wśród nich znaczną

grupę stanowią geny pełniące tzw. funkcje gospodarza komórki (ang.

housekeeping genes). Produkty kodowane przez te geny są zaangażowane

w podstawowe procesy życiowe komórki, takie jak: przemiany energetyczne,

replikacja DNA, budowa struktur komórkowych itp. Geny z tej grupy

podlegają ekspresji we wszystkich komórkach. Warto pamiętać, że w komór-

ce somatycznej każdy gen (oprócz genów położonych w chromosomach

płci u samców) reprezentowany jest przez dwa allele, które mogą wy-

stępować w układzie homo- lub heterozygotycznym, co ma oczywiście

związek z ekspresją genów.

Podczas rozwoju ontogenetycznego, obok genów ulegających powszech-

nej ekspresji, jest włączana i wyłączana ekspresja różnych genów, zależnie

od tego, w jakim kierunku różnicuje się dana komórka. Z drugiej strony,

w zróżnicowanej komórce ekspresja niektórych genów może być okresowo

włączana lub wyłączana. Jest to bardzo złożony proces, którego całościowe

poznanie wymaga jeszcze wielu lat badań. Niemniej znanych jest już wiele

mechanizmów, które są zaangażowane w kontrolę ekspresji genów, czyli

ich fenotypowe ujawnianie się w postaci odpowiedniej cechy. Ekspresja

genu obejmuje procesy: transkrypcji, potranskrypcyjnej modyfikacji mRNA,

translacji i potranslacyjnej modyfikacji białka. Ukształtowane w ten sposób

białko można zidentyfikować i analizować metodami laboratoryjnymi (np.

elektroforeza białek, badania serologiczne — grupy krwi, hybrydyzacja ze

znakowanym przeciwciałem itp.) lub też można obserwować właściwość

fenotypową organizmu będącą efektem obecności określonego białka (np.

umaszczenie, obecność rogów, podatność na stres itp.). W przypadku cech

uwarunkowanych przez dużą liczbę genów o nie poznanej jeszcze funkcji

(tzw. poligeny, wśród których geny o działaniu sumującym mają podsta-

wowe znaczenie) fenotyp opisuje się za pomocą estymatorów statystycznych.

Regulacja ekspresji genów zachodzi najczęściej na poziomie transkrypcji,

zatem poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za podjęcie transkrypcji

przez dany gen ma znaczenie podstawowe. Należy jednak pamiętać, że

kontrola ekspresji może również polegać na potranskrypcyjnej modyfikacji

mRNA, regulacji stabilności mRNA i jego transporcie do cytoplazmy oraz

potranslacyjnej modyfikacji białek. Modyfikacja mRNA, oprócz zmian

opisanych w podrozdziale poświęconym transkrypcji, obejmuje także inne

procesy. Podczas wycinania intronów możliwe jest zróżnicowane składanie

ostatecznego transkryptu, w skład którego będą wchodziły różne kombinacje

eksonów. Mechanizm ten nazywa się alternatywnym składaniem mRNA.

Budowa mRNA może być modyfikowana również przez wybór miejsca

terminacji transkrypcji. Zakończenie transkrypcji związane jest z sekwencją

AAUAAA, która wskazuje, że w odległości około 10-30 nukleotydów od

tego miejsca powinna nastąpić poliadenylacja transkryptu, czyli dobudowa-

nie sekwencji poliA (tzw. ogonek poliA) na końcu 3' mRNA. Okazuje się, że

niektóre geny mogą mieć kilka miejsc poliadenyłacji i dlatego na tej samej

matrycy DNA mogą powstawać różne transkrypty. Przykładem takiej sytuacji

jest występowanie dwóch miejsc poliadenyłacji w genie łańcucha ciężkiego

immunoglobulin. Forma rozpuszczalna tego białka powstaje na matrycy

mRNA, który jest krótszy o dwa eksony w porównaniu z mRNA dla formy

zakotwiczonej w błonie plazmatycznej limfocytów B. Wreszcie mRNA

powstały podczas transkrypcji może ulegać, przed przejściem do cytoplazmy,

modyfikacjom polegającym na zmianie sekwencji nukleotydów. Proces ten

nazywa się redagowaniem mRNA. Efektem tego może być na przykład

pojawianie się w transkryptach, powstających w niektórych tkankach,

dodatkowego kodonu stop. Funkcjonują wówczas dwa rodzaje mRNA,

powstałe na bazie tego samego matrycowego DNA, odpowiedzialne za

syntezę polipeptydów o różnej długości. Taką formę modyfikowania mRNA

opisano m.in. w przypadku niektórych genów kodowanych przez mito-

chondrialny DNA (mtDNA). Intensywność procesu biosyntezy łańcuchów

polipeptydowych zależy od liczby kopii mRNA wędrujących z jądra do

cytoplazmy oraz od czasu trwania mRNA w cytoplazmie, czyli od jego

stabilności.

3.7.1. Czynniki transkrypcyjne

Czynnikami transkrypcyjnymi nazywane są białka, które wiążąc się z sek-

wencjami regulatorowymi genu umożliwiają przyłączenie polimerazy RNA

i rozpoczęcie transkrypcji. Białka te w swojej strukturze zawierają dwa

istotne obszary. Jeden odpowiada za wiązanie się czynnika transkrypcyjnego

z właściwą sekwencją nukleotydów w obrębie promotora lub wzmacniacza,

a drugi obszar zaangażowany jest w łączenie się z polimerazą RNA lub

innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Czynniki transkrypcyjne, zależnie od

ich struktury trzeciorzędowej, są zaliczane do następujących grup: białka

zawierające tzw. palce cynkowe (ang. zinc finger), białka o strukturze typu

heliks-skręt-heliks (ang. helix-turn-helix) i białka o strukturze określanej

terminem zamek leucynowy (ang. leucine zipper). Wymienione struktury

wchodzą w kontakt z nicią DNA.

Ekspresja genów kodujących czynniki transkrypcyjne może zależeć od

innych czynników transkrypcyjnych lub pozostawać pod kontrolą stymula-

torów pozakomórkowych, takich jak hormony. Sposób oddziaływania

hormonów na ekspresję genów jest zróżnicowany (ryć. 3-7). W przypadku

hormonów steroidowych regulacja ekspresji genów przebiega z udziałem

receptorów wewnątrzkomórkowych. Hormon steroidowy po wniknięciu do

komórki łączy się z właściwym białkiem receptorowym. Kompleks hor-

mon-receptor wnika do jądra komórkowego i tam wiąże się z sekwencjami

regulatorowymi genu docelowego lub genu kodującego odpowiedni czynnik

Ryć. 3-7. Schemat regulacji ekspresji genów za pomocą hormonów. Oznaczenia:

HP — hormon peptydowy, HS — hormon steroidowy, R — receptor hormonu pep-

tydowego, RS — receptor hormonu steroidowego, T

— przekaźniki wewnątrzkomór-

kowe, P

— promotory genów, Gj, G

— części strukturalne genów

transkrypcyjny uczestniczący w regulacji ekspresji kolejnego genu. Receptor

hormonu steroidowego ma domenę wiążącą DNA oraz domenę wiążącą

hormon. Domena wiążąca DNA jest aktywna tylko wówczas, gdy do

receptora jest przyłączony hormon steroidowy. Hormony peptydowe (np.

hormon wzrostu, insulina itp.) nie wnikają do wnętrza komórki, a jedynie

wiążą się z receptorami błonowymi. Wiązanie takie wywołuje wiele reakcji.

W ich wyniku sygnał zostaje przeniesiony od zaktywowanego receptora

błonowego do jądra komórkowego za pomocą wewnątrzkomórkowych

przekaźników, których mechanizm działania jest jeszcze słabo rozpoznany,

lub też z udziałem przekaźników modyfikujących białka w cytoplazmie, co

można uznać za regulację ekspresji genów na etapie potranslacyjnym.

3.7.2. Geny homeotyczne

Ukształtowanie się wielokomórkowego organizmu z jednokomórkowej

zygoty zależy z jednej strony od intensywnych podziałów komórkowych,

a z drugiej strony od różnicowania się komórek. Poznanie genów od-

powiedzialnych za rozwój zarodkowy i płodowy ma podstawowe znaczenie

dla zrozumienia podłoża licznych wrodzonych wad rozwojowych. Postęp

w tym obszarze wiedzy osiągnięto dzięki badaniom prowadzonym na muszce

owocowej. Rozwój muszki owocowej przebiega pod kontrolą genów, które

odpowiadają za poszczególne etapy morfogenezy. Geny te funkcjonują

w układzie hierarchicznym, tzn. ich ekspresja następuje w ściśle określonej

kolejności. Najpierw uaktywniają się geny odpowiedzialne za orientację

zarodka na część przednią i tylną. Następnie kilka grup genów kieruje

ukształtowaniem się segmentów ciała wzdłuż osi podłużnej. Wreszcie za

różnicowanie się poszczególnych segmentów odpowiadają geny homeotyczne,

które w genomie muszki owocowej występują w dwóch kompleksach, ANT-C

i BX-C, położonych w jednym chromosomie. Pierwszy segment zawiera geny

odpowiedzialne za różnicowanie głowy i przedniej części tułowia, a drugi za

różnicowanie tylnych segmentów tułowia i segmentów odwłoka. W obrębie

kompleksu loci genów ułożone są w porządku włączania ich ekspresji.

Ekspresja kolejnych genów odpowiada za różnicowanie się kolejnych segmen-

tów ciała. Struktura tych genów wykazuje zaskakujące podobieństwo. Okazało

się, że mają one sekwencję o długości około 180 pz (tzw. homeoboks), która

koduje fragment białka (tzw. domena białkowa) o długości 60 aminokwasów.

Domena ta jest odpowiedzialna za utworzenie struktury charakterystycznej dla

czynników transkrypcyjnych typu heliks-skręt-heliks.

Geny o podobnej budowie i funkcji zidentyfikowano także u kręgowców

i nazwano je genami HOX. U ssaków geny te, w liczbie około 30, zgrupowane

są w czterech kompleksach: HOX1, HOX2, HOX3 i HOX4.

3.7.3. Metylacja DNA

Ważnym procesem wpływającym na ekspresję genów jest modyfikacja

struktury DNA, która polega przede wszystkim na przyłączaniu grupy

metylowej do cytozyny. Metylacja wywołuje zmianę powinowactwa DNA

do czynników transkrypcyjnych oraz reorganizację nici nukleosomowej,

czego skutkiem jest przejście DNA w stan nieaktywny. Oznacza to, że

metylacja DNA w sekwencjach regulatorowych może mieć istotne znaczenie

dla ekspresji genu. Prawie cały DNA zawiera zmetylowaną cytozynę,

a wyjątek stanowią dinukleotydy CpG (wysepki CpG) występujące w obrębie

promotorów w genach aktywnych transkrypcyjnie. Do promotorów mają-

cych niezmetylowaną cytozynę w wysepkach CpG mogą się przyłączyć

czynniki transkrypcyjne niezbędne do ekspresji genu. Trzeba jednak

podkreślić, że nie wszystkie geny mają w obrębie promotora sekwencje

CpG — szacuje się, że około 56% genów zawiera te sekwencje. Wynika

z tego, że brak metylacji wysepek CpG nie jest uniwersalnym sposobem

uaktywniania ekspresji genów. Obok wielu genów, których transkrypcja

jest hamowana poprzez metylację cytozyny w nukleotydach występujących

w części poprzedzającej gen, czyli ze strony końca 5', znane są liczne

geny, dla których nie obserwuje się zależności między transkrypcją i me-

tylacją DNA.

Metylacja cytozyny nie narusza komplementarności wiązania z guaniną,

czyli nie wpływa na prawidłowość replikacji wysepek CpG. Po replikacji

nowo wbudowane nukleotydy zawierające cytozynę podlegają metylacji,

wówczas gdy w matrycowej cząsteczce DNA naprzeciw guaniny występowa-

ła metylowana cytozyna. Stan metylacji DNA badany jest z użyciem dwóch

enzymów restrykcyjnych. Jeden z nich -— HpaII przecina sekwencję CCGG,

w której cytozyny nie są metylowane, a drugi — MspI przecina tę sekwencję

niezależnie od tego, czy cytozyna jest metylowana, czy niemetylowana.

3.7.4. Piętno gametyczne

W klasycznym podejściu do zagadnienia ekspresji genów przyjmuje się

równoważność alleli w parze, tzn. genotyp Aa jest równoważny genotypowi

aA, czyli nieistotne jest, od którego z rodziców pochodzi allel A, a od którego

allel a. Jednak w przypadku niektórych genów stwierdza się zróżnicowaną

ekspresję, zależną od tego, czy allel pochodzi od ojca, czy od matki. Zjawisko

to niekiedy dotyczy całych regionów chromosomowych, które mogą być

nieaktywne, gdy pochodzą np. od matki, lub aktywne, jeśli pochodzą od ojca.

Piętnowanie alleli czy całych regionów chromosomu związane jest prawdo-

podobnie z metylacją DNA i występuje podczas gametogenezy (ang. gametic

imprinting). Piętno utrzymuje się podczas rozwoju zarodkowego i płodowe-

go, a także w komórkach somatycznych organizmu dorosłego. Dopiero

podczas gametogenezy dotychczasowe piętno gametyczne zostaje zniesione

i ustala się wzór piętna, typowy dla danej płci (ryć. 3-8).

Dowód na to, że do rozwoju osobniczego niezbędny jest zarówno

genom ojca, jak i genom matki, a nie tylko diploidalna liczba chromosomów,

znaleziono przy okazji obserwacji rozwoju partenogenetycznych zarodków

myszy. Powstałe na drodze manipulacji zarodki ginogenetyczne, tzn.

zawierające dwa genomy żeńskie, rozwijały się dość dobrze, z tym jednak

że struktury wywodzące się z trofoblastu, czyli uczestniczące w formowaniu

łożyska, były zdecydowanie niedorozwinięte. Natomiast zarodki androge-

netyczne, tzn. mające dwa genomy męskie, dobrze rozwijały struktury

trofoblastu, niedorozwinięty zaś był sam zarodek. W obu przypadkach

dochodziło do obumarcia zarodka. Jedynie zarodki zawierające zarówno

genom żeński, jak i męski rozwijały się prawidłowo.

Piętno gametyczne prowadzi do zróżnicowanego fenotypowo ujawnienia

się niektórych mutacji chromosomowych, w które zaangażowane są frag-

menty podlegające piętnowaniu. Przykładem niech będzie delecja fragmentu

przycentromerowego ramienia długiego chromosomu 15 (delecja 15ql-q3)

u ludzi. Jeśli pacjent odziedziczył tak uszkodzony chromosom od ojca, to

M P

ZYGOTA ZYGOT-A

2ENSKA

MĘSKA

Ryć. 3-8. Piętnowanie gametyczne. Fragment podlegający piętnowaniu w spermatoge-
nezie jest zaciemniony, a fragment piętnowany w oogenezie jest zaznaczony kolorem
czerwonym. P — chromosom pochodzący od ojca, M — chromosom pochodzący od matki

wówczas rozwija się zespół zmian fenotypowych (m.in. otyłość i niedorozwój

umysłowy), który nosi nazwę zespołu Pradera-Willego. Natomiast odziedzi-

czenie takiej samej mutacji od matki wywołuje zespół zmian (m.in. głębokie

upośledzenie umysłowe, brak mowy, drgawki) określanych jako zespół

Angelmana. Przyjmuje się, że fragment chromosomu 15 podlega piętnowaniu

gametycznemu. W zespole Pradera-Willego stan jest następujący: brakuje

fragmentu w chromosomie odziedziczonym od ojca, a odpowiedni homo-

logiczny fragment w chromosomie pochodzącym od matki nie podlega

ekspresji. W efekcie pacjent nie ma żadnej aktywnej kopii genów wy-

stępujących w części chromosomu objętego delecją. Podobna sytuacja

powstaje, gdy paq"ent ma dwie kopie tego fragmentu chromosomowego

pochodzące od matki (matczyna disomia). W zespole Angelmana brakuje

fragmentu chromosomu 15 pochodzenia matczynego, a ekspresja od-

powiadającego fragmentu chromosomu ojcowskiego jest wyłączona lub

pacjent ma dwie ojcowskie kopie tego fragmentu chromosomowego (disomia

ojcowska). Wiadomo, że w zespole Pradera-Willego występuje utrata

ekspresji wielu genów pochodzenia ojcowskiego, podczas gdy w zespole

Angelmana dotyczy to właściwie tylko jednego genu (UBE3A — ang.

ubiquitin protein ligase E3) pochodzenia matczynego. Wynika z tego, że

w krytycznym regionie 15ql-15q3 inny fragment jest piętnowany w game-

togenezie męskiej, a inny w gametogenezie żeńskiej. Tak więc, tylko jeden

gen — UBE3A nie podlega ekspresji, jeśli pochodzi od ojca, natomiast kilka

genów (m.in. gen SNRPN — ang. smali nuclear ribonucleoprotein polypep-

tide N), nie ulega ekspresji, jeśli są położone w chromosomie pochodzącym

od matki.

W zygocie oraz we wszystkich potomnych pokoleniach komórek soma-

tycznych stan napiętnowania genu (-ów) jest utrzymywany. Może się

jednak zdarzyć, że gen napiętnowany podczas gametogenezy będzie

powtórnie piętnowany podczas rozwoju osobniczego. Nałożenie się obu

rodzajów piętnowania oraz obecność tkankowe specyficznego białka (czyn-

nik transkrypcyjny) regulującego ekspresję genu prowadzi do ostatecznego

ukształtowania się wzoru ekspresji genu w kolejnych stadiach rozwojowych

i odpowiednich tkankach. Przykładem może być gen Igf2 (ang. insulin

growth factor type 2) u myszy, który podlega piętnowaniu podczas

gametogenezy żeńskiej. W genie tym występują dwa regiony, które

podlegają metylacji. W stadium przedimplantacyjnym zarodka oba allele

(ojcowski i matczyny) podlegają ekspresji, a w zarodkach starszych oraz

komórkach osobnika dorosłego występuje monoalleliczna ekspresja genu

matczynego. Sytuacja ta jest spowodowana tym, że piętnowanie w gameto-

genezie żeńskiej prowadzi do metylacji miejsca, do którego nie może się

przyłączyć białko (represor), wywołujące zahamowanie transkrypcji. W efek-

cie oba allele są transkrybowane. Podczas wtórnego piętnowania dochodzi

do metylacji fragmentu promotora genu ojcowskiego, co oczywiście unie-

możliwia przyłączenie czynników transkrypcyjnych, niezbędnych do pod-

jęcia transkrypcji. Powoduje to wstrzymanie ekspresji allelu ojcowskiego.

Szczegółowe badania przeprowadzone u myszy ujawniły obecność wielu

regionów chromosomowych, które są objęte zjawiskiem piętnowania game-

tycznego. Na przykład, duże fragmenty chromosomu 7, a także 11 i 12

podlegają piętnowaniu. Obecnie znane są 34 geny, które podlegają pięt-

nowaniu gametycznemu u myszy.

3.7.5. Inaktywacja chromosomu X w zarodkach żeńskich

Szczególnym przykładem trwałej inaktywacji dużej części chromatyny jest

fenomen związany z inaktywacją jednego z chromosomów X w zarodkach

żeńskich. W komórkach męskich występuje tylko jeden chromosom X, obok

chromosomu Y. Stan taki określany jest terminem hemizygotyczności.

W komórkach żeńskich występują dwa chromosomy X, ale podobnie jak

w komórkach męskich tylko jeden chromosom X wykazuje aktywność

transkrypcyjną. Okazało się, że inaktywacją chromosomu X jest formą

piętnowania, które zachodzi podczas wczesnego rozwoju zarodkowego.

W momencie przejęcia kontroli nad rozwojem zarodka przez jego własny

genotyp oba chromosomy X są aktywne w zarodkach żeńskich (układ XX).

W momencie przechodzenia ze stadium moruli do stadium blastocysty

następuje losowa inaktywacją jednego z chromosomów X, czyli aktywny

pozostaje albo chromosom pochodzenia ojcowskiego, albo matczynego.

Wzór inaktywacji jest następnie utrzymany we wszystkich komórkach

potomnych. W konsekwencji organizm żeński jest swoistą mozaiką, w której

część komórek ma aktywny chromosom pochodzenia ojcowskiego, a część

pochodzenia matczynego (ryć. 3-9). Inaktywowany chromosom X podlega

kondensacji (heterochromatynizacji) w jądrze interfazowym, a jego obecność

ujawnia się w postaci tzw. ciałka Barra. W cyklu życiowym komórki

chromosom ten podlega typowym przemianom związanym z okresową

kondensacją (przed i w trakcie podziału jądra komórkowego) i niepełną

dekondensacją (podczas interfazy). Rozróżnienie aktywnego i nieaktywnego

chromosomu X w metafazie mitotycznej jest możliwe po zastosowaniu

metody barwienia prążkami R, które odzwierciedlają tempo replikacji

poszczególnych regionów chromosomowych. Barwienie to pokazuje, że

nieaktywny chromosom X jest replikowany w późnym okresie fazy S.

Proces inaktywacji rozpoczyna się od miejsca określanego jako centrum

inaktywacji chromosomu X. Wiadomo, że w ludzkim chromosomie X cent-

rum to występuje w ramieniu długim w obrębie prążka Xql3. W centrum

inaktywacji zidentyfikowano locus Xist (ang. X inactive specific transcript),

który pełni główną rolę w uruchomieniu inaktywacji. Początkowo ekspresji

podlega tylko gen Xist położony w chromosomie ojcowskim i to odbywa się

jeszcze przed rozpoczęciem procesu inaktywacji chromosomu X. Później,

ekspresja genu Xist pojawia się losowo, albo w chromosomie ojcowskim,

albo matczynym. W ślad za ekspresją genu Xist w jednym z chromosomów

X przebiega stopniowo inaktywacja kolejnych regionów tego chromosomu.

Inaktywacja jest związana z metylacją DNA danego chromosomu, który to

stan jest utrzymywany w komórkach potomnych. Warto zaznaczyć, że

produktem locus Xist jest niekodujący RNA (ncRNA). Spełnia on funkcję

regulacyjną, w zakresie zmiany struktury chromatyny inaktywowanego

chromosomu X.

Rozdział

4.1. Endonukleazy restrykcyjne

Analiza materiału genetycznego może być przeprowadzana bezpośrednio

w komórkach (tzw. metody in situ) bądź w wyizolowanym DNA lub RNA.

Większość metod wymaga fragmentacji (pocięcia; strawienia) DNA, co

umożliwia np. wyizolowanie określonego odcinka DNA lub podzielenie

cząsteczki DNA danego organizmu na krótsze fragmenty do dalszych

szczegółowych badań. W celu przecięcia cząsteczki DNA w ściśle określonym

miejscu stosowane są izolowane z bakterii endonukleazy restrykcyjne,

nazywane inaczej enzymami restrykcyjnymi bądź restryktazami.

Endonukleazy restrykcyjne służą bakteriom do obrony przed inwazją

wirusów, niszcząc niepożądane, obce cząsteczki DNA. W celu ochrony

własnego DNA przed działaniem restryktaz, bakterie wykształciły system

restrykcji-modyfikacji. System ten polega na tym, że bakterie wytwarzają

dwa rodzaje enzymów. Jeden to endonukleazy, rozpoznające i przecinające

(inaczej trawiące) określone sekwencje nukleotydów, drugi to metylotrans-

ferazy (zwane też metylazami), które rozpoznają te same sekwencje

nukleotydów i modyfikują (metylują) je tak, by nie zostały przecięte przez

endonukleazy. Ponieważ obcy, np. wirusowy, DNA nie jest odpowiednio

oznaczony (zmetylowany), niszczony jest przez endonukleazy bakterii.

Obecnie znanych jest już ponad 1000 restryktaz (w handlu dostępnych jest

ponad 200) i tyleż samo metylaz.

Nazewnictwo endonukleaz tworzone jest w ten sposób, że pierwsza

litera stanowi skrót nazwy rodzaju bakterii, druga i trzecia — gatunku,

następnie może być również stosowana litera określająca nazwę szczepu lub

serotypu bakterii, ponadto podawana jest cyfra rzymska oznaczająca numer

kolejny enzymu wyizolowanego z danego gatunku bakterii. Na przykład,

enzym HindIII pochodzi z bakterii Haemophilus influenzae, serotyp d i jest to

trzeci (III) z kolei enzym uzyskany od tego gatunku i serotypu bakterii.

Endonukleazy dzieli się na trzy klasy, w zależności od ich mechanizmu

działania, substratów i produktów, a także kofaktorów. Do klasy I enzymów

zaliczane są te restryktazy, które wykazują aktywność nukleazy, a ich

działanie zależy od obecności takich kofaktorów, jak ATP, jony magnezu

(Mg

) i S-adenozylometionina. Cechą tych enzymów, utrudniającą ich

wykorzystywanie w analizie DNA, jest to, iż wprawdzie rozpoznają

specyficzne sekwencje nukleotydów, ale przecinają cząsteczkę DNA nie-

specyficznie w pewnej odległości (nawet do 1000 nukleotydów) od rozpo-

znanej sekwencji. Klasę III stanowią restryktazy mające podobne właściwości

do restryktaz klasy I, czyli wymagają obecności ATP i Mg

(obecność S-

adenozylometioniny nie jest niezbędna, ale wzmacnia ich aktywność).

Różnica między tymi dwiema klasami polega na tym, że odległość sekwencji

rozpoznanej od sekwencji przecinanej przez enzym klasy III jest dla danego

enzymu stała i wynosi średnio 25 nukleotydów. Przykłady endonukleaz

klasy I i III zawarte są w tabeli 4-1.

Tabela 4-1

Przykłady enzymów restrykcyjnych

Najbardziej przydatne w analizie materiału genetycznego są enzymy

restrykcyjne zaliczane do klasy II (przykłady w tab. 4-1). Enzymy te
rozpoznają najczęściej sekwencje DNA złożone z 4 lub 6, rzadziej 8 nukleo-
tydów, charakteryzujące się dwustronną symetrią (tzw. sekwencje palin-
dromowe). Niektóre enzymy przecinają cząsteczkę DNA w miejscach
znajdujących się naprzeciw siebie, dając fragmenty mające tzw. tępe końce.
Jednak większość endonukleaz przecina cząsteczki DNA w dwóch różnych
miejscach, czego konsekwencją jest powstawanie fragmentów DNA o tzw.
lepkich końcach. Końce te ułatwiają łączenie fragmentów DNA ze sobą
w procesie rekombinacji molekularnej.

Fragmenty o tępych i lepkich końcach wyglądają następująco:

Enzym Thal (pochodzący z bakterii Thermoplasma acidophilum) rozpoznaje
i tnie sekwencję:

Niektóre enzymy, mimo że pochodzą z różnych szczepów bakterii,

rozpoznają te same sekwencje DNA. Są to izoschizomery. Jednak miejsca,
w których enzymy przecinają te sekwencje, mogą być różne.

Izoschizomery Smal (Serratia marcescens) i Xmal (Kanthomonas mafaacearum)

przecinają rozpoznaną sekwencję w różnych miejscach:

od rozpoznawanej sekwencji. Na przykład enzym MboII (Moraxella bovis)

tnie cząsteczkę DNA następująco:

5'...GAAGA(N)

'...3'

3'...CTTCT(N)

...5'

podobnie enzym FokI (Flavobacterium okeanokoites):

5'...GGATG(N)

'...3'

3'...CCTAC(N)

...5'

Ponadto większość endonukleaz klasy II przecina dwuniciowe cząsteczki

DNA, a tylko nieliczne enzymy (np. HinPI) tną jednoniciowy DNA.

Warunki optymalne dla aktywności poszczególnych enzymów restryk-

cyjnych różnią się przede wszystkim temperaturą, w której mieszanina

DNA z enzymem jest inkubowana, oraz składem buforu. Niektóre enzymy

potrzebują takich samych buforów. Dokładne informacje o tych warunkach

dostarczane są wraz z enzymami przez firmy biotechnologiczne.

Wykrycie bakteryjnych enzymów restrykcyjnych miało ogromne znacze-

nie dla rozwoju technik molekularnych. Są one podstawowym narzędziem,

wykorzystywanym m.in. do sporządzania map genomowych, sekwencjo-

nowania DNA, izolacji i identyfikacji genów, klonowania molekularnego

i rekombinacji genów czy fragmentów genomu, diagnostyki chorób genetycz-

nych (wykrywanie mutacji genowych) lub w analizie polimorfizmu długości

fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLP).

4.2. Wektory

Wektory są podstawowym narzędziem klonowania DNA. Wprowadzenie

(transformacja) fragmentu DNA do komórki biorcy następuje za pośrednic-

twem wektora, do którego fragment ten został uprzednio włączony (rekom-

binacja molekularna). W zarysie klonowanie polega na namnożeniu frag-

mentu DNA w komórkach mikroorganizmów (głównie bakterii). Wektor

(np. plazmidowy, fagowy, drożdżowy) jest zdolny do autonomicznej

replikacji.

Wektory charakteryzują się następującymi cechami:

• są to niewielkie cząsteczki DNA, opisane pod względem fizycznym

i genetycznym, mające zdolność do samodzielnej replikacji w cytoplazmie

gospodarza,

• mają miejsca rozpoznawane przez różne endonukleazy restrykcyjne

(uzyskanie lepkich końców),

• miejsce rozpoznania przez enzym restrykcyjny nie powinno się

znajdować w takim rejonie cząsteczki, którego uszkodzenie powodowałoby

zaburzenie możliwości jej replikacji,

• powinny mieć jeden lub kilka silnych promotorów tak, aby wstawiając

w ich sąsiedztwo fragment obcego DNA można było uzyskać efektywną

ekspresję wprowadzonych genów,

• zawierają znaczniki (markery), za pomocą których można je ziden

tyfikować, np. geny oporności na antybiotyki,

• nie są zdolne do przeżycia poza komórką gospodarza,

• ze względów etycznych wektor nie powinien mieć genów, korę mogą

stanowić zagrożenie ekologiczne.

RODZAJE WEKTORÓW

Wektorami najczęściej używanymi do klonowania DNA w komórkach

prokariotycznych są bakteriofagi (fagi), plazmidy i kosmidy.

Wektory plazmidowe

Plazmidami są występujące u wielu gatunków bakterii kowalentnie zamk-

nięte koliste cząsteczki DNA. Plazmidy stosowane w technice klonowania

jako wektory są specjalnie konstruowane z fragmentów naturalnych plaz-

midów bakteryjnych. Wektor plazmidowy musi zawierać region inicjacji

replikacji DNA — replikon oznaczony symbolem ori, gen oporności na

antybiotyk, umożliwiający bakteriom transformantom rozwój na pożywce

zawierającej antybiotyk. Większość wektorów plazmidowych ma wstawiony

syntetyczny oligonukleotyd, „polilinker" (miejsce wielokrotnego klonowania),

którego sekwencje są rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych.

Dzięki temu w wektor taki można wstawiać odcinki klonowanego DNA

uzyskane przez trawienie odpowiednimi enzymami. Do niektórych wek-

torów wprowadzono sekwencję umożliwiającą łatwą identyfikację zrekom-

binowanych bakterii. Najczęściej jest to gen kodujący enzym, rozkładający

barwny substrat, np. gen

β-galaktozydazy oznaczony symbolem lacZ. Metoda

selekcji rekombinantów zostanie omówiona w podrozdziale: Rekombinacja

molekularna i klonowanie. Przykładowy wektor plazmidowy pUC19, który

ma długość 2686 par zasad, przedstawiony jest na rycinie 4-1.

Kosmidy

Kosmid jest plazmidem zmodyfikowanym przez dodanie do niego sekwencji

cos z faga

λ. Dzięki temu kosmidy łączą zalety wektorów plazmidowych i

fagowych. Sekwencja cos umożliwia upakowanie DNA faga w otoczkę

białkową. Kosmidy służą do klonowania większych cząsteczek DNA, długości

10-40 kpz, i dlatego są wykorzystywane w badaniach wielu genów

eukariotycznych oraz do tworzenia bibliotek genomowych.

Wektory fagowe

Spośród wektorów fagowych największe znaczenie ma fag

λ. Za pomocą

modyfikacji molekularnych (np. eliminacja miejsc rozpoznawanych przez

enzymy restrykcyjne) otrzymano wiele pochodnych tego faga. Podobnie jak

Ryć. 4-1. Schemat wektora plazmidowego pUC19. Zaznaczono miejsca restrykcyjne dla

niektórych endonukleaz

w przypadku wektorów plazmidowych, do wektorów fagowych wprowa-

dzono polilinkery, geny markerowe i silne promotory. Wektory fagowe są

stosowane do klonowania fragmentów DNA mniejszych niż w wektorach

plazmidowych, ale efektywność tego działania jest większa.

Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC)

Do klonowania długich fragmentów DNA (100-300 kpz) jest wykorzysty-

wany sztuczny chromosom bakteryjny BAĆ (ang. bacterial artificial chromo-

some) skonstruowany na bazie plazmidowego czynnika F bakterii E. coli.

Do klonowania fragmentów DNA w organizmach eukariotycznych (np.

drożdżach, komórkach ssaków) stosowane są:

Wektory — pochodne wirusów

Pochodne niektórych wirusów są wektorami stosowanymi do wprowadzania

DNA do komórek roślinnych i zwierzęcych. W przypadku komórek

zwierzęcych są to pochodne wirusów SV40, Papilloma, krowianki, bakulowi-

rusów, adenowirusów i retrowirusów. Najwcześniej był stosowany wirus

SV40, którego zaletą jest duża wydajność uzyskiwania zrekombinowanego

genu, wadą natomiast organiczona długość wbudowanego obcego DNA.

Obecnie coraz częściej stosuje się retrowirusy zapewniające dużą efektyw-

ność transfekcji (transfekcja jest to wprowadzanie fragmentów DNA do

komórek eukariotycznych). Są one również stosowane w somatycznej

terapii różnych schorzeń.

Wektory drożdżowe

Wektory te wykazują zdolność replikacji tak w komórkach drożdży, jak

i komórkach bakteryjnych. Zdolność ta wynika z występowania odrębnych

sekwencji startu replikacji i genów markerowych. Typowy wektor droż-

dżowy jest skonstruowany z części prokariotycznej (zawiera sekwencję ori

i marker selekcyjny) i eukariotycznej (zawiera sekwencję ori rozpoznawaną

przez polimerazę eukariotycznego gospodarza, marker selekcyjny i sekwen-

cje umożliwiające ekspresję genu). Taka konstrukcja pozwala na klonowanie

genów w E. coli, a następnie badanie ich ekspresji w drożdżach. Do

wektorów tych należą także sztuczne chromosomy drożdżowe — YACs

(ang. yeast artificial chromosomes), skonstruowane po raz pierwszy w 1983

roku. Są one stosowane do klonowania bardzo długich fragmentów DNA,

do 5 milionów par zasad. Są także wykorzystywane m.in. w budowie map

genomowych. Oprócz sekwencji typowych dla wektorów drożdżowych,

sztuczne chromosomy drożdżowe mają sekwencje umożliwiające replikację

chromosomów i ich segregację w trakcie podziałów mitotycznych.

Sztuczne chromosomy ludzkie

Po skonstruowaniu sztucznego chromosomu drożdży rozpoczęto inten-

sywne prace nad konstrukcją ludzkiego sztucznego chromosomu — HAC

(ang. human artificial chromosome). Było to możliwe dzięki poznaniu

sekwencji telomerowych chromosomów i sekwencji, od których zaczyna

się replikacja cząsteczki DNA. O wiele większym problemem okazało

się wydzielenie części chromosomu nazwanej centromerem. Dotychczasowe

badania zaowocowały skonstruowaniem sztucznego chromosomu ludzkiego

złożonego z telomerowego DNA, fragmentów DNA rozpoczynających

replikację oraz, zamiast centomerowego DNA,

α-satelitarnego DNA (se-

kwencja powtarzająca się, długości 171 par zasad) (ryć. 4-2). Wszystkie

te fragmenty DNA zostały wprowadzone do komórek ludzkiej linii no-

wotworowej, hodowanych in vitro. Komórki te, w przeciwieństwie do

komórek prawidłowych, mają zdolność nieograniczonej liczby podziałów.

Uzyskany dotychczas sztuczny chromosom, nazwany mikrochromosomem,

różni się znacznie od chromosomu funkcjonalnego. Jeżeli konstrukcja

sztucznego chromosomu ludzkiego zakończy się powodzeniem, chromo-

somy te (HACs) będą mogły być użyteczne do badania ekspresji genów

oraz jako wektory stosowane w terapii genowej (dostarczanie genów

do komórek somatycznych in vivo).

4.3. Rekombinacja molekularna i klonowanie

Rekombinacja molekularna, będąca podstawową metodą inżynierii genetycz-

nej, polega na łączeniu ze sobą różnych cząsteczek DNA lub RNA. Metoda

rekombinacji DNA umożliwia uzyskanie za pomocą klonowania bardzo

dużej liczby kopii wybranego fragmentu DNA. Klonowaniem molekularnym

nazywamy replikację w komórkach biorcy (np. bakterii) zrekombinowanych

wektorów zawierających DNA dawcy, uzyskany za pomocą jednej z na-

stępujących metod:

• wycięcie odpowiedniego fragmentu DNA dawcy za pomocą enzymów

restrykcyjnych,

• wyizolowanie z komórek dawcy określonego rodzaju mRNA, stano

wiącego transkrypt pojedynczego genu, a następnie zastosowanie reakcji

odwrotnej transkrypcji (przepisanie sekwencji mRNA na komplementarną

sekwencję mRNA

→ cDNA),

• chemiczna synteza fragmentu DNA.

Ligacja. Fragment DNA, który zamierzamy sklonować, musi być połą-

czony z odpowiednim wektorem. By połączenie to było możliwe, konieczny

jest wytwarzany przez bakterie enzym nazwany ligazą DNA.

In vivo ligazą bierze udział w procesie replikacji DNA oraz naprawie

uszkodzeń DNA, katalizując powstawanie wiązań fosfodiestrowych między

nukleotydami. Dzięki swym właściwościom ligazą bierze udział w tworzeniu

wiązań między cząsteczkami DNA pochodzącymi od -różnych organizmów.

Do rekombinowania DNA stosowana jest ligazą, którą uzyskuje się z komó-

rek Escherichia coli zakażonych fagiem T4 (ligazą jest kodowana przez gen

tego faga). Ligazą ma zdolność łączenia ze sobą fragmentów o końcach

zarówno lepkich, jak i tępych, jednak wydajność tego procesu jest większa

w przypadku końców lepkich. Z reguły do przecięcia wektora używany jest

ten sam enzym restrykcyjny, którym był trawiony DNA.

Transformacja. W celu wprowadzenia zrekombinowanych cząsteczek

DNA do komórki bakteryjnej wykorzystywana jest naturalna zdolność

wielu bakterii do pobierania cząsteczek DNA z podłoża. Właściwość tę

odkrył w 1928 roku Griffith w doświadczeniu na myszach zarażanych

dwoinką zapalenia płuc. Bakteria E. coli, która jest często używana w biologii

molekularnej, nie ma zdolności pobierania cząsteczek DNA z podłoża.

Dlatego wprowadzenie cząsteczek DNA do jej wnętrza musi być dokonane

na drodze indukcji chemicznej (destabilizowanie błony komórkowej jonami

wapnia — inkubacja komórek z CaCl

w temperaturze bliskiej 0°C) bądź

elektroporacji (działanie impulsów pola elektrycznego w urządzeniu zwanym

elektroporatorem). Wydajność transformacji zależy od stosowanej metody,

w pierwszym przypadku (działanie jonami wapnia) możliwe jest uzyskanie

około 10

transformantów z l

μg zrekombinowanego DNA, w drugim

natomiast znacznie więcej, maksymalnie do 10

Wprowadzenie zrekombinowanych cząsteczek DNA do komórek euka-

riotycznych nosi nazwę transfekcji. Jest kilka metod transfekcji, m.in.
mikroiniekcji DNA, elektroporacji oraz indukcji chemicznej fosforanem
wapnia lub dekstranem.

Selekcja transformantów (bakterii, które zawierają zrekombinowany

wektor). Jedna z metod selekcji transformantów wykorzystuje zjawisko

α-

komplementacji. Jest ona możliwa do stosowania w przypadku wektora

plazmidowego z serii pUC. Właściwie można mówić o dwustopniowej

selekcji komórek bakterii po transformacji. Pierwsza zachodzi podczas

hodowli bakterii na pożywce zawierającej antybiotyk. Ponieważ wektor

plazmidowy ma gen oporności na antybiotyk, uzyskuje się wzrost kolonii

bakterii, które mają wektor. Drugi etap selekcji umożliwia odróżnienie

komórek zawierających zrekombinowany wektor od komórek z wektorem

niezrekombinowanym (ryć. 4-3). Wektory z serii pUC mają promotor genu

β-galaktozydazy (enzym ten jest kodowany przez gen oznaczony symbolem

lacZ) i sekwencję kodującą N-końcową część tego białka (fragment alfa

β-

galaktozydazy). Z kolei stosowane do transformacji komórki bakterii

dostarczają C-końcową sekwencję genu lacZ (fragment omega). W wyniku

połączenia, po pobraniu przez bakterię wektora, obu sekwencji genu lacZ

(zjawisko

α-komplementacji) (ryć. 4-3) powstaje funkcjonalny gen β-galak-

tozydazy. Dzięki syntezie tego enzymu kolonie bakterii zawierających

plazmid, hodowane na podłożu z chromogenem X-gal, będą miały barwę

Ryć. 4-3. Zasady

α-komplementacji (połączenie fragmentów genu lacZ z plazmidu

i bakterii) — synteza funkcjonalnego genu enzymu

β-galaktozydazy

niebieską. Jeżeli do wektora (w obręb polilinkera znajdującego się w części

„plazmidowej" genu lacZ) zostanie wprowadzony obcy fragment DNA,

synteza N-końcowej części (

β-galaktozydazy zostanie zablokowana, co

spowoduje brak syntezy aktywnego białka i białe zabarwienie kolonii

bakterii zawierających zrekombinowany wektor.

4.4. Amplifikacja DNA za pomocą łańcuchowej

reakcji polimerazy (PCR)

Łańcuchowa reakcja polimerazy — PCR (ang. polymerase chain reaction)

jest podstawową techniką badawczą i diagnostyczną wykorzystującą zdol-

ność DNA do replikacji. Reakcja ta jest katalizowana, podobnie jak to się

dzieje w komórkach, przez polimerazy DNA, zwane także replikazami.

Łańcuchowa reakcja polimerazy znana jest od ponad 10 lat, a jej twórcą był

Kary Mullis, który za swoje badania otrzymał Nagrodę Nobla w roku 1993.

O ogromnym znaczeniu tej metody decyduje to, iż umożliwia ona analizę

DNA nawet w przypadku bardzo małej jego ilości (np. w kryminalistyce —

ślady krwi). PCR jest enzymatyczną metodą amplifikacji (powielania)

określonych sekwencji DNA, a jej czułość pozwala na zwielokrotnienie

(uzyskanie wielu milionów kopii) ściśle określonych sekwencji DNA, mimo

obecności innych sekwencji. Można amplifikować poszukiwane odcinki

DNA, dysponując DNA wyizolowanym nawet z pojedynczych komórek.

Jednak najlepszy DNA do celów diagnostycznych uzyskujemy, gdy pochodzi

z minimum 10

komórek. Z reguły amplifikacja określonego fragmentu

DNA jest możliwa wtedy, gdy znana jest jego sekwencja nukleotydowa, na

podstawie której syntetyzowane są krótkie, zazwyczaj około dwudziesto-

nukleotydowe oligonukleotydy, tzw. startery (ang. primer), komplementarne

do badanego DNA (jeden starter do jednej, drugi do drugiej nici).

Aby mogła zajść łańcuchowa reakcja polimerazy, niezbędne są następują-

ce warunki: obecność jednoniciowej matrycy DNA (badany dwuniciowy

DNA jest rozdzielany na dwie nici przez denaturację termiczną, proces ten

nazywany jest inaczej topnieniem), wspomnianych już starterów, trifosfora-

nów deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz enzymu

polimerazy DNA. Konieczny jest również bufor reakcyjny uzupełniający

niezbędne do aktywności enzymu jony metali (potasu i magnezu). Trifosfora-

ny w trakcie amplifikacji uczestniczą w wydłużaniu sekwencji starterów

zgodnie z regułą komplementarności zasad azotowych względem amplifiko-

wanej nici DNA. Enzym katalizujący reakcję — Taq polimeraza DNA —

pochodzi z bakterii Thermus aquaticus, żyjącej w gorących źródłach. Dlatego

polimeraza (nazwana od skrótu gatunku bakterii Taq polimeraza) zachowuje

swą aktywność nawet w bardzo wysokiej temperaturze (> 90°C). Zanim

wykryto ten enzym, przeprowadzenie reakcji amplifikacji było ogromnie

pracochłonne i wymagało wielokrotnego dodawania enzymu. Obecnie

może być stosowana także inna polimeraza, PrimeZyme, pochodząca z innej

termofilnej bakterii Thermus brockianus.

Reakcja amplifikacji DNA składa się z powtarzających się cykli, a każdy

z nich przebiega w trzech etapach (ryć. 4-4):

1 — denaturacja dwuniciowego DNA (ang. denaturation), zachodząca

w temperaturze 92-96°C (zależnie od rodzaju probówki i termocyklera,

którym jest termostat z automatycznie zmieniającą się temperaturą);

2 — przyłączenie (ang. annealing) starterów do komplementarnych

sekwencji na zdenaturowanej matrycy DNA, w temperaturze 37-72°C.

Temperatura przyłączania starterów zależy głównie od zawartości w tych

starterach nukleotydów G i C. Można ją w przybliżeniu określić, wykorzys

tując wzór (Mazaras i wsp., NAR 19:4783, 1991):

T = 69,3°C + 41 x (G + C)/L - 650/L

gdzie:

(G + C) — łączna liczba nukleotydów guanylowych i cytydylowych

L — łączna liczba wszystkich nukleotydów;

3 — wydłużanie starterów (ang. elongation) polegające na dołączaniu,

począwszy od wolnego końca 3'-OH startera, nukleotydów komplementar

nych względem amplifikowanej nici DNA; proces ten zachodzi w tem-

peraturze 72°C.

W wyniku wydłużenia starterów powstają syntetyzowane „de novo" nici

DNA, które zawierają miejsce wiązania dla startera w następnym cyklu.

Zatem każda nowa nić DNA staje się matrycą w kolejnym cyklu amplifikacji,

co prowadzi do zwiększania się liczby amplifikowanych fragmentów

w postępie logarytmicznym. Po 30 cyklach tej reakcji jest już 2

, czyli

1073 741 824, powielonych fragmentów DNA. Długość powstających frag-

mentów determinują końce 5' starterów. Denaturacja DNA w pierwszym

i wydłużanie starterów w ostatnim cyklu przebiegają w nieco dłuższym

czasie niż w cyklach pozostałych. Dla każdego fragmentu DNA, który ma

być zamplifikowany, należy dobrać właściwe warunki reakcji, przede

wszystkim temperaturę przyłączania starterów.

Całkowity czas trwania łańcuchowej reakcji polimerazy wynosi z reguły

najwyżej kilka godzin. Po zakończeniu reakcji zamplifikowany fragment

DNA, czyli tzw. produkt PCR, może być przechowywany w temperaturze

4°C, do momentu następnego etapu badań.

Metoda PCR ma wiele zastosowań, między innymi do:

• wykrywania obecności w genomie określonych odcinków/genów oraz

identyfikacji nosicieli mutacji powodujących choroby genetyczne

• wykrywania obecności w organizmie wirusowego lub prowirusowego

DNA

• zwiększenia ilości wybranych odcinków DNA do późniejszego sek-

wencjonowania lub tworzenia biblioteki genów.

Opracowane zostały modyfikacje łańcuchowej reakcji polimerazy:

Wewnętrzna (ang. nested) PCR. Stosowana jest w przypadku braku

pewności, że zamplifikowany został właściwy fragment DNA. Metoda ta

polega na amplifikacji mniejszego odcinka DNA, zawartego w obrębie

wcześniej zamplifikowanego dłuższego fragmentu. Oczywiście w tej drugiej

reakcji stosowane są inne startery. Za pomocą tej metody możemy także

zwiększyć czułość reakcji, dzięki dodatkowej amplifikacji produktów wcześ-

niejszej reakcji.

RAPD (ang. random amplified polymorphic DNA). Jest to metoda

losowej amplifikacji fragmentów DNA, w której, w odróżnieniu od metody

PCR, stosowany jest tylko jeden starter. Również warunki reakcji są nieco

inne, niższa jest temperatura przyłączania starterów do matrycowego DNA,

a liczba cykli reakcji jest większa (40-50). Przykład wzoru prążkowego

(losowo zamplifikowanych fragmentów DNA) przepiórki japońskiej uzys-

kanego w wyniku reakcji RAPD przedstawiono na rycinie 4-5.

LCR (ang. ligase chain reaction). Ligazowa reakcja łańcuchowa; zbliżona

jest do PCR. Różnice polegają m.in. na tym, że w LCR oligonukleotydy są

dłuższe (50-60 nukleotydów) i tak przygotowane, by po hybrydyzacji,

odpowiednio do końca 5' i 3' matrycowego DNA, nie pozostała między nimi

przerwa. Enzymem używanym do tej reakcji jest termostabilna ligaza, która

łączy specyficznie dwa przyległe oligonukleotydy, gdy są one zhybrydyzo-

wane z komplementarną matrycą. Oligonukleotydy są amplifikowane

podczas cykli termicznych w obecności drugiej pary starterów.

W pierwszym etapie reakcji matryca — DNA jest poddawana de-

naturacji (rozdzielana na dwie nici) przez działanie wysoką temperaturą

(94°C). Ochłodzenie mieszaniny reakcyjnej do 60°C powoduje, że komple-

mentarne do normalnego allelu cztery diagnostyczne startery hybrydyzują

z komplementarnymi sekwencjami na matrycy DNA. Jeśli jest idealna

komplementarność między matrycą i zhybrydyzowanymi z nią oligo-

nukleotydami (starterami), wówczas termostabilna ligaza tworzy kowa-

lentne wiązanie między oligonukleotydami. Te dwa etapy są powtarzane,

a produkty ligacji stają się matrycami do hybrydyzacji w kolejnych

cyklach, amplifikując badany gen (odcinek DNA). Jeśli nie ma komple-

mentarności w miejscu połączenia starterów z matrycą DNA (np. mutacja

punktowa), wówczas nie tworzy się wiązanie między starterami i nie

ma produktu amplifikacji.

Reakcja ta stosowana jest do wykrywania mutacji punktowych, co jest

szczególnie istotne z medycznego punktu widzenia (diagnostyka chorób

monogenowych).

W celu identyfikacji produktu LCR stosowane są nieradioaktywne

metody znakowania barwnego, np. z zastosowaniem biotyny. O znakowaniu

biotyną będzie jeszcze mowa w podrozdziale: Techniki hybrydyzacji i sondy

molekularne.

RT-PCR (ang. reverse transcription-polymerase chain reaction). Odwrot-

na transkrypcja-PCR. Łańcuchowa reakcja polimerazy umożliwia amplifika-

cję jedynie kwasu deoksyrybonukleinowego. Nie może być natomiast

wykorzystana w badaniach ekspresji genów, w których określana jest ilość

mRNA, jak również do wykrywania wirusów, których materiałem genetycz-

nym jest RNA. W tych przypadkach może być stosowana metoda RT-PCR,

polegająca na tym, iż łańcuchowa reakcja polimerazy jest poprzedzona

odwrotną transkrypcją, podczas której na matrycy mRNA syntetyzowany

jest komplementarny DNA (nazwany cDNA). Reakcja ta przebiega dzięki

zastosowaniu enzymu odwrotnej transkryptazy. Końcowym etapem jest

amplifikacja uzyskanego cDNA na drodze łańcuchowej reakcji polimerazy.

SSCP (ang. single stranded conformation polymorphism). Polimorfizm

konformacji jednoniciowych łańcuchów DNA; jest to technika często

wykorzystywana do wstępnej identyfikacji mutacji punktowych w badanym

fragmencie DNA. Badanie polega na amplifikacji techniką PCR wybranego

fragmentu DNA, a następnie jego denaturacji i elektroforezie. Efektem

denaturacji jest uzyskanie jednoniciowych łańcuchów DNA, które przyjmują

określoną konformację przestrzenną. Konformacja ta zależy od sekwencji

nukleotydów, bowiem pomiędzy niektórymi sekwencjami wchodzącymi

w skład łańcucha będą powstawały wiązania wodorowe między komple-

mentarnymi zasadami azotowymi. Dzięki temu szybkość migracji jedno-

niciowych łańcuchów DNA podczas elektroforezy zależy nie tylko od ich

wielkości/ale także konformacji przestrzennej. Zdenaturowany DNA allelu

zmutowanego może przyjmować inną konformację niż allelu prawidłowego

i w konsekwencji fragmenty te będą migrowały podczas elektroforezy

z różną szybkością. Jeśli badany DNA pochodzi od nosiciela zmutowanego

genu, to wówczas na elektroforegramie pojawiają się prążki (fragmenty)

reprezentujące allel prawidłowy oraz allel zmutowany. Stwierdzenie takiej

formy polimorfizmu wskazuje jedynie na to, że testowany osobnik jest

heterozygotą w obrębie amplifikowanego fragmentu DNA. Nie można

jednak na tej podstawie zidentyfikować typu mutacji ani określić miejsca

mutacji. Dlatego szczegółowa analiza mutacji wymaga zastosowania dodat-

kowych metod, np. RFLP lub sekwencjonowania, które jest oczywiście

najbardziej precyzyjne.

Poszukiwanie określonego fragmentu DNA lub RNA może być prze-

prowadzane także bezpośrednio w komórkach i tkankach za pomocą

metody PCR in situ.

4.5. Techniki hybrydyzacji i sondy molekularne

Hybrydyzacja DNA jest możliwa dzięki zdolności kwasów nukleinowych

do rozdziału na pojedyncze nici komplementarne i ponownego łączenia się

w struktury dwuniciowe. Jak wiadomo, między nićmi DNA:DNA,

RNA: RNA i RNA: DNA istnieją wiązania wodorowe, które ułatwiają ten

proces. Zjawisko to stało się podstawą metod analizy kwasów nukleinowych,

takich jak hybrydyzacja Southern blotting (DNA), northern blotting (RNA)

czy PCR (hybrydyzacja starterów z matrycą).

Ogromną zaletą hybrydyzacji jest to, że można ją stosować nawet

wówczas, gdy nie jest dokładnie znana cała sekwencja nukleotydowa

badanego fragmentu DNA.

Southern blotting jest metodą przenoszenia odpowiednio przygo-

towanego DNA na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy. Przygotowanie

DNA polega na trawieniu jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi

i rozdzieleniu elektroforetycznym uzyskanych fragmentów w żelu aga-

rozowym (dłuższe, czyli cięższe fragmenty) lub poliakryloamidowym

(krótsze, lżejsze, do 500 par zasad). By była możliwa hybrydyzacja

sondy z badanym DNA, kwas nukleinowy znajdujący się w żelu musi

być zdenaturowany (rozdzielony na pojedyncze nici poprzez działanie

roztworem kwasu solnego). Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na

filtr następuje przez bufor transferowy, który przenikając przez żel

zabiera ze sobą fragmenty DNA. Fragmenty te są następnie zatrzymywane

na filtrze. Przeniesiony DNA należy utrwalić na filtrze działając wysoką

temperaturą bądź promieniami UV. Tak przygotowany DNA można

nawet kilkakrotnie hybrydyzować z sondami molekularnymi. Sondy

molekularne są to odcinki DNA mające sekwencję nukleotydów kom-

plementarną do badanej. Sondami molekularnymi mogą być fragmenty

DNA bezpośrednio pochodzące z genomu (np. wirusów lub organizmów

wyższych), klonowane sekwencje lub syntetyczne oligomery stosowane

w PCR.

Technika northern blotting, stosowana w hybrydyzacji kwasu rybonu-

kleinowego, który jest nicią pojedynczą, nie wymaga etapu denaturacji.

Znakowanie sond. Sonda musi być odpowiednio wyznakowana, by było

możliwe wykrycie powstałej hybrydy. Sposób znakowania sond można

podzielić na dwie główne grupy:

1. Znakowanie izotopowe (radioaktywne) — przez wprowadzenie do

cząsteczki sondy izotopu promieniotwórczego. Sygnał jest wykrywany

metodą autoradiografii przez ekspozycję błony fotograficznej na działanie

promieniowania powstałej hybrydy. Znakowanie izotopowe charakteryzuje

się dużą czułością, jednak niewielką rozdzielczością. Wadą sond znakowa-

nych izotopem jest również to, iż muszą być stosowane wkrótce po ich

wyznakowaniu. Najczęściej stosowanymi izotopami są:

• fosfor radioaktywny (

P), który emituje wysokoenergetyczne promie-

niowanie

β (energia promieniowania E = 1,71 MeV — megawoltów), czas

półtrwania 14,3 dnia. Izotop ten jest stosowany do znakowania DNA i RNA,

a jego podstawowym źródłem są radioaktywne nukleotydy wyznakowane

w pozycji

α: dATP, dCTP i UTP a

• izotop siarki (

S), emitujący promieniowanie

β, które jest około 10

razy słabsze niż fosforu (energia promieniowania E = 0,167 MeV),

okres półtrwania 87,1 dnia. Siarka radioaktywna jest stosowana do

znakowania kwasów nukleinowych, głównie DNA. Atom tlenu w grupie

fosforanowej

α i γ P może być zastąpiony przez S, tak powstają

pochodne nukleotydów,

• tryt (

H), który emituje promieniowanie

β (energia promieniowania

E = 0,018 MeV), okres półtrwania 12,26 roku, używany jest do

znakowania kwasów nukleinowych, głównie DNA. Podstawowym

źródłem trytu jest trytowana tymidyna.

2. Znakowanie nieizotopowe (nieradioaktywne) przez dołączenie do

sondy lub wbudowanie w nią znacznika fluorescencyjnego (np. biotyny,

digoksygeniny). Ten rodzaj znakowania wymaga dodatkowego

mechanizmu detekcji (immunologicznego lub fluorescencyjnego), w

zależności od zastosowanego znacznika. Detekcja immunologiczna jest

bardzo dobra do hybrydyzacji na filtrach. Znakowanie nieizotopowe

zapewnia dobrą rozdzielczość, ale daje mniejszą czułość detekcji.

Znacznik (izotopowy lub nieizotopowy) może być równomiernie roz-

mieszczony w całej sekwencji sondy bądź sonda może być znakowana na

końcach (terminalnie). Znakowanie sond można przeprowadzać za pomocą

kilku różnych metod.

Hybrydyzacja na filtrach. Hybrydyzację z wyizolowanym DNA można

przeprowadzać, gdy jest on unieruchomiony na filtrze. Zaletą tej metody

jest to, iż stosunkowo duża ilość kwasu nukleinowego może być

związana z filtrem i wyeksponowana na działanie sondy. Ponadto

niezhybrydyzowana sonda jest odpłukiwana po inkubacji.

Hybrydyzacja jest poprzedzona prehybrydyzacją, której celem jest

wysycenie miejsc na filtrze mogących niespecyficznie związać sondę.

Roztwór prehybrydyzacyjny ma taki sam skład jak hybrydyzacyjny, z wyjąt-

kiem obecności sondy. Sam proces hybrydyzacji polega na długotrwałej

inkubacji (na przykład przez całą noc) badanego DNA w buforze zawiera-

jącym wyznakowaną sondę. Podczas tej inkubacji zachodzą wielokrotnie

procesy asocjacji i dysocjacji sondy z próbką DNA. Kinetyka tych procesów

w dużej mierze zależy od różnicy między temperaturą topnienia — Tm

(jest to temperatura, w której 50% długości nici jest zdysocjowane)

hybrydy a temperaturą, w której przebiega hybrydyzacja. Przyjmuje się,

że różnica ta powinna wynosić 20-25°C. Hybrydyzację przeprowadza

się z reguły w temperaturze 68°C. Na wydajność hybrydyzacji wpływają

także inne czynniki, jak ilość kwasu nukleinowego związanego z filtrem

(nie mniej niż 10

μg), stężenie sondy molekularnej w roztworze

hybrydyzacyjnym (optimum to 50-1200 ng/ml) i stężenie jonów Na

. Po

hybrydyzacji nadmiar sondy jest odpłukiwany (najczęściej w temperaturze

65-70°C), a detekcja sygnału jest poprzez autoradiografię (ryć. 4-6).

Wykorzystanie metody hybrydyzacji. Metoda hybrydyzacji służy m.in. do

wykrywania ściśle określonych fragmentów DNA (np. w diagnostyce

chorób). W metodzie zwanej „odcisk palca" DNA (ang. fingerprint) stosowa-

na jest sonda molekularna komplementarna do sekwencji minisatelitarnej

(metoda ta jest opisana w rozdziale: Markery genetyczne). Metoda „odcisku

palca" DNA jest stosowana w kontroli pochodzenia oraz do oceny zmienności

genetycznej wewnątrz i między rasami/populacjami. Podobnie jak metoda

PCR, również hybrydyzacja może być przeprowadzana na preparatach

chromosomowych. Metoda ta nosi nazwę hybrydyzacji in situ (ISH). Jej różne

warianty są opisane w rozdziale: Mapy genomowe.

Hybrydyzacja w zminiaturyzowanej postaci, określana jako technika

mikromacierzy DNA, pozwala ustalać genotyp albo analizować ekspresję

setek lub tysięcy genów. Na niewielkiej płytce (ok. l cm

) umieszczone są

sondy oligonukleotydowe dla poszczególnych mutacji (genotypowanie) lub

genów (ekspresja). Detekcja hybrydyzacji sondy z wyizolowanym DNA

(genotypowanie) lub z DNA (ekspresja) jest zautomatyzowana.

4.6. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych

DNA (RFLP)

Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych DNA (ang. restricted fragment

length polymorphism) uwarunkowany jest różnicami w sekwencji nukleo-

tydów w obrębie genu. Mutacje te mogą powodować powstanie lub

likwidację istniejącego miejsca cięcia dla enzymu restrykcyjnego. Enzymy

restrykcyjne rozpoznają specyficzne dla nich sekwencje nukleotydowe

i przecinają DNA w określonym miejscu. Polimorfizm fragmentów restryk-

cyjnych DNA znajduje zastosowanie w testach identyfikacji nosicielstwa

określonego allelu danego genu (metoda PCR-RFLP). Zamplifikowany

(powielony) za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) fragment

badanego genu poddawany jest działaniu określonego enzymu lub kilku

enzymów restrykcyjnych. Następnie pocięty DNA jest rozdzielany elektro-

foretycznie w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym. Cząsteczki DNA

(także RNA) mają ładunek ujemny i w zależności od masy cząsteczkowej

(długości) wędrują z różną prędkością w kierunku anody — im krótsze,

czyli lżejsze, tym szybciej. Duże fragmenty będą więc widoczne w postaci

prążków znajdujących się w żelu w mniejszej odległości od miejsca

rozpoczęcia rozdziału, natomiast dalej będą prążki o zmniejszającej się

masie. Obraz elektroforetycznego rozdziału uzyskanych fragmentów DNA

umożliwia identyfikację poszczególnych alleli danego genu.

Poniższy przykład obrazuje sposób identyfikacji genotypu w określonym

locus. Enzym restrykcyjny Hindlll rozpoznaje i przecina 6-nukleotydową

sekwencję:

5'...A

AGCTT ...3'

3'...TTCGA,A-..5'

Dowolny zamplifikowany za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)

odcinek DNA poddany działaniu tego enzymu (trawiony) zostanie pocięty

na fragmenty różnej długości. Odcinek DNA przed trawieniem ma na-

stępującą sekwencję (pogrubionym drukiem zaznaczono motyw rozpo-

znawany przez enzym Hindlll):

GTCGGCAAGCTTAGGTCAGGAGCGGACTAAAGCTTCCGATA
CAGCCGTTCGAATCCAGTCCTCGCCTGATTTCGAAGGCTAT

Po trawieniu (cięciu) DNA enzymem otrzymujemy fragmenty DNA:

GTCGGCA'AGCTTAGGTCAGGAGCGGACTAA'AGCTTCCGATA
CAGCCGTTCGA,ATCCAGTCCTCGCCTGATTTCGAA,AGGCTAT

Po rozdziale elektroforetycznym fragmenty DNA ułożą się w kolejności 23
pz, 11 pz i 7 pz.

Metoda PCR-RFLP jest wykorzystywana w hodowli zwierząt do iden-

tyfikacji genotypów pod względem genów, których budowa molekularna

jest znana; wśród nich są geny determinujące cechy jakościowe, a także

ilościowe (ang. quantitative trait loci — QTLs) oraz odpowiedzialne za

rozwój chorób genetycznych czy odporność na niektóre patogeny. Przykłady

takich cech są przedstawione w podrozdziałach: Mutacje genowe, Geny

o dużym efekcie, Interseksualizm.

4.7. Biblioteki genomowe i genowe

Biblioteką (bankiem) genomową nazywamy zbiór klonów bakterii zawiera-
jących zrekombinowane wektory niosące fragmenty DNA. Biblioteka geno-
mową powinna się składać z fragmentów DNA tworzących razem cały
genom określonego gatunku. Natomiast biblioteka genowa (inaczej biblioteka
lub bank cDNA) jest to zbiór sekwencji kodujących białka, wprowadzonych
za pomocą wektorów do bakterii. Klony bakteryjne zawierające fragmenty
DNA lub cDNA mogą być przechowywane w stanie zamrożonym do
momentu ich wykorzystania. Do tworzenia bibliotek (banków) genomowych
i genowych wykorzystywana jest, omówiona wcześniej, metoda rekombinacji
molekularnej.

Tworzenie biblioteki genomowej

Materiałem wyjściowym jest DNA wyizolowany z tkanek i strawiony
(pocięty) enzymem restrykcyjnym. Tak powstałe fragmenty DNA są wpro-
wadzane za pomocą wektora do bakterii. Proces ten jest opisany w części
dotyczącej klonowania DNA. W zależności od wielkości fragmentów DNA
używane są różne wektory. Dla prokariontów i niższych eukariontów
stosowane są wektory plazmidowe lub fagowe, natomiast dla wyższych
eukariontów niezbędne są bardziej pojemne wektory, jak kosmidy, sztuczny
chromosom bakteryjny (BAĆ) lub sztuczny chromosom drożdżowy (YAC).
Biblioteki dużych genomów najczęściej składają się z bibliotek dla po-
szczególnych chromosomów (biblioteki chromosomowe).

Tworzenie biblioteki genowej (cDNA)

Tworzenie biblioteki genowej jest znacznie trudniejsze niż genomowej.
Materiałem wyjściowym w tym przypadku jest RNA. Po wyizolowaniu
RNA z tkanek należy oddzielić mRNA. Kolejnym krokiem jest „przepisanie"
za pomocą reakcji odwrotnej transkrypcji (katalizowanej przez enzym
odwrotną transkryptazę) informacji z mRNA na DNA. Tak otrzymany
cDNA zawiera tylko sekwencje kodujące, czyli eksony. Jest on amplifikowany

metodą PCR, a następnie rekombinowany z wektorem i wprowadzany do

bakterii. W ten sposób każdy klon bakterii ma cały określony gen.

Wykorzystanie określonego rodzaju biblioteki zależy od celu badań. Jeśli

zamierzamy poznać organizację całego genu łącznie z intronami i promoto-

rem, wykorzystuje się bibliotekę genomową. Biblioteka genomowa jest

również przydatna w poszukiwaniu genu, o którym niewiele wiadomo.

Stosowana jest wówczas metoda zwana „spacerem po chromosomie" (ang.

chromosome walking), której pierwszym krokiem jest znalezienie w biblio-

tece klonu zawierającego gen bądź marker sprzężony z poszukiwanym

genem. Fragment końcowy sekwencji sprzężonej traktowany jest jako

sonda, która jest wykorzystywana do poszukiwania klonu zawierającego

sąsiadujący, nieznany jeszcze fragment. Postępujemy tak do momentu, gdy

w którymś z kolejnych odcinków znajdziemy poszukiwany gen.

Do badania ekspresji genu wykorzystuje się bibliotekę cDNA. Najczęściej

stosowaną metodą analizy bibliotek jest hybrydyzacja z sondami molekular-

nymi (metoda hybrydyzacji DNA została już opisana wcześniej). Zasad-

niczym elementem tych badań jest odnalezienie klonu zawierającego

interesujący nas gen.

Inną metodą poszukiwania określonego genu jest zastosowanie reakcji

immunologicznej, czyli reakcji antygen-przeciwciało. W tym celu należy

doprowadzić do syntezy przez bakterie białka kodowanego przez ten gen.

Surowica zawierająca przeciwciało identyfikujące określone białko (antygen)

służy jako swego rodzaju „sonda" do przeglądania zbioru biblioteki.

4.8. Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie DNA, polegające na określeniu sekwencji nukleotydów,

jest stosowane dość często w genetyce molekularnej, przede wszystkim do

analizy sklonowanych fragmentów DNA lub produktów łańcuchowej reakcji

polimerazy. Metoda ta umożliwia także wykrycie miejsc mutacyjnych

i opracowanie testu molekularnej identyfikacji genotypów zwierząt pod

kątem nosicielstwa określonych alleli.

Sekwencjonowanie można przeprowadzać za pomocą dwóch różnych

metod: enzymatycznej i chemicznej.

Metoda enzymatyczna została opracowana w 1977 roku przez F. Sangera.

Podstawą tej metody jest enzymatyczna (przeprowadzana przez polimerazę

DNA) synteza komplementarnej nici na zdenaturowanej (jednoniciowej)

matrycy DNA. Ponieważ w nici DNA są cztery rodzaje nukleotydów (różniące

się zasadą), przeprowadzane są cztery oddzielne reakcje syntezy DNA. Każda

z czterech probówek zawiera matrycowy DNA, starter, mieszaninę deoksynuk-

leotydów, bufor reakcyjny, polimerazę DNA oraz jeden z dideoksynukleoty-

dów (ddNTP): ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddTTP (ryć. 4-7). Rolą tych

dideoksynukleotydów (tzw. terminatorów) jest zakończenie syntezy nici

autoradiogram żelu sekwencyjnego

Ryć. 4-7. Schemat sekwencjonowania DNA metodą enzymatyczną Sangera; kolorem
szarym zaznaczono nukleotyd serii dideoksy (wg: Nuć i wsp., Postępy Biologii Komórki,

25 supl. 10 :219-237, 1998)

komplementarnej w miejscu włączenia określonego dideoksynukleotydu.

W wyniku każdej z czterech reakcji otrzymujemy fragmenty DNA o różnej

długości, kończące się odpowiednim nukleozydem, zależnie od użytego

w reakcji dideoksynukleotydu. Zatrzymanie syntezy komplementarnej nici

następuje po powstaniu pełnej sekwencji jednej cząsteczki, ponieważ stosunek

dideoksynukleotydów (ddNTP) do deoksynukleotydów (dNTP) jest tak

dobrany, by tylko część syntetyzowanych fragmentów DNA uległa terminacji.

Po zakończeniu reakcji syntezy powstały DNA jest denaturowany i

rozdzielany w drodze elektroforezy wysokonapięciowej (około 2000 V) w

żelu poliakryloamidowym (długości 40-100 cm, grubości 0,2-0,6 mm). W

celu detekcji prążków DNA, metodą autoradiografii, w reakcji wykorzys-

tywane są wyznakowane izotopowe (izotop fosforu lub siarki) deoksynu-

kleotydy lub wyznakowany starter. Można również zastosować detekcję

fluorescencyjną lub wyznakowanie biotyną.

Enzymatyczna metoda sekwencjonowania ma tę zaletę, że jest szybka,

ma bardzo dużą rozdzielczość i pozwala na sekwencjonowanie odcinka

DNA długości około 500-700 nukleotydów.

Metoda chemiczna, opracowana w 1977 roku przez Maxama i Gilberta, polega

na degradacji sekwencjonowanego fragmentu DNA poprzez chemiczne roz-

szczepienie poszczególnych nukleotydów. Do rozszczepiania wykorzystywane są

hydrazyna, siarczan dimetylu (DMS) i kwas mrówkowy, które mają zdolność

modyfikacji zasad w cząsteczce DNA. Do mieszaniny reakcyjnej dodawana jest

także piperydyna, która powoduje przerwanie łańcucha DNA w miejscu

zmodyfikowanym przez jeden z wymienionych związków chemicznych.

Sekwencjonowanie metodą chemiczną przeprowadza się, podobnie jak

przy metodzie enzymatycznej, w czterech oddzielnych probówkach. Przebie-

gają w nich reakcje rozszczepień prowadzonych w 4 wariantach (ryć. 4-8):

autoradiogramżelusekwencyjnego

Ryć. 4-8. Schemat sekwencjonowania DNA metodą chemiczną Maxama-Gilberta; kolorem
szarym zaznaczono znakowany nukleotyd (wg: Nuć i wsp., Postępy Biologii Komórki,

25 supl. 10 :219-237, 1998)

W wyniku tych reakcji otrzymujemy fragmenty DNA zaczynające się

zawsze od wspólnego radioaktywnego końca, których długość zależy od

miejsca rozszczepienia łańcucha DNA. Następnym etapem, podobnie jak

w metodzie enzymatycznej, jest rozdział elektroforetyczny tych fragmentów

w żelu poliakryloamidowym, autoradiografia i odczytanie sekwencji nukleo-

tydów. Metoda ta umożliwia sekwencjonowanie fragmentów DNA długości

około 250-300 nukleotydów.

Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych zostało zautomatyzowane,

kilka firm oferuje specjalistyczną aparaturę.

Najnowsza metoda sekwencjonowania, tzw. pyroseąuencing, znacznie

różni się od powyższych metod. Wykorzystuje ona bowiem enzymatyczne

(z udziałem 4 enzymów i specyficznych substratów) dobudowywanie nici

komplementarnej do badanego fragmentu DNA, przy czym przy włączeniu

każdego nukleotydu powstaje sygnał świetlny. Reakcja ta przebiega na

mikropłytkach (96 dołków na płytce) po dodaniu substratów i enzymów do

dołka zawierającego badaną próbę DNA. Sekwencja badanego fragmentu

DNA jest odczytywana przez specjalną kamerę połączoną z komputerem (z

oprogramowaniem do analizy tych danych) na podstawie sygnału świetl-

nego, zamienionego na pik proporcjonalny do liczby nukleotydów włączo-

nych do nici komplementarnej do matrycowego DNA (badana próba).

4.9. Badanie ekspresji genów

Ekspresja genu może być badana na etapie transkrypcji (hybrydyzacja in

situ na skrawkach tkanek; northern blotting; RT-PCR) i translacji (western

blotting). Jedna z wymienionych metod, hybrydyzacja in situ na skrawkach

tkanek, pozwala także na wyróżnienie grup komórek, które morfologicznie

nie różnią się od sąsiednich, ale są inne pod względem biochemicznym.

Przykładem mogą być komórki nowotworowe badane bezpośrednio po

transformacji. Różnią się one od innych komórek ekspresją pewnych

genów, nieaktywnych w komórkach zdrowych.

4.10. Transgeneza

Transgenezą nazywamy technikę modyfikowania genomu metodami in-

żynierii genetycznej. Zwierzęta transgeniczne to takie, które w swoim

genomie zawierają zintegrowany DNA pochodzący od innego osobnika.

Jednym z pierwszych eksperymentów transgenezy było wprowadzenie na

początku lat 80. do zygoty myszy szczurzego genu hormonu wzrostu.

Głównym efektem tego zabiegu było szybsze tempo wzrostu i wyraźne

wydłużenie ciała myszy transgenicznych. Samce transgeniczne przekazywały

swojemu potomstwu obcy gen, natomiast samice były niepłodne. Podobne

rezultaty otrzymano po wprowadzeniu myszom ludzkiego genu czynnika

uwalniającego hormon wzrostu.

Materiał genetyczny wprowadza się do komórki zazwyczaj za pomocą

jednej z następujących technik:

• bezpośrednia mikroiniekcja genu lub fragmentu DNA do przedjądrza,

najczęściej męskiego, zapłodnionej komórki jajowej. Po mikroiniekcji DNA

dokonywany jest transfer zarodków do hormonalnie przygotowanych

biorczyń. Jest to główna metoda uzyskiwania transgenicznych zwierząt

gospodarskich;

• transfer materiału genetycznego przez zakażanie zrekombinowanymi

retrowirusami. Wielkość fragmentu DNA, około 8 kpz, który może być

wprowadzony tą metodą, ogranicza jej stosowanie. Ponadto istnieje pewne

niebezpieczeństwo replikacji wirusa, które można zmniejszyć przez stosowanie

zmodyfikowanych wirusów zdolnych do jednego tylko cyklu replikacyjnego;

• zastosowanie pierwotnych komórek zarodkowych — ESC (ang.

embryonic steam cells). W metodzie tej wykorzystuje się zdolność pierwot

nych komórek zarodkowych do wzrostu in vitro. Zrekombinowany fragment

DNA wprowadzany jest do hodowanych w warunkach in vitro ESC, które

wcześniej zostały pozyskane z węzłów zarodkowych blastocysty. Następnie

komórki te są wprowadzane ponownie do enukleowanych oocytów lub

pęcherzy trofoblastycznych (tzn. blastocyst pozbawionych węzła zarodkowe

go). Jak dotychczas opisana technika jest stosowana z sukcesem u myszy.

Transformację komórek można też wykonać na drodze elektroporacji

komórki biorcy lub lipofekcji (dostarczenie do komórki obcego DNA

w liposomach).

Dotychczas stosowane metody wprowadzania transgenu nie dają moż-

liwości sterowania tym procesem. Na razie nie mamy żadnego wpływu na

to, w którym miejscu genomu włączy się transgen. Skutki tego procesu

w zależności od miejsca inkorporacji transgenu mogą być różne, nawet

niekorzystne.

Należy jednak zauważyć, że w procesie transgenezy wprowadzane są

konstrukty genowe, które zazwyczaj złożone są z części strukturalnej

wprowadzanego genu i części promotorowej innego genu, umożliwiającej

ukierunkowaną ekspresję transgenu (np. w gruczole mlecznym).

Wykorzystanie techniki transgenezy

1. Doskonalenie zwierząt gospodarskich

Transgeneza stwarza duże możliwości poprawy cech użytkowych zwie-

rząt gospodarskich poprzez modyfikację ich genomu. Technika ta może być

stosowana do:

• uzyskania zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produk

cji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących polipep-

tydy wpływające na wzrost, np. gen struktury hormonu wzrostu (ang.

growth hormone — GH);

zwierząt genów kodujących mRNA o sekwencji „antysensównej" do wiru-

sowych kwasów nukleinowych, blokujących w ten sposób namnażanie

wirusów i ekspresję ich genów. Ptaki odporne na infekcje wirusowe

i bakteryjne można uzyskać wprowadzając geny, najlepiej dominujące,

kodujące syntezę białek otoczki wirusów lub antygeny powierzchniowe

bakterii, których obecność w organizmie stymulowałaby wytworzenie

odpowiednich przeciwciał.

2. Medycyna

Zwierzęta transgeniczne mogą służyć medycynie człowieka jako „bio-

reaktory" do produkcji białek o działaniu leczniczym. Ekspresję obcych

białek można skierować do gruczołu mlecznego wykorzystując promotory

genów białek mleka i przyłączając do nich geny struktury innych białek.

Zaletą tej metody jest to, iż samice transgeniczne wytwarzają mleko

zawierające obce białko. Uzyskano już transgeniczne owce z genem cd-

antytrypsyny (niedobór tego białka powoduje przede wszystkim u osób

palących rozedmę płuc), krowy wytwarzające mleko z ludzką laktoferyną,

świnie z ludzkim genem kodującym IX czynnik krzepliwości krwi (jego

niedobór powoduje hemofilię).

Transgeniczne zwierzęta mogą być wykorzystywane do badań bio-

medycznych. Na myszach transgenicznych prowadzone są badania endo-

krynologiczne z hormonem wzrostu, których celem jest ocena jego wpływu

na wzrost, laktację, metabolizm węglowodanów i lipidów. Uzyskano również

myszy ze specyficznym analogiem hormonu wzrostu, wykazujące kar-

łowatość. Prowadzone na nich badania powinny przyczynić się do wykrycia

hormonu mającego działanie antagonistyczne w stosunku do hormonu

wzrostu. Wyniki tych badań mogą mieć zastosowanie w leczeniu pacjentów

ze zwiększoną zawartością hormonu wzrostu.

Rozważana jest możliwość wykorzystania transgenezy w celu uzyskania

zwierząt dawców narządów (tzw. ksenotransplantów) dla ludzi. Dotych-

czasowe próby przeszczepu zwierzęcych narządów człowiekowi kończyły

się niepowodzeniem, z powodu nadostrej reakcji układu immunologicznego

biorcy, prowadzącej do odrzucenia przeszczepionego narządu. Wyniki

najnowszych badań wskazują możliwość uzyskania transgenicznych zwierząt

(np. świnie) z genami człowieka kontrolującymi odpowiedź układu im-

munologicznego na obce gatunkowo antygeny.

W doświadczeniach żywieniowych zwierzęta transgeniczne mogą służyć

do badań ekspresji genów różnych czynników metabolicznych.

3. Badania naukowe

Obiecujące są wyniki badań regulacji ekspresji genów prowadzone na

zwierzętach transgenicznych. Szczególnie ważne dla badań biomedycznych

jest tworzenie nowych modeli zwierzęcych, które wykazują nadekspresję

określonych genów, ekspresję genu w niewłaściwej tkance lub ekspresję

genów zmutowanych.

Rozdział

Mutacje

Mutacje to nagłe i trwałe zmiany w informacji genetycznej. Dzieli się je na:

genomowe, chromosomowe i genowe. Mutacje genomowe dotyczą zmian

w liczbie całych genomów lub pojedynczych chromosomów. Ich identyfikacja

odbywa się przede wszystkim na drodze obserwacji mikroskopowej. Mutacje

chromosomowe, nazywane też aberracjami chromosomowymi, związane są

z naruszeniem budowy chromosomu, a ich diagnoza jest dokonywana

również metodą analizy mikroskopowej. Wreszcie mutacje genowe dotyczą

zmian w budowie genu, a poznanie ich podłoża wymaga zastosowania

metod molekularnych.

Mutacje mogą powstawać samoistnie, jako wynik błędów w przebiegu

niektórych procesów komórkowych, takich jak replikacja DNA czy podział

jądra komórkowego, a także naprawa uszkodzeń powstałych pod wpływem

czynników mutagennych, czyli takich, które uszkadzają DNA lub strukturę

chromosomu (np. promieniowanie jonizujące, niektóre związki chemiczne).

W przypadku powstania mutacji w komórce somatycznej jej trwanie

ograniczone jest okresem życia organizmu. Należałoby zatem rozróżnić

proces przenoszenia mutacji, powstałych de novo, przez kolejne pokolenia

komórek (mutacja w komórkach somatycznych) od dziedziczenia mutacji,

za pośrednictwem komórek płciowych, przez następne pokolenia. Oczywiś-

cie mutacja może być odziedziczona przez potomstwo jedynie wówczas,

gdy jej skutkiem nie jest śmierć lub niepłodność nosiciela.

Mutacje są pierwotnym źródłem zmienności genetycznej i dlatego są

nierozerwalnie związane ze zmianami ewolucyjnymi, obserwowanymi wśród

organizmów żywych. Ponieważ mutacja ma charakter przypadkowy i bez-

kierunkowy, dlatego większość z nich jest niekorzystna dla organizmów.

Długotrwała ewolucja pozwalała na utrwalenie tylko tych mutacji, które

były korzystne lub obojętne dla organizmu. Hodowla zwierząt jest oczywiście

procesem nieporównywalnie krótszym w stosunku do ewolucji, a ponadto,

cel hodowlany jest realizowany zazwyczaj tylko przez kilka najbliższych

pokoleń. Dlatego można bez większych zastrzeżeń przyjąć, że mutacje są

zjawiskiem ogólnie niepożądanym w populacjach hodowlanych, a hodowca

jest zazwyczaj zainteresowany eliminacją nosicieli nowo powstających

i niektórych utrwalonych mutacji. Dotyczy to przede wszystkim mutacji

genomowych i chromosomowych. W przypadku mutacji genowych kwestia

ta nie jest już tak oczywista, ponieważ obok mutacji szkodliwych (np.

choroby genetyczne) znanych jest wiele przykładów pokazujących, że

hodowca jest zainteresowany utrzymaniem mutacji w populacjach zwierząt.

Klasycznym przykładem są mutacje odpowiadające za barwę okrywy

włosowej, pojawiające się od czasu do czasu na fermach zwierząt futer-

kowych. Znane są i inne mutacje, które wpływają korzystnie na cechy

produkcyjne zwierząt, takie jak: hipertrofia mięśniowa u niektórych ras

bydła mięsnego (mutacja genu miostatyny), wysoka plenność u niektórych

ras owiec (np. mutacja w genie BMPR-IB) itp.

W dalszej części tego rozdziału duży nacisk położymy na omówienie

negatywnych skutków mutacji, z jakimi spotykamy się w hodowli zwierząt

gospodarskich.

5.1. Mutacje genomowe

Mutacje genomowe dzieli się na dwie kategorie: euploidie i aneuploidie.

Euploidia jest mutacją prowadzącą do zmiany liczby genomów w komór-

ce. Na przykład, zamiast dwóch genomów (2n) w komórce pojawiają się

trzy (3n — triploidia) albo cztery (4n — tetraploidia) genomy lub tylko jeden

genom (n — haploidia, monoploidia). Jeżeli powstają układy o większej

liczbie genomów niż dwa, to stan ten określa się jako poliploidalność.

Powstawanie w zygocie mutacji genomowych typu euploidii może być

wynikiem różnych nieprawidłowości, wśród których do najważniejszych

zalicza się (ryć. 5-1):

1. Zapłodnienie haploidalnego oocytu II rzędu przez więcej niż jeden

plemnik, co daje początek zygocie triploidalnej (zapłodnienie przez dwa

plemniki) czy tetraploidalnej (zapłodnienie przez trzy plemniki). Zdarzenia

takie określa się mianem połispermii.

2. Zaburzenie przebiegu mejozy, głównie żeńskiej, prowadzące do

powstania oocytów II rzędu o niezredukowanej (2n) liczbie chromosomów.

Zapłodnienie takiego oocytu przez haploidalny plemnik daje początek

triploidalnej zygocie. Zakłócenie przebiegu mejozy może nastąpić podczas

anafazy I i wówczas nie dochodzi do wyrzucenia pierwszego ciałka kierunko

wego, a oocyt II rzędu ma diploidalną liczbę chromosomów. Do zaburzenia

wyrzucenia ciałka kierunkowego może dojść również podczas anafazy II,

która odbywa się już po wniknięciu plemnika do oocytu. Także w takim

przypadku przedjądrze żeńskie będzie miało diploidalną liczbę chromoso

mów. Po replikacji i zlaniu przedjądrzy powstaje zygota triploidalna.

Ryć. 5-1. Niektóre mechanizmy powstawania mutacji genomowych typu euploidii

3. Podjęcie podziału mejotycznego przez spermatogonium lub oogonium

o nieprawidłowym poziomie ploidalności, np. tetraploidalne oogonium,
które powstało w wyniku zakłócenia cytokinezy po mitotycznym podziale
jądra komórkowego. Z komórki takiej po zakończeniu mejozy i zapłodnieniu
powstaje triploidalna zygota.

4. Aktywacja partenogenetyczna polegająca na podjęciu podziałów

mitotycznych przez niezapłodniony oocyt (ginogeneza), czego skutkiem jest
rozwój haploidalnego zarodka.

W trakcie rozwoju zarodkowego może dojść do uformowania układu

miksoploidalnego, to znaczy takiego, gdzie w obrębie zarodka występują komórki
różniące się poziomem ploidalności, np. 2n i 4n czy 2n i 3n itd. Jest to skutek
zakłóceń w pierwszych podziałach mitotycznych zarodka, takich na przykład jak
brak cytokinezy po podziale jądra komórkowego. Ponieważ komórki te wywodzą
się z jednej zygoty, układ taki klasyfikowany jest jako mozaicyzm.

Euploidie są mutacjami letalnymi, co oznacza, że prowadzą one do

śmierci osobnika, zazwyczaj we wczesnym okresie rozwoju zarodkowego.
Tym samym każdy przypadek takiej mutacji zalicza się do kategorii nowo
powstałych (de novo). Praktycznie nie spotyka się tego rodzaju mutacji
w okresie pourodzeniowym. Mutacje te są jedną z przyczyn niepowodzeń

w rozrodzie zwierząt. Trudno jednak określić, jaka jest skala tego problemu.
Z badań prowadzonych na zarodkach uzyskiwanych metodą zapłodnienia
in vitro wynika, że co najmniej kilkanaście procent tak uzyskanych zarodków
może być obarczonych mutacjami typu poliploidii lub haploidii.

Aneuploidia to druga kategoria mutacji genomowych, która związana

jest ze zmianą liczby chromosomów w pojedynczych parach homologicz-
nych. Tak więc brak chromosomu nazywa się monosomią (2n — 1), a nadmiar
chromosomów to trisomia (2n +1). Jeśli zmiany wystąpią równocześnie
w dwóch parach chromosomów, to stan taki określany jest jako podwójna
monosomią (2n —l —1) lub podwójna trisomia (2n + l + l). Jeśli natomiast
występuje brak obu chromosomów w parze, to stan taki określany jest jako
nullisomia (2n —2), a obecność czterech chromosomów homologicznych
nazywany jest tetrasomią (2n + 2).

Aneuploidie są spowodowane nieprawidłowościami w przebiegu po-

działów komórkowych. W mejozie momentem krytycznym jest segregacja
chromosomów do przeciwległych biegunów komórki podczas anafazy I.
Nieprawidłowa segregacja w jednym biwalencie, gdy oba chromosomy
zmierzają do jednego bieguna komórki, prowadzi do powstania gamet
o liczbie chromosomów n + 1 oraz n —1. Jeżeli gamety takie będą uczest-
niczyły w zapłodnieniu, to powstaną zarodki obarczone trisomia (2n +1) lub
monosomią (2n —1). Również podczas podziałów mitotycznych (lub drugiego
podziału mejotycznego) może dojść do powstania komórek z nieprawidłową
liczbą chromosomów. Gdy podczas anafazy mitotycznej chromosomy
siostrzane nie rozejdą się symetrycznie do przeciwległych biegunów komórki,
to w komórkach potomnych powstaną układy 2n + l (oba chromosomy
siostrzane po podziale centromeru przeszły do jednego bieguna) oraz 2n — l
(do bieguna nie przeszedł żaden z chromosomów siostrzanych). Błąd
segregacji chromosomów siostrzanych podczas podziału komórek somatycz-
nych (np. zarodka) prowadzi do mozaicyzmu.

Zdecydowana większość aneuploidii jest letalna. Aneuploidie tylko

niektórych chromosomów nie prowadzą do śmierci nosiciela, jednak
powodują powstanie licznych wad rozwojowych. Wyjątek stanowią aneu-
ploidie chromosomów płci, którym na ogół nie towarzyszą wyraźne
zaburzenia w rozwoju somatycznym. Wśród zidentyfikowanych u zwierząt
gospodarskich aneuploidii dominują właśnie przypadki dotyczące chromoso-
mów płci. Zazwyczaj mutacje te stwierdzano w układzie mozaikowym,
w którym obok linii komórkowej z prawidłowym zestawem chromo-
somowym występowała jedna lub więcej linii aneuploidalnych. Wskazuje
to, że aneuploidie w postaci czystej prowadzą prawdopodobnie do śmierci
osobnika. Równocześnie wynika z tego, że podczas rozwoju zarodkowego
dochodzi do nieprawidłowej segregacji chromosomów siostrzanych. Aneu-
ploidie chromosomów płci prowadzą zazwyczaj do niepłodności.

Aneuploidia najczęściej opisywaną u zwierząt jest monosomią chromo-

somu X u klaczy (ryć. 5-2a). Klacz obarczona tą mutacją ma kariotyp

Również w przypadku tej chromosomopatii nosiciel dotknięty jest bezpłod-

nością, z tym jednak że zazwyczaj towarzyszy temu wolniejsze tempo

wzrostu somatycznego oraz widoczny niedorozwój jąder, co może być

stosunkowo łatwo zauważone przez hodowcę czy lekarza weterynarii.

Stwierdzenie wymienionych zaburzeń jest wystarczającą podstawą wy-

brakowania takiego osobnika. Przypadki trisomii chromosomu X opisywano

znacznie rzadziej. Przykładem może być niepłodna suka o prawidłowym

eksterierze (ryć. 5-2b). W przeciwieństwie do monosomii X0 oraz trisomii

XXY dość często się zdarza, że osobniki mające w swoim kariotypie trzy

chromosomy X są płodne. W potomstwie takich samic mogą się pojawić

zwierzęta obarczone trisomią XXY lub XXX. Jest to skutek segregacji

chromosomów w anafazie I, w wyniku której pojawia się około 50% gamet

z chromosomem X oraz około 50% gamet z układem XX. Zapłodnienie tych

ostatnich prowadzi do powstania zarodka z trisomią.

Przedstawione wyżej prawidłowości wskazują, że aneuploidie ilekroć się

pojawiają, to zazwyczaj mają pochodzenie de novo, gdyż skutkiem ich

wystąpienia jest albo śmierć nosiciela, albo głębokie zaburzenia rozwojowe

lub bezpłodność. Dzięki temu, poza nielicznymi wyjątkami, nie ma ryzyka

przeniesienia tej mutacji na następne pokolenia, a zatem i szerokiego

rozprzestrzenienia w populacji. Niemniej jednak, niezidentyfikowanie

nosiciela wśród zwierząt hodowlanych może być przyczyną dużych strat

ekonomicznych hodowcy, wynikających z kosztów odchowu oraz utrzyma-

nia zwierzęcia o upośledzonych funkcjach rozrodczych. Sytuacja taka jest

szczególnie dotkliwa dla hodowców koni, ze względu na dość częste

występowanie u klaczy monosomii chromosomu X, której zdiagnozowanie,

bez zastosowania metod cytogenetycznych, jest niemożliwe.

5.2. Mutacje chromosomowe

Pierwotną przyczyną zmian w budowie chromosomu jest jego uszkodzenie

(pęknięcie). Jeżeli pęknięcie nie zostanie naprawione, przez odpowiedzialne

za to systemy naprawy komórkowej, to nastąpi utrata fragmentu chromoso-

mu (delecja). Możliwe jest również nieprawidłowe przeprowadzenie napra-

wy uszkodzenia. Wówczas dochodzi do przegrupowania fragmentów w obrę-

bie jednego chromosomu (inwersja) lub kariotypu (fuzja centryczna, tandem

fuzja, translokacja wzajemna). Mogą powstać także inne nietypowe struktury,

takie jak izochromosomy (są zbudowane z dwóch identycznych ramion) lub

chromosomy koliste. Za przyczynę powstania izochromosomów uznaje się

nieprawidłowy podział centromeru w płaszczyźnie prostopadłej do osi

chromosomu, podczas podziału komórkowego. Z kolei chromosom kolisty

może powstać w wyniku dwóch pęknięć na przeciwległych końcach chromo-

somu, a następnie połączenia tych miejsc z równoczesną utratą małych

fragmentów na obu końcach chromosomu. Przyczyną mutacji chromosomo-

wej może być również niezrównoważona wymiana fragmentów chromatyd

100

niesiostrzanych podczas crossing over, prowadząca do powstania chromoso-

mów z brakiem (delecja) lub z podwojeniem (duplikacja) jakiegoś fragmentu.

Mutacja chromosomowa może wystąpić w układzie zrównoważonym,

jeżeli w komórce nie nastąpiła zmiana ilości informacji genetycznej, lub też

w układzie niezrównoważonym, gdy ilość informacji genetycznej w komórce

została zmieniona. Pewne mutacje chromosomowe są ze swojej natury

klasyfikowane już od momentu powstania do grupy niezrównoważonych

(delecje, duplikacje, izochromosomy). Inne — tzn. translokacje wzajemne,

tandem fuzje, fuzje centryczne, inwersje, występując pierwotnie w układzie

zrównoważonym, mogą prowadzić poprzez zakłócony przebieg segregacji

chromosomowej w anafazie I do powstania gamet niezrównoważonych,

a dalej do powstania zygot o zmienionej zawartości materiału genetycznego.

Dziedziczenie mutacji chromosomowych możliwe jest oczywiście jedynie

wówczas, gdy występuje ona w komórkach linii płciowej.

Mutacje chromosomowe, których skutkiem jest przegrupowanie infor-

macji genetycznej w kariotypie, prowadzą do zmiany sąsiedztwa genów.

Zmiana taka może pociągnąć za sobą naruszenie procesów kontroli ekspresji

genów. Zdarzyć się może, że przegrupowanie w pobliżu jakiegoś genu

może wywołać jego ekspresję lub jej zanik. Ma to związek zarówno

z funkcjonowaniem sekwencji poprzedzających gen (promotor, wzmacniacz,

wyciszacz), jak i ze strukturą samego genu. Znane są liczne przykłady

u ludzi, a także i zwierząt laboratoryjnych wpływu takich przegrupowań

chromosomowych na aktywację onkogenów lub inaktywację antyonkoge-

nów, czego skutkiem jest uruchomienie procesu nowotworowego.

U zwierząt gospodarskich najczęściej diagnozowane są mutacje chromo-

somowe w układzie zrównoważonym. Wynika to przede wszystkim z tego,

że mutacje chromosomowe niezrównoważone, podobnie jak aneuploidie,

są letalne lub prowadzą do poważnych, zauważalnych zmian fenotypowych.

Przypadki takie, odnotowywane jako martwe urodzenie, padnięcie po

urodzeniu lub ubój z konieczności, bardzo rzadko są zgłaszane przez

hodowców czy lekarzy weterynarii do badań cytogenetycznych i dlatego

można przyjąć, że zdecydowana większość tych przypadków nie jest

identyfikowana. Z kolei mutacje zrównoważone, nie wywołując zazwyczaj

efektu w postaci zauważalnych zmian fenotypowych, mają najczęściej

negatywny wpływ na płodność nosiciela mutacji. Jeżeli dotknie to osobnika

o dużej wartości genetycznej, to szansa na wykrycie nosicielstwa mutacji

jest znacznie większa, bo osobniki takie z urzędu mogą być objęte badaniami

cytogenetycznymi (np. buhaje), ponadto hodowcy są bardziej zainteresowani

poznaniem przyczyny zmniejszonej płodności.

W dalszej części tego rozdziału będzie mowa o mutacjach chromo-

somowych, które w momencie powstania mają charakter zrównoważony.

Zaliczane są do nich: fuzje centryczne, inaczej centromerowe (translokacje

robertsonowskie), fuzje tandemowe, translokacje wzajemne i inwersje,

wśród których wyróżniane są inwersje peri- i paracentryczne. Szczególna

101

5-4a). Duże fragmenty, reprezentujące prawie cale ramiona długie chromo-

somów, zostają połączone w centromerze i w efekcie powstaje jeden duży

dwuramienny chromosom, natomiast małe fragmenty okołocentromerowe

zostają zagubione podczas następnych podziałów komórkowych (nie wcho-

dzą do jąder komórkowych odbudowujących się podczas telofazy). Utrata

małych fragmentów z okolicy centromeru, który zawiera przede wszystkim

niekodujące sekwencje powtarzalne, nie odbija się negatywnie na nosicielu.

Ryć. 5-4. Translokacje robertsonowskie: (a) rob(l;29), buhaj, barwienie roztworem Giemsy;

chromosom translokacyjny oraz chromosomy pici są wskazane; (b) rob(5;7), kozioł,

kompleksy synaptonemalne obserwowane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym;

triwalent oraz biwalent X-Y są wskazane

103

Skutkiem tej mutacji jest zmniejszenie liczby chromosomów o jeden, z rów-

noczesnym zachowaniem nie zmienionej liczby ramion chromosomowych.

Jeżeli fuzji uległy chromosomy homologiczne, to podczas anafazy I

mejozy nastąpi nieprawidłowa segregacja chromosomów. W pachytenie

profazy I nowo powstały chromosom dwuramienny pozostanie jako uniwa-

lent, natomiast w anafazie I do jednego bieguna przejdzie tenże dwu-

ramienny chromosom, podczas gdy na drugim biegunie zabraknie jednego

chromosomu. Prowadzi to oczywiście do tego, że połowa gamet będzie typu

n —l (układ powstający na biegunie, do którego nie przeszedł chromosom

dwuramienny), a druga będzie miała n chromosomów, z tym jednak że

wśród nich będzie chromosom dwuramienny, co w rzeczywistości od-

powiada układowi n + 1. W przypadku zapłodnienia powstają zygoty

aneuploidalne, które z dużym prawdopodobieństwem zginą już podczas

rozwoju embrionalnego bądź płodowego.

Zupełnie inaczej przedstawia się sytuacja, gdy fuzja obejmie chromosomy

wywodzące się z różnych par homologicznych. Wówczas w komórce

powstaje układ składający się z jednego chromosomu dwuramiennego oraz

po jednym chromosomie z dwóch par akrocentrycznych. Jeżeli komórka

taka rozpocznie podział mejotyczny, to w pachytenie profazy I uformuje się

triwalent, w którym chromosomy akrocentryczne koniugują z homologicz-

nymi ramionami chromosomu powstałego w wyniku fuzji (ryć. 5-3b, 5-4b).

W anafazie I zazwyczaj dochodzi do zrównoważonej segregacji, podczas

której chromosom dwuramienny przechodzi do jednego bieguna, a oba

chromosomy akrocentryczne do drugiego bieguna komórki. W efekcie

powstają gamety o zrównoważonej informacji genetycznej, mimo iż połowa

z nich (niosąca dwuramienny chromosom) będzie miała n —l chromosomów.

Jednakże liczba ramion chromosomowych w obu rodzajach gamet będzie

taka sama. W niewielkiej części komórek w stadium anafazy I może dojść

do niewłaściwej segregacji triwalentu i wówczas powstaną gamety, a dalej

zygoty o nieprawidłowej liczbie ramion chromosomowych, czyli ukształtuje

się układ aneuploidalny. Zarodki takie będą ginęły w okresie życia zarod-

kowego lub płodowego. Hodowca będzie wówczas odnotowywał zmniej-

szoną płodność takiego osobnika. Należy zaznaczyć, że nosiciele fuzji mają

prawidłowy fenotyp i nie można ich zidentyfikować w inny sposób, jak

poprzez badanie cytogenetyczne.

Fuzje centryczne są często identyfikowane u bydła, szczególnie ras

mięsnych. Opisano wiele różnych fuzji, w których uczestniczyły chromosomy

z różnych par, ale najpowszechniejsza jest fuzja obejmująca chromosomy

z pary l i 29 (ryć. 5-4a). Mutację tę po raz pierwszy opisał w 1964 roku

Gustavsson u czerwono-białego bydła szwedzkiego. Pięć lat później ten sam

badacz wykazał, że jej nosiciele mają zmniejszoną płodność o około 5%.

Fuzje 1/29 zidentyfikowano w ponad 50 rasach bydła, na wszystkich

kontynentach, a w tym również w Polsce. Najwięcej przypadków fuzji

stwierdza się w rasach mięsnych (montbelliard, blonde d'Aquitaine itp.),

104

a niekiedy także w małych izolowanych rasach lokalnych (np. białe bydło

rrytyjskie, włoskie bydło rasy podolian czy bydło korsykańskie). Obser-

wowane zmniejszenie płodności jest skutkiem wczesnej zamieralności

zarodków o niezrównoważonym kariotypie. Oprócz fuzji 1;29 zdiagnozo-

wano wiele innych przypadków, w których zaangażowane były chromosomy

z innych par. Przykładem może być fuzja między chromosomami z pary

5 i 22, którą opisano w Polsce.

Szerokie rozprzestrzenienie fuzji centrycznych u bydła i związane z tym

zmniejszenie płodności stało się główną przyczyną wprowadzenia w wielu

krajach do praktyki hodowlanej obowiązkowych badań cytogenetycznych

buhajów przed ich dopuszczeniem do użytkowania rozpłodowego. Szwecja

była pierwszym krajem, który wprowadził taką regulację. W Polsce, począw-

szy od 1989 roku, obowiązkowymi badaniami objęte są wszystkie młode

buhaje, przed ich wprowadzeniem do stacji produkcji nasienia.

Gatunkiem, u którego fuzja centryczna występuje bardzo często, jest lis

polarny. W tym przypadku można wręcz mówić o polimorfizmie kariotypo-

wym, bowiem około 50% zwierząt ma kariotyp heterozygotyczny ze względu

na fuzję (dotyczy ona, jedynych w kariotypie lisa, dwóch par akrocentryków,

nr 23 i 24), a około 30% ma kariotyp podstawowy — 2n = 50 oraz pozostałe

około 20% ma kariotyp homozygotyczny ze względu na fuzję — 2n = 48.

Ciekawe, że u tego gatunku nie stwierdza się zmniejszonej płodności

zwierząt o 2n = 49, natomiast niektóre opracowania wskazują na zwiększoną

plenność samic o kariotypie 2n = 48.

Ryć. 5-5. Dziedziczenie translokacji robertsonowskiej na przykładzie bydła. Chromosomy

biorące udział w fuzji przedstawiono schematycznie

105

Należy podkreślić, że fuzja centryczna jest dziedziczona przez połowę

potomków nosiciela. Jeżeli na przykład u bydła zostaną skojarzeni ze sobą

nosiciele tej samej fuzji centrycznej, to u potomstwa możemy się spodziewać

25% osobników o normalnym kariotypie 2n = 60, 50% nosicieli fuzji

o 2n = 59 i 25% osobników będących homozygotami ze względu na fuzję,

0 2n = 58 (ryć. 5-5). Przedstawione obserwacje wskazują, że szerokie

rozprzestrzenienie fuzji centrycznych w populacjach zwierzęcych (głównie

bydło, lisy polarne, a w mniejszym stopniu także owce i kozy) jest skutkiem

ich dziedziczenia, a nie częstego powstawania de novo. Pokazuje to jedno

cześnie, jak łatwo mutacja taka może zostać rozprzestrzeniona w populacji,

szczególnie wówczas, gdy rozród jest oparty na sztucznej inseminacji.

Translokacja wzajemna powstaje w wyniku niewłaściwego

połączenia podczas procesu naprawy pęknięć nici chromatynowych,

pochodzących z dwóch różnych chromosomów. Jeżeli mutacji takiej będą

podlegały chromosomy homologiczne i wymienione zostaną nierówne

fragmenty chromosomów, to podczas mejozy dojdzie do powstania gamet,

które będą obarczone bądź delecją, bądź duplikacją. Skutek takiej

translokacji będzie zazwyczaj letalny, tak jak to najczęściej obserwuje się

przy mutacjach niezrównoważonych.

Jeżeli translokacją wzajemną będą objęte chromosomy niehomologiczne

(ryć. 5-6a, 5-7), to podczas pachytenu profazy I zostanie uformowany

tetrawalent (ryć. 5-6b, 5-8), który zazwyczaj będzie segregował w anafazie

1 w układzie 2:2, tzn. dwa chromosomy przejdą do jednego bieguna i dwa

chromosomy do drugiego bieguna komórki. Segregacja symetryczna (2:2)

nie gwarantuje jeszcze, że powstaną gamety o zrównoważonej informacji

genetycznej. Wśród trzech możliwych segregacji symetrycznych tylko jedna

warunkuje powstanie biegunów o zrównoważonej ilości informacji genetycz

nej. Jest to segregacja naprzeciwległa, w wyniku której do jednego bieguna

wędrują po jednym nie zmienionym (prawidłowym) chromosomie z obu

par, a do drugiego przechodzą chromosomy, które uczestniczyły w trans

lokacji. Należy zaznaczyć, że suma informacji genetycznej zawarta w dwóch

chromosomach, które podlegały translokacji, jest taka sama jak w dwóch nie

zmienionych chromosomach. W ten sposób segregacja naprzeciwległa

odpowiada za powstanie gamet o zrównoważonej ilości informacji genetycz-

nej. Dwa pozostałe rodzaje segregacji, określane jako sąsiednie, prowadzą

do uformowania niezrównoważonej (delecje, duplikacje) ilości informacji

genetycznej w gametach. Na niezrównoważenie ilości informacji genetycznej

wpływa również crossing over, jeśli zajdzie na odcinku między punktem

pęknięcia i wymiany fragmentów chromosomowych a centromerem. Oczy

wiście segregacja niesymetryczna (3: l lub 4:0) również powoduje utworze

nie gamet genetycznie niezrównoważonych.

Podobnie jak w przypadku fuzji centrycznej, także translokacją wza-

jemna jest mutacją dziedziczną, jeśli oczywiście wystąpi w linii komórek

płciowych. Przyjmuje się, że około 50% gamet wytwarzanych przez

106

wówczas około 50-procentowy spadek płodności (lub plenności) u takiego

osobnika. Druga połowa gamet będzie miała zrównoważoną ilość informacji

genetycznej, ale wśród nich połowa będzie miała układ, w którym wystąpią

dwa translokowane chromosomy. Właśnie te gamety są odpowiedzialne za

przenoszenie translokacji wzajemnej do następnego pokolenia. W ostatecz-

nym rozrachunku po nosicielu skojarzonym z osobnikami o prawidłowym

kariotypie uzyska się potomstwo, w którym polowa będzie miała prawid-

łowy kariotyp, a połowa będzie nosicielami translokacji. Potomstwo o nie-

zrównoważonym kariotypie zazwyczaj ginie w okresie życia płodowego lub

wkrótce po urodzeniu.

Na krótkie omówienie zasługuje specjalna kategoria translokacji wzajem-

nych, która prowadzi do bezpłodności samców nosicieli. Stan taki towarzyszy

nosicielstwu translokacji wzajemnej, w którą zaangażowany jest chromo-

som X (translokacja typu X-autosom). Bezpłodność samców nosicieli jest

wynikiem zablokowania procesu spermatogenezy we wczesnych stadiach

mejozy (pachyten profazy I). Przypuszcza się, że ma to związek z przed-

wczesnym uaktywnieniem chromosomu X podczas spermatogenezy. U samic

nosicielek stwierdza się jedynie zmniejszenie płodności, podobnie jak

w przypadku translokacji typu autosom-autosom.

Translokacje wzajemne najczęściej są rozpoznawane u świń (ryć. 5-7).

Do tej pory zidentyfikowano na świecie, w rozmaitych rasach, ponad 90

różnych translokacji wzajemnych, które były rozprzestrzenione w popu-

lacjach w różnym stopniu.

Trzeba podkreślić, że nosiciele translokacji (kariotyp zrównoważony)

mają prawidłowy fenotyp i niczym nie odróżniają się od osobników

o prawidłowym kariotypie. Knury nosiciele mają prawidłowe libido, a obraz

nasienia (koncentracja, morfologia czy ruchliwość plemników) nie różni się

w porównaniu z nasieniem knurów o prawidłowym kariotypie. Podobnie

normalny fenotyp mają lochy nosicielki. Jedyną wskazówką sugerującą

nosicielstwo takiej mutacji są obniżone wskaźniki płodności lub plenności.

Oczywiście stan taki może być spowodowany różnymi czynnikami. Niemniej

obserwacje takie powinny być traktowane jako sygnał skłaniający do

przeprowadzenia badań cytogenetycznych. Na przykład we Francji badania

cytogenetyczne wykonywane są u knurów, po których uzyskano mioty

o obniżonej liczebności (poniżej 8 prosiąt w miocie).

Fuzja tandemowa jest mutacją podobną do fuzji centrycznej. Jej

powstanie związane jest z nieprawidłową naprawą pęknięć w dwóch

chromosomach. Jedno z nich występuje w części końcowej ramienia

w chromosomie jedno- lub dwuramiennym, a drugie tuż pod centromerem

w ramieniu długim chromosomu akrocentrycznego. W efekcie duże fragmenty

chromosomowe zostają połączone tandemowo — jeden za drugim, a małe

fragmenty (okołocentromerowy z chromosomu akrocentrycznego i dystalny

z drugiego chromosomu) zostają zagubione, podobnie jak w przypadku fuzji

centrycznej. Jeżeli tandem fuzja zajdzie między dwoma homologicznymi

109

chromosomami akrocentrycznymi, to podczas mejozy, podobnie jak przy

fuzji centrycznej, dojdzie do powstania aneuploidalnych gamet.

Powstanie tandem fuzji między chromosomami niehomologicznymi

wywołuje analogiczne skutki jak fuzja centryczna, tzn. może powodować

nieznaczne zmniejszenie płodności z powodu zamierania zarodków, które

powstały na bazie gamet o niezrównoważonej ilości informacji genetycznej.

Mutacja ta jest dziedziczona przez połowę potomków nosiciela, analogicznie

do schematu przedstawionego dla translokacji robertsonowskich. Tandem

fuzja była rzadko opisywana u zwierząt gospodarskich. Znane są nieliczne

przypadki tej mutacji u bydła, chociaż w rasie czerwonej duńskiej jej

rozprzestrzenienie w latach 70. było dość duże. Oceniano wówczas, że

zmniejszenie płodności wywołane przez tę mutację było rzędu 10%.

Inwersja jest mutacją zachodzącą w obrębie jednego chromosomu,

w którym wystąpiły dwa pęknięcia, a następnie zostały one niewłaściwie

naprawione w taki sposób, że fragment pomiędzy punktami pęknięć został

odwrócony o 180°. Jeżeli w obrębie odwróconego fragmentu występuje

centromer, to wówczas inwersja jest określana jako pericentryczna. Jeżeli

odwrócony fragment nie obejmuje centromeru, to nieprawidłowość jest

określana jako inwersja paracentryczna. Inwersja pericentryczna zazwyczaj

zmienia morfologię chromosomu, z wyjątkiem sytuacji, gdy pęknięcia wystąpiły

w równych odległościach od centromeru w obu ramionach chromosomowych.

Przebieg koniugacji podczas pachytenu profazy I, w obrębie fragmentu

objętego inwersją na jednym z chromosomów, może przebiegać w trojaki

sposób: 1) chromosomy tworzą pętlę inwersyjną, która zapewnia zachowanie

homologicznej koniugacji wzdłuż całego biwalentu, 2) chromosomy częś-

ciowo pozostają nieskoniugowane — w części, gdzie na jednym z chromo-

somów występuje odwrócony fragment, oraz 3) pełna koniugacja, która

częściowo jest niehomologiczna, tam gdzie fragment odwrócony koniuguje

z fragmentem prawidłowym. Najmniej korzystny, z punktu widzenia

skutków gametogenezy, jest pierwszy sposób koniugowania, podczas którego

dochodzi do uformowania pętli inwersyjnej. Jeżeli w obrębie pętli zajdzie

crossing over, to wówczas powstaną gamety obarczone delecją lub duplika-

cją, z jednoczesną możliwością powstania chromosomów dicentrycznych

(mających dwa centromery) oraz acentrycznych (pozbawionych centromeru).

Taki przebieg mejozy prowadzi oczywiście do powstania gamet o niezrów-

noważonej ilości informacji genetycznej i ostatecznie do zmniejszenia

płodności nosiciela mutacji, spowodowanej zamieraniem zarodków o nie-

zrównoważonym kariotypie. Brak koniugacji lub koniugacja niehomologicz-

na uniemożliwia zajście w tym obszarze crossing over i tym samym nie ma

ryzyka powstania gamet obarczonych wymienionymi nieprawidłowościami.

Inwersje dość rzadko opisywano u zwierząt gospodarskich. Niewątpliwie

jest to częściowo wynikiem trudności w ich rozpoznawaniu. Jeżeli zajściu

inwersji nie towarzyszy widoczna zmiana morfologii, to bardzo łatwo

można ją przeoczyć podczas obserwacji mikroskopowej. Uwaga ta dotyczy

110

wszystkich inwersji paracentrycznych, ale także niektórych przypadków
pericentrycznych. Dotychczas zdiagnozowano na świecie co najmniej siedem
przypadków inwersji pericentycznych u bydła i trzy u świń oraz tylko jeden
przypadek inwersji paracentrycznej u świni. W przypadku dwóch inwersji
u

świni analizowano proces formowania kompleksów

synaptonemalnych i w żadnym z nich nie stwierdzono obecności pętli
inwersyjnej. Nie wiązano również jednoznacznie tych mutacji ze zmniejszoną
płodnością ich nosicieli.

5.3. Mutacje genomowe i chromosomowe

zidentyfikowane u zwierząt hodowanych w Polsce

Badania cytogenetyczne zwierząt gospodarskich mają w Polsce długą
tradycję. W okresie ostatnich 25 lat zdiagnozowano wiele przypadków
nieprawidłowości chromosomowych. Były wśród nich mutacje typu aneu-

Oznaczenia: rób — translokacja robertsonowska; rep — translokacja wzajemna
(w nawiasach wskazano numery chromosomów zaangażowanych w mutację); rcp(?;?) —
translokacja wzajemna, dla której nie ustalono, jakie chromosomy w niej uczestniczyły;
inv — inwersja; chimeryzm — występowanie dwóch linii komórkowych XX oraz XY
w limfocytach (patrz: frymartynizm); * — część przypadków ma kariotyp mozaikowy,
np. XX/XO lub XXY/XY

111

ploidii chromosomów płci, a także mutacje chromosomowe, takie jak

fuzje centryczne, translokacje wzajemne i inwersje. Oprócz tych typowych

chromosomopatii zidentyfikowano także liczną grupę zwierząt będących

nosicielami chimeryzmu w komórkach krwi, polegającego na wystąpieniu

linii żeńskiej XX i linii męskiej XY. Nieprawidłowość tę szczegółowo

omówiono w podrozdziale: Interseksualizm. Sumaryczne zestawienie

wyników przeprowadzonych badań przedstawione jest w tabeli 5-1.

Zgromadzona wiedza o występowaniu mutacji genomowych i chro-

mosomowych w krajowej populacji bydła sprawiła, że już w 1989 roku

wprowadzono obowiązkowe badania cytogenetyczne młodych buhajów

przed ich dopuszczeniem do użytkowania w stacjach produkcji nasienia.

Aktualne regulacje (1999 r.) prawne obowiązkiem takim objęły także

rozpłodniki innych gatunków wykorzystywane w inseminacji: knury,

ogiery, tryki i kozły. Dzięki temu można skutecznie zapobiegać roz-

przestrzenianiu się nieprawidłowości chromosomowych.

5.4. Mutacje genowe 5.4.1.

Przyczyny i rodzaje mutacji genowych

Mutacje genowe są to zmiany sekwencji nukleotydów w obrębie genu.

Mutacje te mogą zachodzić samoistnie, głównie na skutek błędów w procesie

replikacji DNA, rzadziej na drodze modyfikacji chemicznych zasad azoto-

wych w DNA. Mutacje te noszą nazwę mutacji spontanicznych. W odróż-

nieniu od nich mutacje indukowane są powodowane działaniem mutagen-

nych czynników chemicznych lub fizycznych. Czynniki te mogą powstawać

w wyniku przemian metabolicznych zachodzących w komórkach lub mogą

pochodzić ze środowiska zewnętrznego.

Do najsilniej działających czynników mutagennych należą:

• promieniowanie jonizujące (np. Roentgena), które powoduje zmiany

struktury zasad lub rozrywanie mostków wodorowych między zasadami

w DNA. Wrażliwość organizmów na promieniowanie jonizujące zależy od

posiadanych przez nie mechanizmów naprawy. Na przykład, niektóre

rodzaje bakterii czy gatunki owadów są znacznie bardziej odporne na

promieniowanie jonizujące niż człowiek i zwierzęta;

• promieniowanie nadfioletowe (UV), intensywnie pochłaniane przez

DNA, indukujące zmiany w zasadach pirymidynowych, np. ich dimeryzację

(dimery pirymidynowe powstają w wyniku wytwarzania kowalencyjnych

wiązań między leżącymi obok siebie w łańcuchu DNA zasadami pirymidy-

nowymi) lub rozrywanie podwójnej helisy DNA;

• hydroksyloamina wywołująca zmianę cytozyny na pochodną uracylu,

co prowadzi do tranzycji C

→T;

112

• kwas azotawy powodujący deaminację zasad w DNA i RNA. Na

rrzykład na skutek deaminacji cytozyny powstaje uracyl, który podczas

replikacji przyłącza adeninę zamiast guaniny, komplementarnej do cytozyny;

• związki alkilujące, które dzięki posiadanym grupom etylowym,

metylowym lub bardziej złożonym powodują alkilację (metylowanie lub

etylowanie) zasad w kwasach nukleinowych;

• barwniki akrydynowe (np. proflawina, oranż akrydynowy, akryfla-

wina), które wnikają między zasady w łańcuchu DNA, powodując deforma

cje podwójnej helisy DNA;

• analogi zasad (np. 5-bromouracyl, analog tyminy oraz 2-aminopuryna,

analog adeniny), które mogą być wbudowywane w DNA.

Pomimo dużej różnorodności czynników mutagennych, mogą one

powodować te same typy mutacji w różnych organizmach. Dzieje się tak

dlatego, iż wszelkie typy uszkodzeń w DNA wywołane mutagenami

stanowią tylko zmiany premutacyjne, które w wyniku procesów naprawy

mogą zostać zlikwidowane. W przypadku nieskutecznej naprawy dochodzi

do utrwalenia zmian mutacyjnych.

Niekorzystne skutki działania czynników mutagennych są łagodzone

przez enzymatyczne procesy naprawy. Analizując procesy naprawy można

wyróżnić naprawę bezpośrednią (przez wycinanie) i pośrednią (porep-

likacyjną, zwaną też naprawą w nici potomnej).

Naprawa bezpośrednia — NER (ang. nucleotide excision repair) polega

na wycinaniu nukleotydu (usuwane są duże uszkodzenia) bądź zasady,

uszkodzonej przez promieniowanie jonizujące i czynniki alkilujące. W upro-

szczeniu proces ten przebiega tak, iż po rozpoznaniu uszkodzenia specyficz-

ny enzym (zależna od ATP endonukleaza) nacina nić DNA po obu stronach

uszkodzenia, następnie jednoniciowy, kilku- lub kilkunastonukleotydowy

fragment z uszkodzeniem jest usuwany. Powstała przerwa jest wypełniana

przez polimerazę, a nić DNA jest scalana przez ligazę. Przypuszczalnie

w komórce funkcjonują dwa rodzaje NER, jeden polega na naprawie nici

transkrybowanej genów aktywnych transkrypcyjnie (ang. transcription--

coupłed repair), drugi natomiast polega na naprawie pozostałej części

genomu (ang. global genome repair), czyli nici kodującej i DNA nieaktyw-

nego transkrypcyjnie. Zwykle uszkodzenia nici transkrybowanej usuwane

są dwa lub trzy razy szybciej niż uszkodzenia nici kodującej.

Mechanizmy naprawy są dokładnie zbadane u organizmów prokariotycz-

nych, natomiast proces usuwania uszkodzeń w komórkach zwierzęcych jest

nadal słabo poznany. Wiadomo jednak, iż w komórkach zwierzęcych rodzaj

i umiejscowienie uszkodzeń zależą nie tylko od sekwencji nukleotydów

w nici DNA, ale również od struktury chromatyny. Wyższy poziom

organizacji chromatyny zwiększa dostępność DNA dla niektórych czynników

mutagennych. Na przykład, promieniowanie jonizujące wytwarza więcej

wiązań krzyżowych między białkiem i DNA w chromatynie czynnej

w porównaniu z nieczynną.

113

Naprawa pośrednia zachodzi po zreplikowaniu uszkodzonego DNA.

U bakterii E.coli znany jest kompleks enzymatyczny, który rozpoznaje

zmiany konformacyjne nowo replikowanego DNA, będące efektem nie-

komplementarności zasad. Kompleks ten odróżnia nowo zsyntetyzowaną

nić DNA od nici matrycowej i dokonuje wycięcia niewłaściwie wstawionych

nukleotydów oraz uzupełnia powstałe braki komplementarnymi nukleoty-

dami. Niestety analogiczny proces w komórkach zwierzęcych nie jest

jeszcze dokładnie poznany.

Mutacje genowe zachodzące w komórkach rozrodczych powodują trwałe

zmiany przekazywane z pokolenia na pokolenie. Mutacje te mogą zachodzić

w genach kodujących strukturę białka lub rzadziej w genach kodujących

strukturę tRNA lub rRNA.

Mutacje genowe zachodzące w komórkach somatycznych nie są dziedzi-

czne. Mutacje te w zależności od okresu rozwoju zarodka mogą dotyczyć

wszystkich komórek lub tylko pewnych części komórek dorosłego organiz-

mu. W fenotypie osobnika z mutacją somatyczną można zaobserwować

tzw. mozaikowość, polegającą na miejscowym występowaniu zmienionej

cechy, np. czarny królik mający niebieskie plamki czy kura o jednej nodze

żółtej, a drugiej białej.

Znacznie większe znaczenie mają mutacje somatyczne, zachodzące już

po urodzeniu, u osobników w różnym wieku. Są one zazwyczaj indukowane

przez czynniki mutagenne. Jeżeli mutagen taki odpowiada za uruchomienie

transformacji nowotworowej, to określany jest jako karcynogen. Mutacje

takie, prowadząc do defektów lub zaburzeń ekspresji genów związanych

z proliferacją komórek czy naprawą uszkodzeń DNA, powodują nie

kontrolowany, inwazyjny wzrost tych komórek oraz zasiedlanie przez nie

innych, nawet odległych narządów.

Mutacje genowe spontaniczne charakteryzuje odwracalność i powtarzal-

ność. Odwracalność procesu mutacji polega na tym, że allel, który powstał

dzięki mutacji genu, może zmutować wstecznie do formy wyjściowej tego

genu. Graficznie można to przedstawić następująco:

przy czym A i a są allelami, natomiast u i v oznaczają częstość mutacji w obu

kierunkach.

Potwierdzeniem odwracalności mutacji jest bezrożność i rogatość u owiec.

Zarówno owce bezrogie w rasie dorset horn, jak również owce rogate

w rasach bezrogich mogą być wynikiem mutacji w tym samym locus.

Lepiej poznane są zmiany normalnego allelu w kierunku mutanta, ale

mutacje odwrotne — zmutowanego allelu do normalnego również są

obserwowane.

114

Mutacja wsteczna nie zawsze jest jednak wynikiem powrotu do pierwot-

nego zapisu genetycznego, może ona być następstwem tzw. mutacji
supresorowej, zachodzącej w obrębie tego samego genu, w którym nastąpiła
mutacja pierwotna, lub w zupełnie innym genie.

Istotą powtarzalności mutacji genowej jest to, iż określona mutacja może

wystąpić ponownie, dając zbliżone, a często nawet takie same skutki
fenotypowe. Przykładem tego może być recesywna achondroplazja, wy-
stępująca u kilku ras bydła.

Podatność na mutacje nie jest jednakowa wśród wszystkich genów. Mając

to na uwadze, można podzielić geny na mniej i bardziej labilne lub stabilne.
Do genów labilnych można zaliczyć gen czynnika VIII krzepliwości krwi.
Wśród chorych na hemofilię aż 1/3 przypadków tej choroby jest wynikiem
mutacji de novo. Z kolei genem bardzo stabilnym jest gen choroby (pląsawicy)
Huntingtona, ciężkiego neurodegeneracyjnego zaburzenia dziedzicznego,
pojawiającego się z częstością l: 10000 osób w większości populacji pocho-
dzenia europejskiego. Choroba ta ujawnia się najczęściej w wieku powyżej
40. roku życia i prowadzi do śmierci. Została ona opisana w 1872 roku przez
Johna Huntingtona, stąd jej nazwa, znana była jednak od XVII wieku.
Pojawiła się w Europie i przez emigrantów została przeniesiona na inne
kontynenty. Dotychczas nie wiadomo, czy były jakieś inne ogniska początku
tej choroby. Wynika z tego, że diagnozowane przypadki choroby Huntingto-
na są efektem dziedziczenia mutacji w genie huntingtyny, a nie jej
pojawiania się de novo.

Częstość, z jaką występują mutacje w różnych loci, jest niejednakowa.

W przypadku niektórych genów wykazano, iż większość spontanicznych
mutacji zachodzi w kilku miejscach charakterystycznych dla danego genu,
nazwanych gorącymi miejscami (ang. hot spots). Badania genu hemofilii
A u ludzi potwierdziły, iż takimi gorącymi miejscami są sekwencje dinuk-
leotydowe CG, zwane wyspami CpG. Więszość mutacji zarejestrowanych
w obrębie genu hemofilii A polegało na zamianie dinukleotydowej sekwencji
CG na TG, rzadziej CG na CA. Również w obrębie genu DMD, zlokalizo-
wanego w chromosomie X u ludzi, warunkującego chorobę zwaną dystrofią
mięśniową Duchenne'a, stwierdzono istnienie dwóch regionów (gorące
miejsca), w których najczęściej występują mutacje. Pierwszy region znajduje
się w odległości 0,5 miliona par zasad od promotora, w regionie
DXS164/DXS206, drugi natomiast w części centralnej genu, tj. 1,2 miliona
par zasad od promotora.

Na częstość mutacji genowych spontanicznych mogą mieć wpływ

również czynniki dziedziczne. U muszki owocowej (Drosophila melanogaster)
wykryto gen MuF, zlokalizowany w chromosomie 2 pary, warunkujący
większą podatność innych genów na mutacje.

Większość mutacji jest dla organizmu szkodliwa, a nawet letalna. Czasem

jednak mutacja zmienia właściwości organizmu tak, że zyskuje on cechy
korzystne. Zdarzają się również mutacje zupełnie lub niemal zupełnie

115

obojętne dla organizmu. W wyniku takich mutacji powstały, na przykład,

serie alleli wielokrotnych, które są omówione w rozdziale: Podstawowe

mechanizmy dziedziczenia cech.

Rodzaje mutacji genowych i ich skutki można analizować na poziomie

DNA lub na poziomie polipeptydu. Rozpatrując mutację na poziomie DNA

można wyróżnić następujące zmiany w sekwencji nukleotydów w danym

genie (ryć. 5-9):

1) tranzycja — zamiana jednej zasady purynowej na drugą purynową

lub pirymidynowej na inną pirymidynową (w podwójnej helisie będą

zamiany par zasad A/T

←→G/C),

2) transwersja -- zamiana zasady purynowej na pirymidynową i od

wrotnie pirymidynowej na purynową; w podwójnej helisie będą to zamiany:

3) delecja — wypadnięcie (utrata) jednej lub kilku par nukleotydów,

4) insercja — wstawienie jednej lub kilku par nukleotydów.

Przyczyną samorzutnej zamiany jednej pary nukleotydów na inną,

według hipotezy Watsona i Cricka, mogą być tautomeryczne przekształ-

cenia zasad azotowych, zachodzące pod wpływem działania czynników

zewnętrznych. Przekształcenia te polegają na zmianie położenia prze-

strzennego poszczególnych atomów oraz zmianie rozkładu elektronów

Ryć. 5-9. Mutacje genowe — zmiany sekwencji nukleotydów

116

i protonów w cząsteczce zasady. W dwuniciowej helisie DNA zasady

komplementarne tworzą wiązania między grupami aminowymi (—NH

)

i ketonowymi (—CO). Przekształcenie tautomeryczne powoduje zamianę

grupy aminowej na iminową (=NH), zaś ketonowej na enolową (=C—OH), a

w konsekwencji zmianę konfiguracji połączeń wodorowych występujących

między zasadami purynowymi i pirymidynowymi. Adenina w formie keto-

nowej łączy się z tyminą dwoma mostkami wodorowymi, natomiast w formie

enolowej łączy się trzema mostkami z cytozyną. Z kolei, guanina w normalnej

formie (ketonowej) łączy się z cytozyną, a w formie tautomerycznej z tyminą.

Tautomeryczne formy enolowe są nietrwałe i po pewnym czasie wracają

samorzutnie do formy ketonowej, odzyskując zdolność łączenia się z zasada-

mi komplementarnymi dla tych form. Skutkiem przemian tautomerycznych

może być błąd włączania bądź błąd replikacji. Błąd włączania polega na tym,

że enołowa forma tyminy łączy się z guanina. Tautomeryczna forma tyminy

powraca do formy ketonowej i w następnej replikacji łączy się z adeniną.

Błąd replikacji zachodzi wówczas, gdy na przykład w DNA podczas replikacji

tyminą ulega przekształceniu z formy ketonowej w enołowa i zamiast

z adeniną łączy się z guanina. Z kolei, w następnej replikacji do guaniny

przyłączy się komplementarna do niej cytozyną. Skutkiem tego będzie

pojawienie się pary G-C w miejscu, gdzie przed błędem replikacji była para

Oba rodzaje błędów występują także po przekształceniach tautomerycznych

innych zasad.

Mutacje genowe mogą być także następstwem zakłóceń w splicingu,

czyli tzw. obróbce mRNA, nazwanej dojrzewaniem. Splicing polega na

wycinaniu intronów z pierwotnego transkryptu (pre-mRNA), w wyniku

którego powstaje mRNA zawierający tylko sekwencje kodujące (eksony).

Przykładem takiej mutacji jest delecja w genie a

kazeiny mleka, prowadząca

do powstania alleli: F (delecja 3 eksonów) i D (delecja l eksonu).

Od niedawna znany jest bardzo specyficzny rodzaj mutacji genowych —

mutacje dynamiczne. Dotychczas wykryto je u ludzi w 12 loci, z których 10

powoduje choroby genetyczne, między innymi chorobę Huntingtona, zespół

kruchego chromosomu X, dystrofię miotoniczną. Mutacje te związane są

z tzw. niestabilnymi sekwencjami DNA, należącymi do powtarzających się

sekwencji mikrosatelitarnych i polegają na tym, iż z pokolenia na pokolenie

zwiększa się (znacznie rzadziej zmniejsza) liczba powtórzeń tych sekwencji.

Im większy stopień zwielokrotnienia danej sekwencji, tym wcześniej

rejestrowany jest początek objawów chorobowych. Na przykład choroba

Huntingtona jest wynikiem zwielokrotnienia liczby powtórzeń sekwencji

CAG w eksonie l genu kodującego białko huntingtynę, zlokalizowanego

w chromosomie 4. U ludzi zdrowych liczba powtórzeń wynosi 10-36,

przekroczenie liczby 36 powtórzeń powoduje wystąpienie choroby. Z zabu-

rzeniami tymi wiąże się zjawisko zwane antycypacją. W przypadku choroby

Huntingtona (HD) i dystrofii miotonicznej młodociana postać choroby jest

związana z dziedziczeniem ojcowskim (antycypacja odojcowska). Inną

117

cechą charakterystyczną mutacji dynamicznej w genie HD jest tzw. piętno

gametyczne. Jeśli allel zmutowany pochodzi od matki, różnica w liczbie

powtórzeń u potomka w stosunku do liczby powtórzeń u matki może

wynieść do 4. Natomiast jeśli ojciec przekazuje zmutowany allel, różnica

w długości sekwencji może dochodzić do 50%. Przypuszcza się, iż jest to

spowodowane niestabilnością tej sekwencji w spermatogenezie. Zjawisko to

jest charakterystyczne także dla innych zaburzeń wywołanych mutacjami

dynamicznymi.

5.4.2. Skutki mutacji genowych

Mutacje genowe nie zawsze powodują zmiany w składzie aminokwasowym

polipeptydu. Taka sytuacja jest możliwa, gdyż spośród 20 aminokwasów aż 18

jest kodowanych przez 2 do 6 trójek nukleotydowych (kodonów, trypletów).

Jedynie metionina (AUG) i tryptofan (UGG) są kodowane przez pojedyncze

kodony. Na przykład tranzycja U

→C powoduje zmiany aminokwasu w

łańcuchu polipeptydowym, gdyż kodon AAC również koduje asparaginę.

Należy podkreślić, iż mutacje genowe powodujące zauważalny efekt

fenotypowy stanowią jedynie małą część mutacji zachodzących w DNA.

Przeważająca część mutacji genowych nie powoduje żadnych zmian

w produkcie genowym, dlatego nazywane są cichymi podstawieniami (ang.

substitution at silent site). Są one wykorzystywane w analizie polimorfizmu

DNA, identyfikacji markerów genetycznych przydatnych w programach

mapowania genomów.

Jednym ze skutków mutacji genowych, polegających na pojedynczej

zmianie sekwencji nukleotydów w określonym genie, mającym szczególne

znaczenie dla molekularnej analizy DNA, jest polimorfizm fragmentów

restrykcyjnych — RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism).

Polimorfizm ten jest wynikiem mutacji punktowych zarówno w obrębie

eksonu, jak i intronu. Mutacje w obrębie intronu nie wpływają zazwyczaj na

funkcję genu, ani kodowanego przez ten gen białka. Również mutacja

w obrębie eksonu może nie powodować zmiany produktu genowego.

Natomiast jej skutkiem może być powstanie miejsca rozpoznawanego

przez enzym restrykcyjny lub utrata miejsca restrykcyjnego dla danego

enzymu. Dzięki temu RFLP określonych loci może być wykorzystywany

jako marker genetyczny.

Technika RFLP opisana w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji geno-

mu znajduje również zastosowanie w ustalaniu genotypów pod względem

zmutowanych alleli genów głównych (QTL) kontrolujących cechy jakościowe

(np. białka mleka) czy odpowiedzialnych za powstanie choroby genetycznej.

Analizując skutki mutacji genowych na poziomie polipeptydu można

wyróżnić następujące typy mutacji:

118

1. Mutacje typu zmiany sensu - - na skutek tranzycji lub transwersji

kodon dla jakiegoś aminokwasu zostaje zamieniony na kodon dla innego

aminokwasu.

Na przykład, jeśli kodon GAU dla kwasu asparaginowego w wyniku

tranzycji A

→G zostanie zmieniony na kodon GGU kodujący glicynę, skutki

tego mogą być dla organizmu letalne. Konsekwencją takiej mutacji w 383

nukleotydzie genu kodującego podjednostkę CD18 p

-integryny jest choroba

BLAD (ang. bovine leukocyte adhesion deficiency), przejawiająca się

zmniejszeniem odporności cieląt, której następstwem jest śmierć przed

ukończeniem 1. roku życia osobników homozygotycznych pod względem

zmutowanego genu. Szerzej mutacja ta i inne tego typu zostaną omówione

w części dotyczącej molekularnej diagnostyki chorób.

Jak już wcześniej wspomniano, mutacje genowe nie zawsze mają

niekorzystny skutek. Wynikiem mutacji typu zmiany sensu są niektóre geny

warunkujące umaszczenie czy polimorficzne białka. Przykładem allelu

powstałego w drodze tego rodzaju mutacji jest allel E

w locus E (Extension)

u bydła, warunkujący czarne umaszczenie. Mutacja ta jest przedstawiona

na rycinie 5-10. Allel dominujący E

jest wynikiem tranzycji tyminy

w cytozynę w kodonie 99 allelu dzikiego E

, która w łańcuchu peptydowym

powoduje zamianę aminokwasu leucyny na prolinę.

Innym przykładem mutacji typu zmiany sensu, odnoszącym się do

polimorficznych białek, jest locus

β-laktoglobuliny (białko mleka). Różnica

między allelem A i B

β-laktoglobuliny polega na zamianie A-»G, w wyniku

której w pozycji 64 łańcucha polipeptydowego typu A zamiast glicyny jest

kwas asparaginowy, oraz T

→C (zapis dla DNA; w mRNA: U→ęcej

informacji o genetycznym uwarunkowaniu i znaczeniu polimorficznych

białek surowicy krwi, mleka, nasienia i jaj zawiera rozdział: Markery

genetyczne.

2. Mutacje typu nonsens (mutacja stop) - na skutek tranzycji lub

transwersji kodon dla jakiegoś aminokwasu (kodon sensowny) zostaje

zamieniony na jeden z trzech kodonów nonsensownych (terminacyjnych) -

Ryć. 5-10. Mutacje typu zmiany sensu i zmiany fazy odczytu w locus E u bydła

119

amber (UAG), ochrę (UAA) lub opal (UGA), które nie kodują aminokwasów,

lecz stanowią sygnał zakończenia translacji. Wynikiem tej mutacji jest

zmiana długości polipeptydu kodowanego przez dany gen; powstaje krótszy

N-końcowy fragment tego polipeptydu.

Przykładem następstwa mutacji typu nonsens jest recesywna wada

metaboliczna - cytrulinemia, występująca u bydła rasy holsztyńsko-fry-

zyjskiej. Tranzycja cytozyny na tyminę w 86 kodonie genu syntetazy

argininobursztynianowej (enzym biorący udział w cyklu mocznikowym)

powoduje zamianę kodonu CGA dla argininy na kodon TGA kończący

translację. W jej konsekwencji, zamiast aktywnego enzymu składającego się

z 412 aminokwasów, powstaje nieaktywny peptyd złożony z 85 amino-

kwasów. Cielęta homozygotyczne pod względem tego zmutowanego genu

padają w pierwszym tygodniu życia na skutek zaburzeń w wydalaniu

mocznika z organizmu. Cytrulinemia występuje również u ludzi, przy czym

dotychczas stwierdzono 20 mutacji w genie kodującym syntetazę arginino-

bursztynianową.

Podobna mutacja polegająca na zamianie cytozyny na tyminę w 405

kodonie genu syntazy urydynomonofosforanowej, czego następstwem jest

zamiana kodonu CGA (dla argininy) na kodon TGA kończący translację

białka, występuje u bydła. Następstwem tego jest skrócenie łańcucha

polipeptydowego (utrata większości C-końcowych 76 aminokwasów) i utrata

przez enzym funkcji katalitycznych. Jest to schorzenie nazwane DUMPS

(ang. deficiency uridine monophosphate synthase). Jest ono przyczyną

zamierania zarodków, a w konsekwencji zmniejszenia płodności krów.

3. Mutacje zmiany fazy odczytu — na skutek delecji lub insercji jednej

lub kilku par nukleotydów (liczba par nie może być podzielna przez 3)

następuje przesunięcie fazy odczytu, a powstający polipeptyd ma od

miejsca mutacji do końca C nieprawidłowo włączone aminokwasy. Mutacje

te wynikają z cechy bezprzecinkowości kodu genetycznego.

Podobnie jak mutacje typu zmiany sensu, również i ten rodzaj mutacji

może mieć skutki obojętne dla organizmu. We wspomnianym już locus

E u bydła allel recesywny e, kodujący u zwierząt homozygotycznych ee

umaszczenie czerwone, powstał w drodze mutacji typu zmiany fazy odczytu

spowodowanej delecją jednej zasady. Począwszy od kodonu 104 (GGT) dla

glicyny, w którym delecją guaniny (oznaczona na schemacie symbolem

∇)

powoduje przesunięcie fazy odczytu, w procesie translacji przyłączane są

inne aminokwasy. Schemat tej mutacji przedstawiono na rycinie 5-10.

Bydło holsztyńskie ma umaszczenie z reguły czarno-białe, ale są także

zwierzęta czerwono-białe pojawiające się w wyniku kojarzenia czarno-białych

nosicieli recesywnego allelu czerwonego umaszczenia. Opracowano test

molekularny identyfikacji nosicielstwa genu czerwonego umaszczenia,

wykorzystujący to, iż recesywny allel nie ma miejsca restrykcyjnego dla

enzymu Mspl, natomiast allel dominujący ma takie miejsce. Zamplifikowany

za pomocą PCR fragment genu jest trawiony enzymem, następnie roz-

120

dzielany elektrofor etycznie. Uzyskany ełektroforegram (obraz prążków) -

wkazuje obecność jednego prążka długości 531 pz w przypadku allelu

recesywnego, dwóch prążków (201 pz i 331 pz) w przypadku allelu

dominującego.

4. Mutacje typu delecja lub insercja aminokwasu — delecja lub

insercja trzech par nukleotydów stanowiących kodon dla aminokwasu

(lub wielokrotności liczby 3) w łańcuchu DNA powoduje najczęściej

utratę lub dodanie jednego bądź kilku aminokwasów w białku kodowanym

przez dany gen. W przypadku delecji trójki nukleotydów może nastąpić:

utrata dwóch aminokwasów w łańcuchu peptydowym, a na ich miejsce

pojawi się inny aminokwas (jeśli „wypadną" zasady z dwóch kolejnych

kodonów); utrata jednego aminokwasu (delecja kodonu) lub powstanie

kodonu „stop". Insercja trójki może spowodować: dodanie aminokwasu –

w białku, jeśli trójka nukleotydów zostanie wstawiona między kodony;

zamianę fazy odczytu, jeśli trójka „rozerwie" istniejący dotychczas kodon;

możliwe jest także pojawienie się kodonu „stop". Mutacje te mogą

prowadzić do poważnych zaburzeń, a nawet śmiertelnych chorób gene-

tycznych.

Przykładem mutacji typu delecja aminokwasu jest mukowiscydoza

u ludzi, polegająca na zakłóceniu transportu jonów chlorkowych. U chorych

na mukowiscydozę przewody wyprowadzające z narządów wewnętrznych

zostają zaczopowane przez bardzo gęstą wydzielinę. Dotyczy to przede

wszystkim trzustki, płuc i oskrzeli. Częstość występowania tej wady,

prowadzącej do przedwczesnej śmierci, wynosi l: 2500 osób. Prawidłowy

gen warunkuje syntezę białka będącego regulatorem przewodnictwa błono-

wego, zwanego CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator), pełniącego funkcję kanału chlorkowego. W obrębie tego genu

wykryto wiele mutacji, przy czym najczęściej jest stwierdzana mutacja

w eksonie 10, oznaczona symbolem

F508 (ryć. 5-11). Mutacja ta prowadzi

121

do utraty jednego aminokwasu — fenyloalaniny w 508 pozycji kodowanego

przez ten gen łańcucha polipeptydowego. Podczas procesu translacji zamiast

kodonu ATC dla izoleucyny (w 507 pozycji łańcucha polipeptydowego)

i następujących po nim kodonów TTT i GGT (fenyloalanina — 508 póz.

i glicyna — 509 póz. łańcucha) odczytywany jest kodon ATT (inny tryplet

dla izoleucyny), a następnie sekwencja GGT dla glicyny.

Przykładem mutacji typu insercja aminokwasu jest wspomniana już

wcześniej choroba Huntingtona u ludzi. Zwielokrotnienie powtarzającej się

sekwencji CAG, kodującej aminokwas glutaminę, powoduje powstanie

domeny glutaminowej, złożonej z takiej liczby glutamin, jaka jest zakodo-

wana w sekwencji (CAG)

5. Mutacje zachodzące podczas obróbki potranskrypcyjnej, zwanej

składaniem (ang. splicing) pre-mRNA --w wyniku zaburzeń w procesie

wycinania intronów powstaje nieprawidłowy mRNA, czego konsekwencją

jest synteza zmienionego białka. Białko takie może mieć inne właściwości

katalityczne niż białko prawidłowe, na przykład białko determinowane

przez locus Albino (C). Gen C warunkuje wytwarzanie enzymu tyrozynazy.

W następstwie nieprawidłowej obróbki potranskrypcyjnej mRNA powstają

allele zmutowane. Częstość tych mutacji wynosi 10-40%. Również niektóre

allele genu determinującego warianty białka mleka

-kazeiny u kóz

powstały w wyniku zaburzeń w procesie obróbki pre-mRNA, o czym pisano

już wcześniej. W przypadku allelu D podczas wycinania intronów został

dodatkowo wycięty ekson kodujący 11 aminokwasów, natomiast w allelu

F - 3 eksony kodujące 37 aminokwasów.

Fenotypowy efekt mutacji genowych może być zauważalny wkrótce

po urodzeniu osobnika, na przykład wielopalczastość, skrócenie krę-

gosłupa u bydła i psów, oklapnięte uszy u kotów szkockich zwisłouchych

czy skrócenie ogona u kotów bobtail (ryć. 5-12 wkładka kolorowa),

a także umaszczenie zwierząt i inne, ale może być również rozpo-

znawalny w okresie późniejszym, na przykład w pierwszym tygodniu

życia (cytrulinemia) lub pierwszym roku życia (BLAD). W wyniku więk-

szości mutacji genowych następuje utrata lub modyfikacja zdolności

organizmu do wytworzenia specyficznego białka, najczęściej enzymu

koniecznego do prawidłowego przebiegu jakiegoś procesu. Często są

to zaburzenia przebiegu szlaku metabolicznego (tzw. blok metaboliczny),

w którym produkt jednej przemiany enzymatycznej stanowi substrat

dla następnej przemiany. Jednym z najlepiej poznanych bloków me-

tabolicznych u ludzi są nieprawidłowości w przemianie aminokwasów

fenyloalaniny i tyrozyny (ryć. 5-13). Mutacje jednego z genów wa-

runkujących określony enzym tego bloku powodują następujące scho-

rzenia:

A. Fenyloketonuria — brak lub niedobór enzymu hydroksylazy fenylo-

alaninowej, przekształcającego fenyloalaninę w tyrozynę; powoduje uszko-

dzenie układu nerwowego oraz niedorozwój umysłowy i fizyczny;

122

B. Kretynizm tarczycowy — brak enzymu katalizującego przemianę

tyrozyny w hormon tarczycy (tyroksynę i trijodotyroninę), powodujący

różny stopień nasilenia niedorozwoju umysłowego;

C. Tyrozynoza -- niedobór enzymu hydroksylazy kwasu p-hydroksy-

fenylopirogronowego, biorącego udział w przemianie tego kwasu w kwas

homogentyzynowy, nie powodujący wyraźnie złych skutków dla organizmu;

D. Alkaptonuria -- brak oksydazy kwasu homogentyzynowego, prze

kształcającego ten kwas w kwas maleiloacetooctowy; kwas homogen

tyzynowy jest odkładany w stawach, chrząstkach i skórze wywołując stany

zapalne, a jego nadmiar jest wydalany z moczem, powodując jego ciemnienie

na powietrzu;

E. Albinizm, czyli bielactwo - - brak enzymu tyrozynazy, przekształ

cającego 3,4-dihydroksyfenyloalaninę (DOPA) w barwnik skóry — melaninę;

osobniki albinotyczne mają bardzo jasną skórę, białe włosy, brwi i rzęsy,

tęczówka oka nie jest zabarwiona, a przeświecające przez nią naczynia

krwionośne nadają jej różowe zabarwienie. Albinizm występuje także

u zwierząt.

Bloki metaboliczne mogą dotyczyć również enzymów związanych

z przemianami innych związków, np. cukrów czy lipidów.

5.4.3. Mutacje genowe wpływające na cechy

produkcyjne zwierząt

Mutacje genowe mogą mieć znaczący wpływ na efektywność hodowli

zwierząt. Jednym z genów, którego polimorficzne formy wykazują związek

z różnymi cechami użytkowymi zwierząt gospodarskich, jest gen hormonu

wzrostu — somatotropiny (ang. growth hormone — GH).

123

Inne mutacje genowe nie mają tak wszechstronnych skutków jak

mutacje w genie hormonu wzrostu. Wykryte dotychczas mutacje u świń

wpływające na jakość mięsa dotyczą: receptora rianodyny (RYR1) —

mutacja powodująca gorączkę złośliwą oraz locus PRKAG3 — mutacja

powodująca tzw. kwaśne mięso (RN).

U bydła i owiec wykryto mutacje powodujące hipertrofię mięśniową.

U bydła cecha ta warunkowana jest zmutowanym allelem genu miostatyny

(locus w chromosomie 2). U owiec natomiast hipertrofia mięśniowa (CLPG)

jest determinowana mutacją locus kodującego ncRNA.

Opłacalność hodowli zwierząt w dużej mierze zależy od cech reproduk-

cyjnych. U trzody chlewnej stwierdzono związek między polimorfizmem

genu receptora estrogenu (ang. estrogen receptor gene — ESR) a wielkością

miotu. Poszczególne allele tego genu warunkują wzrost liczebności miotu

o 1,15 prosięcia u świń bardzo plennej rasy meishan i 0,42 prosięcia

u wielkiej białej.

Spośród wykrytych dotychczas mutacji, wpływających na liczbę jagniąt

rodzonych przez owcę w jednym miocie, największe znaczenie ma mutacja

w genie BMPR-IB wykryta u owiec rasy merynos booroola. W pojedynczej

kopii allel zmutowany zwiększa liczebność miotu o l jagnię. Inne mutacje

to: gen FecJ u owiec jawajskich, gen Thoka u owiec islandzkich i gen Belle-Ile

u owiec utrzymywanych w północnej Francji. Pojedyncza kopia każdego

z tych genów powoduje wzrost liczebności miotu o około 0,6 jagnięcia.

Podobny efekt fenotypowy ma gen FecX' sprzężony z płcią, wykryty

u owiec rasy romney.

Szerzej mutacje te są opisane w rozdziale: Zmienność cech (podrozdział:

Geny o dużym efekcie).

5.4.4. Mutacje genowe wywołujące choroby genetyczne

Mutacje genowe często prowadzą do powstania chorób genetycznych, które

mogą się przejawiać zaburzeniami rozwojowymi o charakterze morfologicz-

nym lub upośledzeniem różnych funkcji organizmu, np. metabolicznych,

odpornościowych, endokrynologicznych, psychicznych itp. Należy jednak

pamiętać, że rozwój niektórych chorób genetycznych zależy również od

wpływu czynników środowiskowych. Stąd poznanie podłoża wielu chorób

genetycznych, a szczególnie wrodzonych wad rozwojowych, sprawia dużo

trudności. O podłożu molekularnym niektórych chorób metabolicznych

wspomniano już w podrozdziale: Skutki mutacji genowych.

5.4.4.1. Geny letalne, semiletalne i subwitalne

Wpływ szkodliwego działania zmutowanych genów jest różny. Zależnie od

stopnia penetracji tych genów można je podzielić na:

124

• geny letalne, powodujące śmierć ponad 90% osobników, w których

genotypach wystąpią w dawce aktywnej (np. homozygota recesywna),

• geny semiletalne, powodujące w aktywnej dawce śmierć od 50 do

90% osobników,

• geny subwitalne, które osłabiają wydolność fizjologiczną i mogą

powodować śmierć od 10 do 50% osobników.

Geny letalne warunkują nieprawidłowości rozwojowe i zakłócenia

w procesach fizjologicznych. Niektóre z nich, z nie wyjaśnionych dotąd

przyczyn, powodują śmierć osobnika, w którego genotypie wystąpią.

Również okres w życiu osobnika, w którym dany gen przejawia działanie

letalne, może być różny. Jedne geny letalne powodują śmierć zygoty we

wczesnym stadium życia embrionalnego, inne zaś później, w okresie

pourodzeniowym lub u dorosłych osobników.

Geny letalne dominujące ujawniają swoje działanie niekorzystne już

w układzie heterozygotycznym; powodując śmierć nie tylko homo-, ale

także i heterozygotycznych osobników same się eliminują i mutacja taka nie

utrwala się w populacji.

Geny letalne o niezupełnej dominacji sygnalizują swoją obecność

w pojedynczej dawce, nie ograniczając na ogół przeżywalności czy spraw-

ności życiowej. Geny te działają letalnie w układzie homozygotycznym,

natomiast u osobników heterozygotycznych nie są letalne, ale dają zauważal-

ny efekt fenotypowy. Przykładem jest gen platynowego ubarwienia u lisów,

gen siwej barwy (sziras) wełny u owiec rasy karakuł czy gen achondroplazji

u bydła i kur.

Gen platynowej barwy u lisów (W

) jest wynikiem mutacji genu

w, warunkującego srebrzystą barwę włosa. Innym genem, będącym również

wynikiem mutacji genu

, jest gen W, warunkujący umaszczenie tzw.

białopyskie. Oba zmutowane geny w układzie homozygotycznym (W

WW) działają letalnie, również heterozygoty W

W nie są zdolne do

życia i giną przed urodzeniem. Kojarzenie między sobą lisów

platynowych bądź białopyskich powoduje zmniejszenie plenności wskutek

zamierania zarodków homozygotycznych. Z punktu widzenia

ekonomicznego korzystniejsze są kojarzenia heterozygotycznego osobnika

platynowego z homozygota pod względem genu srebrzystego ubarwienia,

uzyskamy wówczas lisy zdolne do życia, w stosunku l platynowy: l

srebrzysty (ryć. 5-14 wkładka kolorowa).

Gen siwej barwy karakułów powoduje śmierć osobników homozygotycz-

nych w wieku 4-9 miesięcy wskutek zaburzeń w funkcjonowaniu przy-

współczulnego układu nerwowego, powodujących poważne zakłócenia

procesu trawienia.

Gen achondroplazji stwierdzony po raz pierwszy u bydła irlandzkiej

rasy kerry, który jest letalny w podwójnej dawce, w układzie hetero-

zygotycznym zaznacza swą obecność skróceniem odnóży (krótkonogie

bydło nazwane dexter). U kur gen achondroplazji (Cp) w układzie hetero-

125

zygotycznym (Cpcp) warunkuje krótkonożność. Zarodki o genotypie CpCp

zamierają w okresie od 3 do 4 dnia inkubacji.

Przykładem genu letalnego o niezupełnej dominacji sprzężonego z płcią

jest gen oznaczony symbolem A31, warunkujący pasmowy brak owłosienia

u bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej. Zmienność tej cechy u krów jest duża.

U krów heterozygotycznych nieowłosione pasma są ledwie dostrzegalne,

natomiast u homozygotycznych — bardzo wyraźne. Krowy takie są wrażliwe

na zimno i źle znoszą czyszczenie. Cecha ta występuje tylko u samic.

U samców gen ten jest letalny. Z kojarzenia krowy homozygotycznej pod

względem tego genu z buhajem normalnym w potomstwie uzyskuje się

jedynie samice. Kojarzenie to przedstawia schemat:

W przypadku gdy matka jest heterozygotą, w potomstwie występuje

stosunek samców do samic l: 2, co obrazuje schemat:

Większość genów letalnych ma charakter recesywny autosomalny.

Nosiciele tych genów (heterozygoty) fenotypowo niczym się nie różnią od

osobników normalnych. Zakres działania tych genów jest różny, od

niewielkich zmian (np. miejscowy brak nabłonka u bydła ayrshire) do

rozległych zaburzeń, jak achondroplazja recesywna. Stopień fenotypowego

przejawienia się genu letalnego zależy zarówno od współdziałania danego

genu z innymi genami, jak też od interakcji ze środowiskiem.

Niektóre geny letalne mogą także powodować śmierć matki. Przykurcz

mięśni kończyn i szyi (cecha recesywna) płodów owiec, bydła i świń

powoduje częste padanie matek na skutek utrudnionych porodów.

Geny semiletalne często jest trudno odróżnić od genów letalnych, gdyż

ich działanie zależy między innymi od czynników środowiskowych. Te

same geny mogą być letalne dla swych nosicieli przebywających w złych

warunkach środowiskowych, nieszkodliwe zaś dla osobników znajdujących

się w dobrych warunkach. Wrodzona katarakta u bydła lub brak gałek

ocznych oraz wiele innych podobnych nieprawidłowości powodują, iż

zwierzęta obarczone nimi mogą żyć tylko w szczególnych warunkach

środowiskowych i pod troskliwą opieką hodowców.

Ponadto niektóre z tych genów mogą być letalne w stosunku do

jednych zwierząt, natomiast u innych mogą tylko zmniejszać sprawność

fizjologiczną.

126

Geny subwitalne powodują odchylenia od normy w budowie anatomicz-

nej i procesach fizjologicznych, a jednocześnie zmniejszają odporność

zwierząt na choroby i niekorzystne czynniki środowiskowe. Niektóre z tych

genów są przyczyną zaburzeń metabolicznych, powodując tzw. bloki

metaboliczne. Przykład takiego bloku podano już wcześniej.

Wiele wad determinowanych genami subwitalnymi dotyczy układu

rozrodczego, powodując niepłodność czy utrudniając akt kopulacji. Na

przykład buhaje dotknięte spastycznym niedowładem kończyn (wada ta ma

dwie postacie — występuje do 8 tygodnia życia lub dopiero w wieku 2-3

lat) niechętnie kryją i są eliminowane z rozpłodu.

Ponieważ większość wad dziedzicznych jest uwarunkowana genami

letalnymi, następny podrozdział dotyczy wad wrodzonych, ich rodzajów,

sposobów dziedziczenia i ograniczania występowania tych wad w hodowli

zwierząt gospodarskich.

5.4.4.2. Choroby monogenowe wywołujące

wrodzone wady rozwojowe

Wrodzonymi wadami rozwojowymi nazywamy wszelkie nieprawidłowości

budowy ciała, powstające w okresie płodowym. Niektóre z wad są zauważal-

ne już w chwili przyjścia na świat osobnika, inne ujawniają się w później-

szym okresie życia (np. epilepsja u bydła).

Teratologia, nauka zajmująca się zaburzeniami rozwojowymi, wyodrębnia

trzy grupy tych zaburzeń:

1) potworności — są to bardzo rozległe zmiany w wyglądzie ciała,

obarczone nimi zwierzęta nazywane są potworkami,

2) wady — są to pewne zaburzenia w prawidłowej budowie,

3) braki (defekty czy usterki) — są to drobne zmiany nie mające

większego znaczenia dla życia zwierzęcia.

Przyczyny powstawania wad wrodzonych mogą być dwojakiego rodzaju:

1) genetyczne — będące wynikiem mutacji genowych, chromosomowych

lub genomowych,

2) środowiskowe — powstałe na skutek działania niekorzystnych czyn

ników środowiskowych na rozwijający się płód, wady te nie dziedziczą się.

Nie każda wada wrodzona jest zatem uwarunkowana genetycznie.

W niektórych przypadkach na powstanie takiej nieprawidłowości mają

wpływ równocześnie czynniki środowiskowe i genetyczne. Większość wad

wrodzonych dziedzicznych ma określony obraz fenotypowy. Zdarza się

jednak, że niektóre anomalie, mimo że są pochodzenia pozagenetycznego,

do złudzenia przypominają nieprawidłowości uwarunkowane założeniami

genetycznymi. Wady takie, przypominające mutanty, a powstałe pod

wpływem czynników środowiskowych, noszą nazwę fenokopii. W przypad-

ku prowadzenia kontroli wrodzonych wad dziedzicznych i ograniczania ich

występowania istotnym problemem jest odróżnienie fenokopii od wady

mającej podłoże genetyczne. Można to uczynić biorąc pod uwagę:

127

1) zgodność wyglądu danej anomalii z opisem genetycznie uwarun

kowanych wad wrodzonych w danej rasie,

2) wystąpienie wady u noworodka pochodzącego z kojarzeń krew-

niaczych zarówno bliskich, jak i dalszych,

3) ujawnienie się tej samej wady u potomstwa jednego rozpłodnika,

4) pojawienie się podobnej anomalii u zwierząt spokrewnionych z ro

dzicami noworodka.

OPIS NIEKTÓRYCH WRODZONYCH WAD ROZWOJOWYCH

Wady układu kostnego

Jednym z najwcześniej poznanych zaburzeń rozwojowych była achondro-

plazja, czyli zahamowanie rozwoju układu kostnego. Nieprawidłowość ta

występuje głównie u bydła (po raz pierwszy została opisana w Irlandii, dała

początek nowej rasie bydła — dexter). Badania genetyczne wykazały, że płody

dotknięte tą wadą, homozygotyczne pod względem genu niezupełnie

dominującego, ulegają poronieniu zwykle przed ósmym miesiącem (ryć. 5-15

wkładka kolorowa). W 2002 roku w Australii wykryto odpowiedzialną za tę

wadę mutację, polegającą na insercji 4 nukleotydów w genie, którego

lokalizacja nie została ujawniona (zapewne test molekularny zostanie opatento-

wany). Mutacja ta powoduje powstanie kodonu terminacyjnego, skutkiem

czego krótszy jest o 1/3 łańcuch polipetydowy, kodowany przez ten gen.

Achondroplazja może być także uwarunkowana genem recesywnym i w takim

przypadku objawia się głównie zaburzeniami w rozwoju kości głowy lub

deformacją szkieletu i kończyn. Nosicielstwo allelu achondroplazji, oznaczone-

go symbolem bd (ang. bulldog disease), stwierdzono u francuskiego buhaja rasy

holsztyńsko-fryzyjskiej, charakteryzującego się wybitną wartością hodowlaną.

Poszczególne wady wrodzone często występują w połączeniu z innymi

nieprawidłowościami. Do anomalii towarzyszących tego rodzaju zaburzeniom

rozwojowym należą: skrócenie części twarzowej głowy, skrócenie lub brak

żuchwy, przepuklina mózgowa i pępkowa oraz rozszczepienie podniebienia.

U drobiu achondroplazja jest warunkowana genem niezupełnie domi-

nującym Cp (ang. creeper — pełzacz). Gen ten jest letalny u większości

homozygot między 3 a 4 dniem inkubacji. Osobniki heterozygotyczne

charakteryzują się skróconymi odnóżami.

Do mutacji wpływających na cały kościec należy karłowatość. U bydła

wada ta występuje u ras mięsnych (np. u herefordów). Jest to prosta cecha

recesywna. Gen karłowatości u osobnika heterozygotycznego, powodując

tylko nieznaczne skrócenie kończyn, wpływa pośrednio na zwięzłość

budowy. U japońskiego bydła mięsnego, u którego występuje recesywna

karłowatość chondrodysplastyczna (ang. chondrodysplastic dwarfism), ce-

chująca się skróceniem kończyn, japońscy badacze wykryli dwie mutacje

(substytucja zasad i delecja) w genie zlokalizowanym w chromosomie

6 i oznaczonym symbolem LBN (LIMBLIN).

128

Zaburzeniem, które występuje u większości ras bydła, a także u owiec,

świń, a nawet ludzi jest tzw. amputacja kończyn (akroteriaza) (ryć. 5-16

wkładka kolorowa). Anomalia ta uwarunkowana jest genem recesywnym.

U osobnika dotkniętego tą wadą odnóża kończą się blisko stawu łokciowego,

pęcinowego lub kolanowego. Wadzie tej często towarzyszą: skrócenie

żuchwy, rozdwojenie podniebienia i brak większości zębów.

U owiec niektórych ras mięsnych (suffolk, hampshire) w Stanach

Zjednoczonych w latach 80. pojawiła się wada budowy kośćca określana

mianem zespołu pajęczego (ang. spider syndrome). Jest ona wynikiem

mutacji (transwersja adeniny na tyminę, której następstwem jest zmiana

aminokwasu waliny na kwas glutaminowy w pozycji 700 łańcucha polipepty-

dowego) w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast
growth factor receptor 3 -- FGFR3). W układzie homozygotycznym allel

zmutowany powoduje kątową deformację kończyn, deformację grzbietu,

żeber i mostka oraz części pyskowej (garbaty nos). Natomiast osobniki

heterozygotyczne charakteryzuje delikatna budowa kośćca z wyraźnym

wydłużeniem kości długich. Śmiertelność wśród jagniąt dotkniętych ze-

społem pajęczym jest bardzo wysoka, a u tych, które przeżyły, stwierdza się

osłabione zdolności rozrodcze, a nawet niepłodność.

Anomalią układu kostnego, która zależnie od gatunku, a nawet płci

wykazuje różny stopień letalności, jest autosomalna recesywna cecha -

skrócenie kręgosłupa. Jest ona letalna u bydła i indyków. U bydła mlecznego

formą tej wady jest wrodzone zniekształcenie kręgów — CVM (ang. central
vertebral malformation). U psów skrócenie kręgosłupa nie jest letalne dla

suk, rozmnażają się one prawidłowo. Ze względu na zmieniony sposób

siedzenia suki te nazwane są „pawianowatymi". Natomiast samce praw-

dopodobnie nie osiągają dojrzałości. Możliwe więc, że jest to cecha letalna

dla jednej płci. Szczenięta obarczone tą wadą cechuje mniejsza żywotność,

bezpośrednio po urodzeniu można je rozpoznać po skróconym ogonie.

Do wrodzonych wad w budowie kończyn należą: zesztywnienie stawów

i wielopalczastość. Ogólne zesztywnienie stawów notowane jest u bydła,

świń i owiec. Genetycznym podłożem tej wady jest autosomalny gen

recesywny. U jagniąt, cieląt i prosiąt sztywność stawów przy urodzeniu jest

połączona z dziedzicznym przykurczem mięśni.

Do najczęściej spotykanych anomalii w budowie głowy zalicza się

przepuklinę mózgową uwarunkowaną recesywnym genem letalnym. Wada

ta, obserwowana głównie u bydła, polega na niezrośnięciu się kości czaszki,

któremu towarzyszy twór różnych rozmiarów wypełniony przeważnie

płynem. Anomalia ta często występuje w połączeniu z zespołem wad typu

achondroplastycznego.

Prostą autosomalna cechą recesywna u bydła jest skrócenie żuchwy.

Wada ta jest oddzielną jednostką w odróżnieniu od podobnej anomalii

występującej w przypadku tzw. amputacji kończyn. Może ona natomiast

towarzyszyć: wodogłowiu, przepuklinie mózgowej, brakowi gałek ocznych

129

lub zesztywnieniu stawów. U owiec obserwowana jest również cecha

recesywna — brak żuchwy. W pewnym sensie odpowiednikiem skrócenia

żuchwy u bydła jest typ dziobu „kaczor Donald" u kurcząt. Anomalia ta

polega na skróceniu dolnej części dzioba. Wyniki badań wskazują, że wada

ta ma charakter semiletalny i jest rezultatem działania autosomalnego

recesywnego genu oznaczonego symbolem dek (ang. duck).

Wady układu powłokowego

Wady układu powłokowego odnoszą się nie tylko do skóry, ale i takich jej

wytworów, jak włosy i pióra. Jedną z najpoważniejszych letalnych wad

dziedzicznych skóry jest rybia łuska u bydła. Nienormalność ta jest prostą

cechą recesywna, która powstaje w wyniku wytwarzania nadmiernej ilości

keratyny i w następstwie — nieprawidłowego rogowacenia nabłonka. Skóra

nowo narodzonego cielęcia składa się jakby z rogowych płytek przypomina-

jących duże łuski. Płytki te są porozdzielane rowkami, w których rosną włosy.

Normalna skóra i włosy pokrywają jedynie okolice nadgarstka i stepu.

Opisana wada układu powłokowego (rybia łuska) występuje także u ludzi.

Zaburzeniem wykazującym dużą zmienność u różnych ras bydła jest

cecha recesywna określana jako miejscowy brak nabłonka. Miejsca nie

pokryte nabłonkiem najczęściej występują na kończynach powyżej pęcin

i na głowie za śluzawicą. Schorzenie to przybiera najostrzejszą formę,

prowadzącą do śmierci płodów lub noworodków, u bydła rasy Jersey,

natomiast najłagodniejszą, u bydła ayrshire. Jednakże i u cieląt rasy ayrshire

miejsca chore mogą ulegać zakażeniu, a to z kolei może spowodować śmierć

w pierwszych tygodniach życia.

Inną wadą dziedziczną układu powłokowego jest brak owłosienia.

U bydła, królików i kotów anomalia ta jest determinowana recesywnym

genem autosomalnym. U bydła wada ta może występować samodzielnie

lub w połączeniu z innymi nieprawidłowościami wrodzonymi, jak wodo-

głowie, skrócenie szczęki, niedorozwój części twarzowej czaszki lub

cyklopia (dwie gałki oczne w jednym oczodole). Cielęta dotknięte tą wadą

w warunkach naturalnych giną. U psów brak owłosienia uwarunkowany

jest genem dominującym. Na podstawie szczegółowych badań można

sądzić, że wszystkie bezwłose psy (tzw. psy tureckie, chińskie, perskie lub

meksykańskie) są heterozygotami, gdyż gen bezwłosowości w podwójnej

dawce powoduje tak duże nieprawidłowości, że osobniki homozygotyczne

rodzą się martwe.

U drobiu wadą układu powłokowego jest nagość, uwarunkowana

recesywnym genem sprzężonym z płcią, oznaczonym symbolem n (ang.
naked). Prawie połowa piskląt dotkniętych tym zaburzeniem zamiera w ciągu

ostatnich 2-3 dni inkubacji. Ptaki, które przeżyją i będą odchowywane

w temperaturze wyższej niż zwykle, w wieku 4-5 miesięcy pokryją się

rzadkim upierzeniem. Nieśność kur obarczonych tą wadą jest znacznie

zmniejszona.

130

Wady układu pokarmowego

Najczęściej obserwowanymi wadami związanymi z układem pokarmowym
są brak odbytu i niedrożność jelit. Brak odbytu jest recesywną cechą letalną,
powodującą wczesne zejście śmiertelne lub prowadzącą do uboju z koniecz-
ności. Niedrożność jelit zaś, to prosta autosomalna cecha recesywną
występująca zarówno u bydła, jak i u koni. U bydła nienormalność ta
dotyczy jelita biodrowego, u koni natomiast okrężnicy.

Wady układu nerwowego

Wady dziedziczne układu nerwowego stanowią około 16% zaburzeń rozwojo-
wych u bydła. Anomalie układu nerwowego wyrażają się między innymi
bezmózgowiem lub niedorozwojem móżdżku (hipoplazja móżdżku). Obie
nienormalności warunkowane są genem recesywnym. Bezmózgowie występuje
na ogół w połączeniu z rozszczepieniem kręgosłupa i zaburzeniami w rozwoju
narządów wewnętrznych. Niedorozwój móżdżku najlepiej został poznany
u bydła i owiec, u których jest prostą cechą recesywną. Zwierzęta dotknięte tą
wadą rodzą się żywe, ale nie mogą stać. Badania anatomiczne wykazują znaczne
zmniejszenie móżdżku lub patologiczne zmiany w warstwie korowej. Podobna
nieprawidłowość obserwowana u kur jest warunkowana recesywnym genem
sprzężonym z płcią. Schorzenie to nazywane jest drżeniem i ujawnia się
w wieku od 18 do 35 dni. U drobiu występuje również recesywne, sprzężone
z płcią zaburzenie zwane paroksyzmem. Kurczęta w wieku około 2 tygodni lub
starsze reagują na hałas i raptowne oświetlenie biegiem, następnie upadkiem,
usztywnieniem nóg oraz drżeniem ciała. Atak taki trwa około 10 sekund.
Większość z tych kurcząt ginie przed 15 tygodniem życia.

Cechą dziedziczną u wielu gatunków zwierząt jest epilepsja, deter-

minowana u bydła genem dominującym, natomiast u królików — recesyw-
nym. U większości cieląt homozygotycznych pod względem genu warun-
kującego epilepsję objawy pojawiają się w wieku od 3 do 6 miesięcy.

Prostą autosomalna cechą występującą u bydła, świń i drobiu jest

wodogłowie wewnętrzne. Cielęta dotknięte tą wadą rodzą się zazwyczaj
żywe, wykazują powiększenie czaszki, nie potrafią utrzymać się na nogach
i giną w ciągu 2 dni. Z punktu widzenia anatomicznego schorzenie to jest
spowodowane nadmiarem płynu nagromadzonego w komorach mózgowia
lub niekiedy w przestrzeniach między oponą pajęczą i miękką. U świń gen
warunkujący tę wadę wykazuje działanie plejotropowe, wpływa bowiem na
umaszczenie, powodując jego rozjaśnienie. Prosięta z wodogłowiem we-
wnętrznym padają do drugiego dnia życia. U drobiu wodogłowie uwarun-
kowane jest niezupełnie dominującym genem Cr (ang. crest), przy czym
u kur gen ten nie jest letalny (np. rasy houdan i polskie czubatki), podczas
gdy u białych kaczek (crested white) osobniki homozygotyczne giną,
natomiast heterozygoty mają piękny czub, pod którym czaszka jest silnie
wysklepiona wskutek ciśnienia powiększonych półkul mózgowych.

U indyków i kur notowane jest wrodzone zaburzenie równowagi, warun-

131

kowane recesywnym genem letalnym lo (ang. loco). Pisklęta obarczone tą
wadą kłują się dobrze, ale nie mogą jeść, pić i giną w ciągu kilku dni.

Anomalią o dużej częstości występowania, szczególnie u buhajów,

powstającą w wyniku zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego jest
spastyczne porażenie kończyn tylnych. Fenotypowym obrazem tej wady
jest spionizowanie stawu skokowego w wyniku skurczu mięśnia brzuchate-
go. Wada ta czasami ujawnia się dopiero w wieku 10-12 lat.

Zaburzeniem układu nerwowego, związanym z niedorozwojem przodo-

mózgowia, jest paraliż i przykurcz mięśni kończyn i szyi, występujący u bydła,
świń i owiec. Jest to prosta, autosomalna cecha recesywna, której objawy mogą
być dwojakie: paraliż wszystkich kończyn bądź tylko kończyn tylnych.

Wady układu rozrodczego

Dość często występujące, a równocześnie dobrze poznane są anomalie
budowy i czynności układu rozrodczego, takie jak: niedorozwój (hipoplazja)
jąder, nasieniowodów, jajników, macicy, niedrożność jajowodów czy wnęt-
rostwo. U białych jałówek rasy belgijskiej błękitnej i shorthorn bezpłodność
wynika z niedorozwoju pochwy i macicy. Anomalia ta jest prawdopodobnie
wynikiem plejotropowego działania genu białego umaszczenia w połączeniu
z nieznaną liczbą genów z innych loci.

Niepłodność obserwowana jest także u buhajów. Plemniki buhajów

dotkniętych tą nieprawidłowością cechuje znaczne zgrubienie akrosomu,
czyli szczytowej części główki, dlatego nazwano je „gałkowatymi". Ten typ
niepłodności występuje u buhajów homozygotycznych pod względem
recesywnego genu kn (ang. knurl).

Zaburzeniem rozwojowym układu rozrodczego spotykanym najczęściej

u psów, ale także u knurów, ogierów i samców innych ssaków jest
wnętrostwo, czyli niezstąpienie jednego lub obu jąder przez kanał pach-
winowy do moszny. Nienormalność tę można usunąć zabiegiem chirurgicz-
nym. Obustronne wnętry są niepłodne również po takim zabiegu. W przy-
padku jednostronnego wnętrostwa osobnik jest płodny i może przekazywać
tę wadę potomstwu. Dlatego konieczne jest usuwanie z hodowli rozpłod-
ników obarczonych wnętrostwem.

Inne przykłady zaburzeń rozwoju cech płciowych są omówione w roz-

dziale: Determinacja i różnicowanie płci oraz interseksualizm.

5.4.4.3. Choroby monogenowe wywołujące zaburzenia

procesów biochemicznych

Wpływ genów na budowę morfologiczną i anatomiczną zwierząt jest znacznie
łatwiejszy do rozpoznania niż ich oddziaływanie na procesy fizjologiczne.
Podłoże genetyczne zaburzeń natury biochemicznej, jak na przykład brak lub
niedobór pewnych enzymów czy hormonów, jest trudne do identyfikacji.
Trudność tę powiększa to, iż objawy pojawiają się u zwierząt w różnym wieku.

132

Typową nieprawidłowością natury biochemicznej jest porfiria występu-

jąca u bydła i świń. U bydła na skutek zaburzeń metabolicznych powstaje
czerwony barwnik porfiryna, wytwarzany w nadmiernych ilościach i od-
kładany we krwi, kościach, zębach i innych częściach ciała. Schorzenie to
wiąże się z zahamowaniem enzymatycznym tworzenia hemu, składnika
hemoglobiny. Zwierzęta dotknięte porfiria są bardzo wrażliwe na promienie
słoneczne, reagują powstawaniem pęcherzy na skórze, a w skrajnych
przypadkach — wrzodów. Genetycznym podłożem tej wady u bydła jest
gen recesywny. U świń porfiria jest prawdopodobnie warunkowana genem
dominującym i schorzenie to ma inne podłoże niż u bydła, gdyż świnie
obarczone tym defektem nie są uczulone na światło słoneczne.

Uczulenie na promienie słoneczne występuje również u owiec, lecz jest

ono jednak innej natury niż porfiria u bydła. Wątroba jagniąt dotkniętych tą
anomalią nie wydziela fikoerytryny, która jest produktem rozkładu chlorofilu.
Fenotypowym obrazem tej wady jest egzema na pysku i uszach, powodująca
śmierć w dwa do trzech tygodni po pojawieniu się pierwszych objawów. Ta
nieprawidłowość metaboliczna ujawnia się u osobników homozygotycznych.

Schorzeniem notowanym u ludzi i psów, a także owiec, charakteryzującym

się zmniejszoną krzepliwością krwi na skutek braku jednego z czynników
biorących udział w tym procesie jest hemofilia, wywoływana działaniem genu
recesywnego sprzężonego z płcią. Są dwa rodzaje tego schorzenia: hemofilia
A — cechuje się brakiem czynnika VIII (globulina przeciwhemofilowa), który
przyspiesza przemianę protrombiny w trombinę, i hemofilia B, mająca
łagodniejszy przebieg, a dotycząca czynnika IX (czynnik Christmas), niezbędne-
go do wytwarzania tromboplastyny osocza. U szczeniąt chorych na hemofilię
A pierwsze objawy pojawiają się w wieku od 6 tygodni do 3 miesięcy. Często
nawet niewinna zabawa szczeniąt może spowodować śmierć osobnika chorego
na hemofilię. U owiec hemofilia A jest chorobą śmiertelną dla większości
obarczonych nią zwierząt. Locus kontrolujący syntezę czynnika VIII u owiec
znajduje się w długim ramieniu chromosomu X w regionie Xq24-q33.

Omówione wyżej wady są uwarunkowane allelami powstałymi w wyni-

ku mutacji genowych. Również innego rodzaju mutacje — aberracje chromo-
somowe mogą być przyczyną wad bądź zmniejszenia wartości cech użytko-
wych. Zagadnienie to jest omówione w podrozdziale: Mutacje chromosomo-
we oraz rozdziale: Determinacja i różnicowanie płci oraz interseksualizm.

Oprócz ogromnej liczby wrodzonych wad dziedzicznych, których pod-

łoże genetyczne jest dobrze poznane, istnieje wiele anomalii, które są
niewątpliwie dziedziczne, ale mechanizm ich dziedziczenia nie jest jeszcze
wyjaśniony. Należą do nich przypadki wielokończynowości, zroślaki (zroś-
nięte dwa płody), wynicowce (niezrośnięcie powłok brzusznych lub klatki
piersiowej, a w konsekwencji tego wydostanie się zawartości jamy brzusznej
lub klatki piersiowej na zewnątrz) oraz przepukliny.

Zestawienie ważniejszych chorób monogenowych dziedzicznych jest

zawarte w tabeli 5-II.

133

5.4.4.4. Ograniczanie występowania chorób genetycznych

Częstość występowania genetycznie warunkowanych wad rozwojowych

u zwierząt gospodarskich jest różna w różnych krajach. Tam gdzie prowa-

dzona jest dokładna rejestracja przypadków wad wrodzonych połączona

z ograniczeniem ich występowania, częstość jest niewielka. W Polsce,

niestety, kontrola wad wrodzonych nie jest jeszcze dobrze zorganizowana.

Istnieją jednak akty prawne dotyczące ograniczania występowania tych

zaburzeń.

Opisane wyżej wady są dziedziczone w prosty sposób (jedna para alleli),

ale jedynie te, które są uwarunkowane genami dominującymi (o zupełnej

lub niepełnej dominacji), są zauważalne i łatwe do eliminacji. Większość

wad jest jednak uwarunkowanych genami recesywnymi i trudno je

wyeliminować z populacji hodowlanych.

Zapobieganie rozprzestrzenianiu się wad dziedzicznych w pogłowiu

zwierząt odbywa się przez usuwanie ich nosicieli. Terminem nosiciel

określamy osobnika, który jest fenotypowo normalny, ale w swoim genotypie

135

ma gen letalny (czy semiletalny) w układzie heterozygotycznym. Ujawnienie
się jakiejś wady w populacji u 1% osobników oznacza, że aż 18% osobników
jest nosicielami niepożądanego allelu. Wyjaśnienie tego wyliczenia znajduje
się w rozdziale: Podstawy genetyki populacji.

W przypadku genów sprzężonych z płcią wykrycie nosicielstwa tych

genów nie stwarza większych trudności. Nosicielami mogą być tylko osobniki
płci homogametycznej (u ssaków są to samice, u ptaków samce). Na
przykład od koguta nosiciela recesywnego genu letalnego sprzężonego
z płcią, skojarzonego z normalnymi kurami, będą pochodzić wszyscy
synowie fenotypowo normalni, jednakże połowa z nich będzie homo-
zygotami dominującymi, a połowa nosicielami niepożądanego genu. Nato-
miast wśród jego córek połowa będzie normalnych, a u połowy ujawni się
wada dziedziczna. Jeśli będzie to gen letalny powodujący zamieranie
zarodków, to po wykluciu stosunek liczbowy płci u potomstwa będzie
odbiegał od oczekiwanego 1 : 1 i będzie wynosił 2:1.

Znaczne trudności sprawia wykrywanie nosicieli autosomalnych genów

letalnych o charakterze recesywnym. Geny te, jak już wspomniano, fenotypo-
wo ujawniają swą obecność wówczas, gdy występują w stanie homozygoty-
cznym. Zatem nosicielstwo niepożądanego genu może być potwierdzone lub
wykluczone poprzez zastosowanie odpowiednich kojarzeń. Postępowanie to
ma na celu wykrycie nosicielstwa u rozpłodników, głównie wykorzystywa-
nych w sztucznej inseminacji (np. buhaje).

Znane są trzy klasyczne metody testowania rozpłodników na nosicielstwo

genów recesywnych:

1. Kojarzenie testowanego samca z samicami o genotypie homozygoty

recesywnej. Testowanie takie jest możliwe jedynie wtedy, gdy homozygoty
recesywne wykazujące wadę żyją i są płodne. Schemat takiego kojarzenia
jest następujący:

Jeżeli testowany osobnik jest nosicielem allelu recesywnego, to około

50% jego potomków będzie homozygotami recesywnymi.

2. Kojarzenie samca (domniemanego nosiciela) z dużą liczbą samic,

wśród których można się spodziewać obecności nosicielek recesywnego
allelu.

136

Pojawienie się w potomstwie pochodzącym z takich kojarzeń osobnika

obarczonego wadą świadczy o obecności poszukiwanego allelu recesywnego
w genotypach testowanego rozpłodnika oraz matki noworodka.

3. Dokładną metodą identyfikacji nosicielstwa recesywnego genu, lecz

trudną do zaakceptowania ze względów hodowlanych, jest kojarzenie
samca z jego własnymi córkami. Jeśli przyjmiemy, że samice matki tych
córek są homozygotyczne (AA), a samiec jest heterozygotyczny, to wśród
córek połowa będzie miała genotyp AA, a połowa Aa. Wówczas schemat
kojarzenia testowego jest następujący:

Kojarzenie rozpłodnika (ewentualnego nosiciela) z jego własnymi córkami

powinno dać w potomstwie rozszczepienie w stosunku 7 normalnych do l

obarczonego wadą.

W hodowli bydła młode buhaje, zakupione przez Stacje Hodowli i Una-

sieniania Zwierząt, kojarzone są z losowo wybranymi samicami. Celem

zasadniczym jest ocena wartości genetycznej rozpłodnika w zakresie cech

użytkowości mlecznej na podstawie potomstwa (metoda ta jest opisana

w podręcznikach z zakresu metod hodowlanych). Przeprowadzone kojarze-

nie może umożliwić także wykrycie obecności w genotypie zwierząt recesyw-

nych genów letalnych (tzw. test automatyczny). Jeśli oboje rodzice mają

genotyp heterozygotyczny w danym locus, w potomstwie może się ujawnić

z prawdopodobieństwem równym 1/4 niepożądana cecha recesywna.

Całkowita eliminacja z populacji genów letalnych o nieznanej budowie

molekularnej jest niemożliwa. Zatem jednym ze sposobów unikania w hodo-

wli masowej strat powodowanych dziedzicznymi wadami wrodzonymi jest

niedopuszczanie do kojarzeń krewniaczych. Ponadto należy rejestrować

i zgłaszać w zakładach unasieniania lub w okręgowych stacjach hodowli

zwierząt wszystkie przypadki rodzenia się zwierząt żywych lub martwych

z wadami wrodzonymi. Rejestracja ta z jednej strony daje obraz częstości

występowania tych wad, z drugiej natomiast umożliwia usuwanie z hodowli

nosicieli (zwłaszcza męskich).

137

Rozwój genetyki molekularnej pozwala coraz częściej na identyfikację

nosicielstwa zmutowanych alleli poprzez testy oparte na analizie re-

strykcyjnej (RFLP) zamplifikowanych metodą PCR fragmentów DNA,

w których występuje gen odpowiedzialny za powstanie dziedzicznej

wady wrodzonej czy choroby genetycznej. Zagadnienie to opisano niżej.

DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA NIEKTÓRYCH CHORÓB GENETYCZNYCH

Większość chorób genetycznych zwierząt gospodarskich jest spowodowana

mutacjami genowymi, które prowadzą do zmiany sekwencji kodującej

skład aminokwasowy określonego białka. Ostatnie lata przyniosły postęp

w poznawaniu podłoża molekularnego chorób dziedzicznych. W diagnostyce

tych chorób stosowane są techniki biologii molekularnej, głównie PCR-RFLP,

która polega na ustalaniu długości fragmentów restrykcyjnych DNA przez

cięcie (trawienie) zamplifikowanego DNA enzymami restrykcyjnymi (en-

donukleazy), a następnie rozdział tych fragmentów za pomocą elektroforezy

(patrz rozdział: Metody analizy i modyfikacji genomu).

Najbardziej rozpowszechnioną chorobą genetyczną w hodowli bydła

rasy holsztyńsko-fryzyjskiej jest BLAD (ang. bovine leukocyte adhesion
deficiency) — zmniejszona odporność cieląt, spowodowana wrodzonym

niedoborem leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych. Jest to choroba auto-

somalna recesywna, występująca również u ludzi pod nazwą LAD (ang.

leukocyte adhesion deficiency). Jest ona warunkowana zmutowanym

recesywnym allelem (oznaczonym symbolem D128G) genu ITGB2, który

koduje strukturalną podjednostkę CD18 p

-integryny. Białko to odgrywa

istotną rolę w odporności organizmu. Pewnym niebezpieczeństwem roz-

przestrzeniania tej choroby jest to, iż przypuszczalnie geny korzystnych

cech ilościowych są istotnie sprzężone z locus genu ITGB2. Osobniki

heterozygotyczne (nosiciele niekorzystnego zmutowanego allelu) cechuje

jednocześnie wysoka wartość hodowlana.

Na początku lat 90. w USA frekwencja nosicieli niekorzystnego allelu

D128G wynosiła około 15% wśród buhajów i 6% wśród krów.

U bydła zespół BLAD był znany od kilkunastu lat, po raz pierwszy

opisano go w 1983 roku. Analiza rodowodowa wykazała, że mutacja genu

ITGB2 wystąpiła u buhaja urodzonego w USA w 1952 roku. Jednak

molekularna identyfikacja allelu D128G (BLAD) nastąpiła dopiero w 1992

roku. W latach 70. rozpoczął się intensywny import do Polski bydła rasy

holsztyńsko-fryzyjskiej w celu poprawy wartości genetycznej rodzimego

bydła czarno-białego, tym samym wprowadzono do puli genowej naszego

bydła niekorzystny allel D128G. Ponieważ jest to gen recesywny, szczególne

znaczenie ma identyfikacja jego nosicieli (osobniki heterozygotyczne, feno-

typowo zdrowe). Stwierdzona w pozycji 383 nukleotydu mutacja, powodu-

jąca zamianę w pozycji 128 łańcucha polipeptydowego kwasu asparagino-

138

wego na glicynę, jest podstawą testu molekularnego umożliwiającego

wykrywanie nosicielstwa.

Za pomocą analizy fragmentów restrykcyjnych określa się, jaki allel

występuje w badanym DNA. Wykorzystuje się do tego celu istnienie

różnych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych Haelll i Tacjl zależnie od

normalnych i zmutowanych sekwencji nukleotydowych. W allelu prawid-

łowym znajduje się miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez enzym Haelll

i miejsce restrykcyjne dla enzymu TaqI. Natomiast w allelu zmutowanym

D128G mutacja punktowa zmienia sekwencję rozpoznawaną przez enzym

TaqI i w następstwie tego enzym nie przecina cząsteczki DNA. Z kolei, ta

sama mutacja punktowa powoduje powstanie drugiego miejsca restrykcyj-

nego dla enzymu HaeIII. Po zamplifikowaniu fragmentu genu

-integryny

produkt PCR długości 58 par zasad poddaje się trawieniu jednym z wymie-

nionych enzymów, a następnie uzyskane fragmenty rozdziela elektro-

foretycznie (metoda RFLP). Obraz elektroforetycznego rozdziału wygląda

następująco:

W obrębie genu kodującego podjednostkę

-integryny stwierdzono także

drugą mutację, tzw. ciche podstawienie 775 nukleotydu, które nie wpływa

na sekwencję aminokwasową białka kodowanego przez ten gen.

Inną chorobą genetyczną bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej jest cyt-

rulinemia, opisana po raz pierwszy u bydła mlecznego w Australii w 1986

roku. W 1993 roku stwierdzono jej występowanie również u bydła tej rasy

w USA. Mutacja ta została już przedstawiona wcześniej. Jej podłożem

genetycznym jest zmutowany, recesywny allel genu warunkującego syntezę

enzymu syntetazy argininobursztynianowej, który bierze udział w cyklu

mocznikowym. Nosiciele cytrulinemii mają genotyp ASAS/asas i fenotypowo

są normalni, natomiast cielęta homozygotyczne asas/asas padają 5-6 dnia po

urodzeniu z powodu upośledzenia zdolności usuwania mocznika z organiz-

mu. Ze względu na możliwość wprowadzenia tego niekorzystnego allelu do

genotypów bydła w innych krajach, podejmowane są środki prewencyjne.

Opracowany test diagnostyczny cytrulinemii z zastosowaniem techniki

PCR-RFLP wykorzystuje to, iż zmutowany allel nie ma miejsca restrykcyj-

139

nego dla enzymu Avall w kodonie 86. Wynikiem testu molekularnego dla

osobnika homozygotycznego pod względem allelu zmutowanego jest jeden

prążek długości 194 pz, dla heterozygotycznego trzy prążki: 194 pz, 118 pz

i 72 pz, a dla normalnej homozygoty dwa prążki 118 pz i 72 pz.

W obrębie genu syntetazy argininobursztynianowej stwierdzono także

tranzycję cytozyny na tyminę, powodującą polimorfizm w 175 kodonie dla

proliny (CCC

→CCT), nie dającą żadnych skutków fenotypowych.

Kolejną, również wcześniej przedstawioną mutacją letalną, występującą

u czarno-białego i czerwono-białego bydła holsztyńsko-fryzyjskiego, jest

recesywna mutacja genu syntazy urydynomonofosforanowej. Zmutowany

allel genu UMPS, określony symbolem DUMPS (ang. deficiency uridine
monophosphate synthase), powoduje zamieranie homozygotycznych zarod-

ków około 40 dnia ciąży, dlatego nazwano go „genem zamieralności

zarodków". Osobniki heterozygotyczne są fenotypowo normalne, ale wyka-

zują obniżony poziom aktywności enzymu. Konsekwencją tego jest podwyż-

szony poziom kwasu orotowego w mleku i moczu krów heterozygotycznych.

Z drugiej jednak strony, krowy takie charakteryzuje większa wydajność

mleka i zawartość białka w mleku, natomiast buhaje mają wyższą wartość

hodowlaną w zakresie cech użytkowości mlecznej. Aby nie dopuszczać do

kojarzeń nosicieli tego niekorzystnego genu, których skutkiem byłoby

zmniejszenie płodności krów (zamieralność zarodków homozygotycznych),

konieczna jest identyfikacja genotypów heterozygotycznych (nosicieli). Po-

dobnie jak w przypadku poprzednich mutacji, do identyfikacji nosicielstwa

zmutowanego allelu stosowana jest metoda PCR-RFLP. Mutacja ta w kodonie

405 genu UMPS znosi miejsce restrykcyjne dla enzymu Aval. Prawidłowy gen

syntazy urydynomonofosforanowej będzie przez ten enzym trawiony, nato-

miast allel zmutowany (DUMPS) — nie będzie. Zamplifikowany fragment

genu trawiony enzymem Avol da następujący obraz rozdziału elektroforetycz-

nego:

osobniki homozygotyczne (zdrowe) — dwa prążki: 53 pz i 36 pz
osobniki heterozygotyczne (nosiciele) — trzy prążki : 53 pz, 36 pz i 89 pz

Ze względu na letalny efekt allelu DUMPS w układzie homozygotycznym,

niemożliwa jest analiza DNA osobników homozygotycznych. Prowadzone

są jednak badania blastocyst przewidzianych do embriotransferu pochodzą-

cych z kojarzeń osobników heterozygotycznych.

U koni dotychczas poznano molekularne tło dwóch chorób genetycznych.

Pierwsza z nich to okresowy paraliż, nazwany HYPP (ang. hyperkalemic
periodic paralysis), pojawiający się u koni „ąuarter" w USA. Odpowiedzialna

za tę chorobę jest mutacja w genie kanału sodowego mięśni, polegająca na

transwersji C

→G w transbłonowej domenie IVS

podjednostki a genu

kanału sodowego (zamiana fenyloalaniny na leucynę w regionie między

1358 a 1514 aminokwasem w białku). Objawami tej choroby są ataki drżenia

mięśni i paraliżu, występujące po zmianie diety, okresie głodzenia, za-

140

działaniu czynnika stresogennego lub spożyciu siana z lucerny bogatej

w potas. Okresowy paraliż występuje u koni cennych pod względem

wartości genetycznej, dobrze umięśnionych. Selekcja koni na podstawie

wyników gonitw na torze wyścigowym może prowadzić do wzrostu

frekwencji tego niekorzystnego allelu. Mutacja HYPP dziedziczy się

z niezupełną dominacją, u koni homozygotycznych objawy są silniejsze

niż u heterozygotycznych. Diagnostyka molekularna nosiciela zmutowane-

go ałlelu prowadzona jest za pomocą metody PCR-RFLP, z zastosowa-

niem enzymu restrykcyjnego Tagi. Podobna choroba od 50 lat znana jest

u ludzi.

Druga choroba genetyczna o znanym podłożu molekularnym wy-

stępująca u koni to ciężki złożony brak odporności (ang. severe combined
immunodeficiency disease — SCID). Choroba ta charakteryzuje się

brakiem limfocytów T oraz B, co powoduje załamanie się układu im-

munologicznego. Źrebięta o genotypie homozygoty recesywnej padają

wkrótce po urodzeniu wskutek rozwoju różnorodnych infekcji. Za rozwój

tej choroby odpowiedzialna jest mutacja polegająca na delecji 5 nu-

kleotydów w genie kodującym katalityczną podjednostkę kinazy biał-

kowej zależnej od DNA (DNA-PK). Mutację tę stwierdzono u koni

czystej krwi arabskiej hodowanych w USA, natomiast badania prze-

prowadzone w Polsce wykazały, że nie występuje ona w polskiej

populacji koni arabskich.

Omawiając choroby genetyczne nie sposób pominąć tzw. chorób prio-

nowych. Wprawdzie są one wywoływane przez nietypowy czynnik zakaźny,

którym jest białko, jednak predyspozycje do tych chorób mogą być

warunkowane mutacją genową. Białkowe cząsteczki infekcyjne, nazwane

prionami, namnażają się w ten sposób, iż przekształcają prawidłowe

cząsteczki białka w szkodliwe, indukując zmiany ich konformacji. Znane

choroby prionowe powodują często ubytki w mózgu i w konsekwencji

prowadzą do śmierci. Z tego powodu określane są gąbczastymi encefalopa-

tiami (ang. spongiform encephalopathies).

Przypuszcza się, iż białko prionowe i białko komórkowe (normalne) są

kodowane przez ten sam gen, a różnica między nimi wynika z zakłóceń

w wycinaniu intronów tego genu (splicing mRNA). Gen kodujący białko

komórkowe oznaczono symbolem PrP

, jego zmutowany allel, warunkujący

białko prionowe — symbolem PrP

. Gen ten u człowieka znajduje się

w krótkim ramieniu chromosomu 20, na granicy prążka 12 i 13 (20pl2-pl3),

natomiast u bydła i owiec w długim ramieniu chromosomu 13, przy czym

u bydła w pozycji 13ql7, u owiec — 13ql7-ql8.

Jedną z najdawniej, bo około 250 lat temu, poznanych chorób prionowych

u zwierząt jest trzęsawka (ang. scrapie — drapać) u owiec. Choroba

ta jest śmiertelna i charakteryzuje się długim okresem inkubacji, trwającym

miesiące lub lata bez żadnych objawów. W czasie jej rozwoju przekształcone

cząsteczki białka gromadzą się w mózgu i niektórych tkankach, jak

141

śledziona czy węzły chłonne. Diagnozowanie choroby jest oparte na

pośmiertnym klinicznym badaniu mózgu. W ciągu ostatnich 20 lat czyniono

próby ograniczenia występowania scrapie przez selekcję owiec odpornych

na nią i brakowanie podatnych. Metoda ta okazała się jednak zbyt droga

i długotrwała, a jej rezultaty nie były zadowalające. Znacznie większe

możliwości eliminacji scrapie stwarzają techniki biologii molekularnej.

W obrębie genu PrP

u owiec szczególnie istotne są trzy mutacje punktowe

w następujących kodonach: 136 (kodon dla waliny zmieniony w kodon dla

alaniny; oznaczenia literowe V/A), 154 (arginina/histydyna; R/H) oraz 171

(arginina/glutamina; R/Q) (tab. 5-III). Jednak duża zmienność rasowa

w podatności na scrapie ogromnie utrudnia określenie genotypu „podat-

nego" i „odpornego". Wydaje się, że najbardziej odporne są owce o genotypie

136

154

171

, a najbardziej podatne owce o genotypie W

136

154

(genotyp ten występuje jednak bardzo rzadko).

U bydła chorobą prionową jest rozmiękczenie mózgu (ang. bovine

spongiform encephalopathy — BSE). Pierwszy przypadek tej choroby

zanotowano w 1985 roku w Wielkiej Brytanii, rok później została opisana

jej patologia. Jest to choroba ośrodkowego układu nerwowego. Jej charak-

terystyczną cechą jest tworzenie i gromadzenie białka amyloidowego

(odpornego na działanie enzymów proteolitycznych) w mózgu zakażonych

zwierząt. Czynnikiem zakaźnym BSE jest to samo białko prionowe, które

wywołuje scrapie u owiec. Białko to ma około 250 aminokwasów. W genie

PrP

u bydła (w chromosomie 13 —BTA13ql7) wykryto polimorfizm,

związany z różnicą w liczbie ośmiopeptydowych powtórzeń (5 lub 6 po-

wtórzeń) (ryć. 5-17). Dotychczas stwierdzono, że częściej występuje 6 po-

wtórzeń. Spośród trzech możliwych genotypów (6:6, 6:5 i 5:5) najrzadziej

występuje genotyp homozygotyczny — pięć powtórzeń. Ponadto tylko ten

genotyp nie występował u krów z BSE. Prowadzone są intensywne badania

na myszach transgenicznych z bydlęcym genem PrP

, które powinny

przyczynić się do wyjaśnienia genetycznego tła tej choroby.

Ostatnie badania wykazały, że w pobliżu genu białka prionowego

znajduje się gen Prnd (ang. prion-doppel). Gen ten koduje białko określane

jako Dpl (ang. downstream prion-like protein) lub doppel, które wykazuje

25% homologii w składzie aminokwasowym z białkiem prionowym. Nadek-

spresja tego genu w mózgu może powodować inną chorobę neurodegene-

racyjną. Wykryto już kilka mutacji w tym genie u owiec, kóz i bydła.

142

5.4.5. Mutacje genowe odpowiedzialne za

odporność/podatność zwierząt na patogeny

Gen odporności na kleszcze

W niektórych krajach, głównie w północnej Australii i innych regionach

tropikalnych, jak również w Europie, bydło jest szczególnie podatne na

inwazje kleszczy. Z kolei, bydło indyjskie jest bardzo odporne na kleszcze.

Tę odporność można przenosić na mieszańce poprzez krzyżowanie z rasami

podatnymi, ale jednocześnie powoduje to zmniejszenie produkcyjności

potomstwa krzyżówkowego. Australijscy badacze wykryli u linii pochodzą-

cych z krzyżowania bydła mięsnego ras hereford i shorthorn gen o dużym

efekcie, determinujący odporność na kleszcze. Wykorzystanie tego genu

stwarza możliwość stosunkowo szybkiego zwiększenia odporności na

kleszcze różnych ras bydła.

Gen K88 i F18

U świń odporność na niektóre choroby infekcyjne jest kontrolowana

przez pojedynczy gen. Należą do nich biegunki okresu noworodkowego

u prosiąt, w przeważającej mierze wywoływane enterotoksycznymi szcze-

pami Escherichia coli, powodujące rocznie padnięcie około 10 min prosiąt

na świecie. Podatność na te biegunki zależy od obecności receptorów

na powierzchni komórek nabłonka jelita cienkiego u zwierząt, umożli-

wiających adhezję bakterii i ich rozwój. Z kolei, występowanie tych

143

receptorów warunkowane jest genem głównym (o dużym efekcie). Loci
receptorów dla E. coli K88 zlokalizowano w chromosomie 13, blisko locus Tf
(transferyny). Receptory te prawdopodobnie pełnią także jakieś funkcje
fizjologiczne, stwierdzono bowiem, iż zwierzęta mające te receptory charak-
teryzują się zwiększonymi dobowymi przyrostami masy ciała w przedziale
wagowym od 24 do 100 kg.

U prosiąt w późniejszym wieku (4-12 tygodni) występuje choroba

obrzękowa, której objawami są m.in. ataksja, konwulsje i paraliż oraz
biegunka poodsadzeniowa (kolibacilloza jelitowa), schorzenia wywoływane
przez enterotoksyny wytwarzane przez zasiedlający powierzchnię jelita
cienkiego szczep F18 E. coli (bakterie te mają fimbrie). Odporność/podatność
na adhezję tej bakterii jest kontrolowana przez locus ECF18R (locus receptora
dla E. coli F18), znajdujący się w chromosomie 6 i wchodzący w skład
halotanowej grupy sprzężeniowej. Podatność jest cechą dominującą (allel B),
a odporność recesywną (allel b). Niedawno stwierdzono sprzężenie między
locus ECF18R a dwoma loci (FUT1 i FUT2) dla

α-l,2-fukozylotransferazy.

W jednym z nich (FUT1) wykryto dwie mutacje, z których jedna, oznaczona
symbolem M307, polegająca na tranzycji G-»A w kodonie 307 (w łańcuchu
peptydowym zamiana alaniny na treoninę), wykazuje ścisłe sprzężenie
z genem ECF18R. Mutacja ta likwiduje miejsce trawienia DNA dla enzymu
CfoI. Analiza polimorfizmu DNA przeprowadzona metodą RFLP wykazuje
obecność dwóch prążków (93 pz i 328 pz) u osobników homozygotycznych
MSOZ

A/A

(allel zmutowany), trzech prążków (93, 241 i 87 pz) u homozygot

M307

G/G

(allel normalny) oraz wszystkich czterech prążków u zwierząt

heterozygotycznych. W badaniach szwajcarskich wykazano 100% sprzężenie
allelu ECF18R

', warunkującego odporność na infekcje E. coli F18, z ałlelem

zmutowanym M307

, oraz takie samo sprzężenie allelu ECF18R

(podatność

na biegunki i chorobę obrzękową) z ałlelem normalnym M307

. Stwarza to

szansę wczesnego wykrywania prosiąt podatnych na infekcje E. coli F18 na
podstawie testu diagnostycznego dla mutacji M307 w locus

α-fukozylotrans-

ferazy. Badania przeprowadzone w Polsce wykazały wysoką frekwencję
allelu odporności w rasie złotnicka pstra.

5.5. Mutacje w mitochondrialnym DNA

Mutacje w mitochondrialnym DNA (mtDNA) zachodzą znacznie częściej
niż mutacje w DNA jądrowym. Przyczyną tego może być brak w mitochon-
driach mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA.

Mutacje te mogą być dziedziczone po matce, mogą także powstawać

de novo w komórce jajowej lub w zarodku we wczesnym stadium roz-
wojowym. Część mutacji w mitochondrialnym DNA zachodzi w ciągu
całego życia osobnika, a ich charakterystyczną cechą jest to, iż mogą

144

dotyczyć całych tkanek, pojedynczych komórek lub nawet poszczególnych

cząsteczek mtDNA tej samej komórki.

Miejsce i zasięg występowania danej mutacji powodują, iż w tkance

występują razem gen prawidłowy i jego zmutowany allel bądź dana

mutacja może występować w każdej cząsteczce mtDNA we wszystkich

tkankach. Pierwszy rodzaj mutacji nazywany jest mutacją heteroplaz-

matyczną, drugi natomiast mutacją homoplazmatyczną.

Mutacje w mitochondrialnym DNA są przyczyną bardzo poważnych

chorób genetycznych u ludzi. Należą do nich przede wszystkim choroby

ośrodkowego układu nerwowego i układu mięśniowego. Niestety brak

jest efektywnych metod leczenia chorób wywoływanych tymi mutacjami.

Cechą charakterystyczną chorób powodowanych mutacjami w mtDNA

jest to, iż mutacja jest przekazywana przez komórkę jajową od chorej

matki zarówno córkom, jak i synom, ale dalszym pokoleniom cechę

tę przekazują tylko córki.

Mutacje w mitochondrialnym DNA, podobnie jak w DNA jądrowym,

polegają na substytucjach nukleotydów (głównie tranzycja), insercji bądź

delecji nukleotydów. Skutkiem tranzycji są takie choroby u człowieka, jak

dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego — zespół Lebera (LHON)

i neuropatia obwodowa mięśni połączona z ataksją i barwnikowym zwyrod-

nieniem siatkówki (NARP). Podstawienia nukleotydów w genach kodujących

tRNA powodują m.in. mitochondrialną miopatię, padaczkę miokloniczną

i tzw. poszarpane czerwone włókna (MERRF), dziedziczną miopatię i kar-

diomiopatię (MMC) oraz zespół chorobowy oznaczony skrótem MELAS

(encefalomiopatia mitochondrialną, kwasica mleczanowa i napady udaropo-

dobne). Z kolei mutacje typu insercja-delecja są przyczyną większości

miopatii ocznych (np. chroniczny postępujący paraliż mięśni oka — CEOP)

i zespołu Pearsona, polegającego na zaburzeniach funkcjonowania szpiku

kostnego u dzieci i niewydolności trzustki.

Większość mutacji w mtDNA cechuje specyficzna relacja między geno-

typem a fenotypem. Określona choroba może być wywołana mutacjami

w różnych genach i odwrotnie — dana mutacja może być przyczyną

różnych chorób. Przykładem pierwszej sytuacji jest wspomniana już choroba

LHON, której podłożem genetycznym są mutacje w 6 różnych podjednost-

kach dehydrogenazy NADH lub mutacja w genie apocytochromu b. Z kolei,

mutacja w pozycji 8993 genu syntazy ATP warunkuje chorobę NARP oraz

zespół Leigha (śmiertelna choroba wieku dziecięcego).

Badania występowania i skutków mutacji genów mitochondrialnych

u zwierząt są nieliczne. Wiadomo na przykład, że niektóre allele genu

karboksylazy fosfoenolopirogronianowej (enzym biorący udział w szlaku

glukoneogenezy) występują u kurcząt podatnych na chorobę Mareka,

wywoływaną przez wirus, inne natomiast u odpornych.

Genetyka klasyczna (mendlowska) jako cechę określa właściwość or-

ganizmu, która jest łatwa do odróżnienia w zespole innych właściwości

(np. barwa umaszczenia, posiadanie/brak rogów). Dzięki osiągnięciom

genetyki biochemicznej powstała hipoteza jeden gen — jeden enzym.

W myśl tej hipotezy synteza każdego enzymu jest kontrolowana przez

określony gen. Dalsze badania spowodowały uściślenie tej hipotezy:

jeden gen — jeden łańcuch polipeptydowy. Oznacza to, że jeden gen

warunkuje sekwencję aminokwasów w polipeptydzie.

W opisie mechanizmów dziedziczenia łatwiej jest posługiwać się mend-

lowskim pojęciem cechy jako pewnej właściwości. Ogólnie cechy można

podzielić na jakościowe i ilościowe. Cechy jakościowe są warunkowane

jedną, rzadziej kilkoma współdziałającymi ze sobą parami genów. Natomiast

podłoże genetyczne cech ilościowych jest bardziej złożone, bowiem na ich

ekspresję wpływa kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt par genów. Ponadto,

w przypadku wielu cech ilościowych ich wartość jest modyfikowana przez

czynniki środowiskowe.

Mechanizm dziedziczenia cech ilościowych jest omówiony w rozdziale:

Zmienność cech.

Do cech jakościowych zalicza się takie, jak: umaszczenie zwierząt,

kolor upierzenia u drobiu; rogatość lub bezrożność bydła, owiec i kóz;

układy grupowe krwi itd. Wspólną właściwością tych cech jest to, że

identyfikacja różnych wariantów fenotypowych danej cechy jest względnie

prosta.

Mechanizm dziedziczenia cech jakościowych jest zróżnicowany, a ich

ujawnienie się zależy przede wszystkim od założeń genetycznych. Wpływ

czynników środowiskowych na ekspresję tych cech jest niewielki i dotyczy

tylko nielicznych przypadków, np. umaszczenia. Znane są również przy-

kłady, kiedy jeden gen wpływa na kształtowanie się kilku cech. Zjawisko to

nazywa się plejotropią.

146

Zestaw genów występujących w komórkach jednego osobnika nazywamy

genotypem, a zespół cech warunkowanych przez genotyp i czynniki środo-

wiskowe — fenotypem.

Genotyp jest ustalany na podstawie fenotypu osobnika lub jego krewnych

bądź przez bezpośrednie badanie DNA. Fenotyp jest opisywany na pod-

stawie obserwacji lub pomiaru cechy oraz analiz molekularnych (identyfika-

cja białek).

Jak już wspomniano, cechy jakościowe mogą być warunkowane jedną

lub kilkoma parami genów współdziałających ze sobą. Pierwszy rodzaj

współdziałania nosi nazwę allelicznego (1 para genów), drugi natomiast —

nieallelicznego (kilka par genów).

Para genów warunkujących powstanie określonej cechy zajmuje okreś-

lone miejsce (locus) w dwóch homologicznych chromosomach. Geny te

nazywane są parą alleli lub allelomorfów. Allelomorficzną parę genów

oznacza się tą samą literą — wielką lub małą (np. A-a). Wybór litery zwykle

jest związany z angielską nazwą pierwszego wariantu allelu wykrytego

w danym locus.

Zygota, która zawiera dwa jednakowe geny z danej pary alleli, nazywa

się homozygotą (AA lub aa), natomiast mająca dwa różne geny — hetero-

zygotą (Aa). Kojarzenie jednakowych homozygot między sobą daje zawsze

potomstwo jednolite pod względem interesującej nas cechy. W przypadku

kojarzenia heterozygot w potomstwie wystąpi rozszczepienie cech, dając

wszystkie możliwe formy danej cechy.

Podstawowe reguły dziedziczenia cech zawarte są w prawach Mendla.

I prawo Mendla, zwane prawem czystości gamet, mówi o tym, że

gameta zawiera tylko jeden gen z danej pary alleli. W procesie game-

togenezy allele z danej pary rozchodzą się do gamet. Podczas zapłodnienia

dochodzi do losowego łączenia się alleli w pary. Potomek dziedziczy

zatem jeden allel z danej pary od ojca, drugi natomiast od matki.

6.1. Dziedziczenie cech warunkowanych jedną

parą alleli

6.1.1. Współdziałanie alleli

Cechy jakościowe kontrolowane przez jeden gen są wynikiem współ-

działania między parą alleli tego genu. Można wyróżnić następujące rodzaje

tego współdziałania:

1) dominowanie całkowite — typ Pisum

2) dominowanie niezupełne (dziedziczenie pośrednie) — typ Zea

3) kodominowanie

4) naddominowanie.

147

Przykładem całkowitej dominacji może być bezrożność u bydła. Stwier-

dzono, iż cecha bezrożności/rogatości jest kontrolowana przez locus polled

(znajdujący się w l chromosomie), który ma dwa allele: P — dominujący

allel bezrożności i p — recesywny gen rogatości. Wszystkie zwierzęta

(bydło) rogate są homozygotyczne pod względem recesywnego allelu p.

Allel ten u osobników heterozygotycznych nie ujawnia się w fenotypie,

gdyż gen dominujący P maskuje jego ekspresję. Para rodziców, będących

homozygotami alternatywnymi (PP i pp) pod względem locus polled, zawsze

da potomstwo heterozygotyczne, wykazujące dominującą formę cechy.

Kojarząc te osobniki między sobą uzyskamy w następnym pokoleniu 3/4

zwierząt bezrogich (PP i Pp) i 1/4 rogatych (pp).

Innym przykładem jest biały pas u czarno umaszczonych świń rasy

hampshire, kontrolowany przez allel dominujący Be

z locus Be. Z kolei

u świń rasy cornwall, również czarno umaszczonych, w locus tym występuje

allel be, jednolitego umaszczenia. Krzyżowanie międzyrasowe świń obu

tych ras przedstawiono na rycinie 6-1.

Przedstawiony na przykładzie sposób dziedziczenia z dominowaniem

całkowitym nazywany jest również dziedziczeniem typu Pisum. Do cech

dziedziczących się z dominowaniem całkowitym należą także: bezrożność

(cecha dominująca) i rogatość kóz, jednolite umaszczenie (dominuje)

i łaciatość u bydła, czarne umaszczenie u bydła, dominujące nad czerwonym

i inne.

Dominowanie niezupełne genów z jednej pary alleli polega na tym, że

u osobników heterozygotycznych pod względem danej pary alleli występuje

pośrednia forma cechy. Ilustracją tego typu dziedziczenia, nazywanego

również dziedziczeniem typu Zea, jest poniższy przykład.

U bydła rasy shorthorn obok zwierząt czerwono umaszczonych zdarzają

się osobniki o umaszczeniu białym oraz zwierzęta mające umaszczenie

pośrednie — mroziate. Kojarząc zwierzęta umaszczone czerwono ze zwie-

rzętami białymi, otrzymuje się potomstwo (pokolenie F

) mroziate. Natomiast

z kojarzenia osobników mroziato umaszczonych uzyskuje się potomstwo

(pokolenie F

), z którego część ma umaszczenie czerwone, część mroziate,

część zaś białe. Jeżeli obserwacje będą prowadzone na dużej grupie zwierząt,

to stosunek liczbowy osobników czerwonych, mroziatych i białych w poko-

leniu F

wyniesie 1:2:1.

Charakterystyczną cechą tego typu dziedziczenia jest to, że fenotyp

zwierzęcia odzwierciedla jego genotyp. Wiele cech zwierząt domowych

dziedziczy się tak jak cecha umaszczenia u shorthornów. Są to na przykład:

szurpatość u kur (pióra nastroszone i pozwijane), upierzenie kur andaluzyj-

skich (czarne, białe i stalowoniebieskie), długość uszu u owiec rasy karakuł

i inne.

W przypadku kodominowania w fenotypie ujawniają swą obecność

obydwa geny z określonej pary alleli. Są one zatem w stosunku do siebie

równorzędne. Przykładem tego typu współdziałania allelicznego jest grupa

148

występują więcej niż dwa allele, nazywamy szeregiem (serią) alleli wielo-
krotnych.

Allele wielokrotne charakteryzują się tym, iż:

• warunkują tylko jedną cechę
• każdy osobnik może mieć tylko dwa allele z danego szeregu
• wśród zwierząt stanowiących populację można napotkać wiele geno

typów zarówno homozygotycznych pod względem któregokolwiek allelu
z tego szeregu, jak i heterozygotycznych pod względem jakichkolwiek
dwóch alleli

• liczba różnych genotypów w populacji zależy od liczby alleli w danym

szeregu. Jeśli szereg składa się z n liczby alleli, to liczba genotypów będzie
się równała:

Przedstawione przykłady dziedziczenia dotyczyły tylko jednej cechy

kontrolowanej przez jedną parę alleli. Jeśli rozpatrywane jest dziedziczenie
dwóch lub więcej takich cech równocześnie, to mogą się one dziedziczyć
niezależnie od siebie lub zależnie (cechy sprzężone).

6.1.2. Niezależne dziedziczenie cech (II

prawo Mendla)

Niezależne dziedziczenie cech stwierdził Grzegorz Mendel, badając m.in.
sposób dziedziczenia barwy kwiatów i kształtu nasion u groszku. Na
podstawie uzyskanych wyników sformułował prawo (II prawo Mendla),
mówiące o niezależnym dziedziczeniu się cech. Oznacza to, że podczas
mejozy segregacja alleli jednej pary jest niezależna od alleli drugiej pary.
Warunkiem niezależnego dziedziczenia się cech jest umiejscowienie deter-
minujących je genów w różnych parach chromosomów. Również gdy loci
genów znajdują się w tym samym chromosomie w dużej odległości od
siebie, to ich segregacja jest praktycznie niezależna.

Niezależne dziedziczenie cech obrazuje przykład krzyżowania zwierząt

różniących się dwiema cechami — umaszczeniem (czarne, czerwone),
warunkowanym parą alleli E

-e (z locus Extension umiejscowionego w chro-

mosomie 18) i bezrożnościa/rogatością (allele P-p z locus polled w chromo-
somie 1).

Wszystkie gamety osobnika aberdeen-angus (bydło czarne, bezrogie)

zawierają dominujące geny E

i P, natomiast gamety osobnika rasy shorthorn

(czerwone, rogate) — allele recesywne e i p. Zwierzęta z pokolenia Fj będą
mieć genotyp E

ePp, czyli będą czarne, bezrogie. Każdy osobnik z tego

pokolenia wytwarza 4 różne rodzaj gamet: E

P, E

p, eP, ep. Dzieje się tak

150

dlatego, że allele E

-e przechodzą do komórek rozrodczych niezależnie od

alleli P-p, gdyż te dwie pary genów znajdują się w innych parach

chromosomów homologicznych. Ponieważ każdy osobnik wytwarza 4 ro-

dzaje gamet, to w wyniku losowego połączenia się gamety męskiej i żeńskiej

może powstać 4 x 4 = 16 możliwych kombinacji.

Najłatwiej przedstawić wszystkie możliwe genotypy w pokoleniu F

sporządzając szachownicę genetyczną Punneta. Spośród 16 możliwych

kombinacji genów w pokoleniu F

uzyskuje się tylko 4 różne fenotypy

w następującym stosunku liczbowym: 9 (czarne, bezrogie): 3 (czarne,

rogate): 3 (czerwone, bezrogie): l (czerwone, rogate) (ryć. 6-2). Najliczniejszą

grupę potomstwa stanowią osobniki o genotypie, w którym występuje

przynajmniej jeden gen dominujący z każdej pary, a najmniej liczną grupę

(tylko l na 16 możliwych) stanowią osobniki podwójnie recesywne homo-

zygotyczne (ee pp — czerwony, rogaty).

Liczbowy stosunek rozszczepienia cech w pokoleniu F

(9:3:3:1) wystąpi

tylko wtedy, gdy obie cechy dziedziczą się z dominowaniem całkowitym.

W przypadku obu cech dziedziczących się z dominowaniem niezupełnym

(typ Zea) należy spodziewać się nie 4, lecz 9 różnych fenotypów. Natomiast

gdy jedna cecha dziedziczy się według typu Pisum, a druga według typu

Zea, istnieje możliwość ujawnienia się 6 różnych fenotypów. Jeśli będzie

rozpatrywana większa liczba cech równocześnie, zwiększy się liczba moż-

liwych fenotypów.

Liczbę gamet wytwarzanych przez osobniki heterozygotyczne pod

względem n par alleli, liczbę oczekiwanych fenotypów i genotypów

w pokoleniu F

można obliczyć ze wzorów:

liczba różnych gamet = 2

liczba fenotypów = 2

liczba genotypów = 3

6.1.3. Dziedziczenie cech sprzężonych

Podstawę II prawa Mendla o niezależnym dziedziczeniu się cech stanowi

to, iż geny umiejscowione w różnych chromosomach zachowują się

niezależnie podczas mejozy. W tym przypadku można mówić o niezależnej

segregacji chromosomów. Jednak organizmy żywe mają tysiące, dziesiątki

tysięcy różnych genów, a tylko kilka do kilkudziesięciu chromosomów.

Zatem każdy chromosom zawiera wiele genów. Podczas procesu gametoge-

nezy geny znajdujące się w określonym chromosomie będą przekazane do

powstającej komórki rozrodczej łącznie, inaczej mówiąc, cechy kontrolowane

przez te geny będą się dziedziczyć razem. Cechy takie nazywamy sprzężo-

nymi. Podany wyżej wzór na obliczanie liczby różnych gamet (2

) nie może

152

być stosowany do tych cech. Sposób segregacji genów znajdujących się
w tym samym chromosomie zależy od odległości między nimi. W rozdziale:
Chromosomy i podziały jądra komórkowego wspomniano o tym, iż
w profazie I podziału mejotycznego zachodzi koniugacja chromosomów
i powstają biwalenty, złożone z homologicznych chromosomów. Dochodzi
wówczas do wymiany odcinków między niesiostrzanymi chromatydami,
zwanej crossing over. W wyniku crossing over u części osobników potom-
nych, tzw. rekombinantów, pojawią się kombinacje cech w innym układzie
niż u rodziców. Częstość tej wymiany jest tym większa, im dalej od siebie
znajdują się geny. Prawidłowość ta została wykorzystana w opracowywaniu
map genetycznych ukazujących względne położenie poszczególnych loci
w chromosomach.

Sposób określania sprzężenia (odległości) loci przedstawia poniższy

przykład.

U muszki owocowej (Drosophila melanogaster) w drugim chromosomie

znajdują się między innymi geny warunkujące czarną barwę ciała (gen
recesywny b — black) i kształt skrzydeł, skrzydła szczątkowe (gen recesywny
v — vestigal). Normalny fenotyp barwy ciała muszki to barwa jasnobrunatna,
normalne skrzydła są dłuższe od odwłoka. Przyjmuje się symbol „ + " na
oznaczenie allelu normalnej formy (tzw. dzikiej) każdej cechy u muszki.
Jednak w celu lepszego zrozumienia zostaną przyjęte symbole B (barwa
ciała dzika — dominująca) i V (kształt skrzydeł dziki — dominujący).

W odróżnieniu od cech segregujących niezależnie, genotyp dla cech

sprzężonych jest zapisywany w postaci ułamka, w którym licznik oznacza
jeden chromosom, mianownik drugi chromosom z tej pary. Dla muszki
dzikiej genotyp pod względem dwóch rozpatrywanych cech jest na-
stępujący:

Natomiast genotyp podwójnej homozygoty recesywnej:

W celu określenia, jakie allele u osobnika heterozygotycznego (dominu-

jące czy recesywne) z dwu loci sprzężonych są przenoszone przez ten sam
chromosom, została przyjęta nazwa faza sprzężenia. Geny dominujące
z tych loci mogą się znajdować w tym samym chromosomie i wtedy
mówimy, że są one w fazie przyciągania (cis), bądź w różnych chromosomach i
jest to faza odpychania (trans).

153

Ewentualne sprzężenie cech najłatwiej jest sprawdzić krzyżując osobniki

heterozygotyczne z homozygotami recesywnymi — jest to klasyczne

krzyżowanie testowe.

Zatem rodzicielski układ alleli wystąpił u 172 osobników (są to typy

rodzicielskie fenotypu), natomiast pozostałe 39 miało genotypy rekom-

binacyjne (osobniki takie są nazywane rekombinantami). W danym przy-

kładzie rekombinanty stanowią około 18,5% całego potomstwa z tej krzyżów-

ki. Procent rekombinacji przyjęto za jednostkę odległości między genami,

której symbolem jest cM (centymorgan, od nazwiska twórcy chromosomowej

teorii dziedziczenia Tomasza Morgana), czyli l cM = 1% rekombinacji.

W naszym przykładzie odległość między loci B i V wynosi 18,5 cM.

Doświadczalnie zostało udowodnione, że cechy sprzężone dają w krzyżów-

kach zawsze zbliżony procent rekombinantów. Wynika to z tego, iż częstość,

z jaką crossing over zachodzi między sprzężonymi loci, jest stała.

W przedstawionym wyżej przykładzie nie została uwzględniona moż-

liwość zajścia podwójnego crosing over. Podwójny crossing over zachodzi

znacznie rzadziej niż pojedynczy. Można jednak przewidzieć częstość

występowania podwójnego crossing over, jest ona iloczynem częstości

przypadków pojedynczych crossing over. Na przykład, jeśli pojedynczy

154

crossing over w obszarze I zachodzi z częstością 0,02 (2%), a w obszarze

II — 0,05 (5%), to częstość występowania podwójnego crossing over

wynosi 0,02x0,05 = 0,001, czyli 0,1%. Jest to jednak wartość przybliżona,

gdyż w naturze jest ona niższa. Przyczynę stanowi to, iż zajście crossing

over w jakimś odcinku chromosomu zmniejsza prawdopodobieństwo

drugiego crossing over w pobliżu tego odcinka. Zjawisko to nosi nazwę

interferencji.

Rekombinanty są osobnikami mającymi nowe kombinacje genów sprzę-

żonych. Jeśli jednak zajdzie podwójny crossing over, układ genów będzie

taki, jak przed tą wymianą i nie będzie można odróżnić rekombinantów.

Skutkiem tego będzie zmniejszona liczba rekombinantów i błąd w obliczeniu

odległości między loci sprzężonymi. By tego uniknąć, stosuje się tzw.

krzyżówki trzypunktowe, umożliwiające dokładne ustalenie położenia loci

względem siebie. Jeśli przyjmiemy, że kolejność ułożenia loci w chromosomie

jest następująca: A-B-C, to obliczona odległość między loci A i C powinna

być sumą odległości między A i B oraz B i C.

Sposób ustalenia sprzężenia między trzema genami przedstawiony

zostanie na omawianym przykładzie muszki owocowej. Trzecią cechą

rozpatrywaną będzie kolor oczu. U muszki owocowej dominuje czerwony

kolor oczu (dziki), a gen recesywny c (cinnabar), warunkuje kolor cynobrowy.

Również w tej krzyżówce, w celu lepszego uwidocznienia efektu crossing

over, allele dominujące będą oznaczone literami alfabetu, a nie za pomocą

przyjętego dla nich symbolu „ + ".

Jeśli skrzyżujemy osobniki różniące się allelami w trzech loci sprzężo-

nych, to na podstawie fenotypów potomstwa wykryjemy wszystkie

przypadki pojedynczych i podwójnych crossing over między skrajnymi loci.

Ponadto możliwe będzie ustalenie kolejności ułożenia trzech rozpatry-

wanych loci w chromosomie.

W pokoleniu rodzicielskim jedna płeć musi mieć genotyp potrójnie

heterozygotyczny:

Natomiast drugi rodzic ma genotyp:

W wyniku pojedynczego crossing over w obszarze I między genami

B i C powstaną gamety bCV i Bcv, natomiast skutkiem pojedynczego

crossing over w obszarze II między genami C i V będą gamety BCv i bcV.

Z kolei, podwójny crossing over w obszarze I i II da gamety o następującym

zestawie alleli: bCv i BcV.

155

W potomstwie uzyskano następujące genotypy i liczebności:

Obliczanie odległości między loci sprzężonymi:

Odległość między genami B i C jest stosunkiem sumy rekombinantów

powstałych w wyniku crossing over w I obszarze i rekombinantów

powstałych po podwójnym crossing over do wszystkich fenotypów, wyra-

żonym w procentach:

Analogicznie do tego odległość między loci C i V wynosi:

Odcinek chromosomu 2 Drosophila melanogaster zawierający rozpatrywane
loci wygląda następująco:

Dla każdej grupy genów sprzężonych można ustalić odległości między

nimi oraz ich wzajemne położenie w chromosomie. W ten sposób tworzone

są mapy genetyczne. Odległości mapowe są obliczone z częstości rekom-

binacji między analizowanymi genami i kolejno sumowane. W celu okreś-

156

lenia, w którym chromosomie znajduje się dana grupa genów sprzężonych,
należy zastosować inne metody badania (cytogenetyczne). Powstaje wówczas
mapa fizyczna. O mapach genetycznych i fizycznych oraz ich zastosowaniu
jest mowa w rozdziale: Mapy genomowe. W rozdziale tym pokazano m.in.,
że odległości genetyczne między sprzężonymi loci szacuje się za pomocą
funkcji Kosambiego.

6.1.4. Cechy sprzężone z płcią

Cechy, których geny są umieszczone w chromosomach płci, nazywamy
cechami sprzężonymi z płcią. Najczęściej zjawisko to odnosimy do położenia
genu w chromosomie X ssaków lub chromosomie Z ptaków. Dzieje się tak
dlatego, że chromosomy te mają nieporównywalnie więcej loci genów niż
chromosom Y (ssaki) i chromosom W (ptaki). Sposób ich dziedziczenia jest
inny niż cech autosomalnych. U zwierząt płci heterogametycznej wszystkie
cechy sprzężone z płcią zależą od jednego genu, a nie — jak u płci
homogametycznej — od pary genów.

U ssaków samice są homogametyczne (XX), samce zaś heterogametyczne

(XV). Natomiast u ptaków płcią homogametyczną są samce (określane dla
odróżnienia od ssaków — ZZ), a heterogametyczną samice (ZW).

Sposób dziedziczenia cechy sprzężonej z płcią obrazuje poniższy przykład.

Cecha zmniejszonej krzepliwości krwi (hemofilia), występująca u ludzi,

psów i niektórych zwierząt gospodarskich, uwarunkowana jest recesywnym
genem h. Dominujący allel z tej pary (H) warunkuje prawidłową krzepliwość
krwi.

Wszystkie możliwe fenotypy i genotypy pod względem tego locus

można zapisać symbolami w dwojaki sposób:

Fenotyp

Samice Samce

Jak wynika z tego zestawienia, samce nie mogą być heterozygotami

(nosicielami genu hemofilii), ponieważ genotyp cechy sprzężonej z płcią
wyznaczany jest u nich tylko jednym genem.

Układ genetyczny polegający na tym, iż u osobnika diploidalnego

występuje tylko jeden gen z danej pary, nazywamy hemizygotycznym,
a osobnika — hemizygotą. Gdy płeć heterogametyczną ma cechę dominującą,
a pleć homogametyczną cechę recesywną, obserwujemy zjawisko dziedzi-
czenia na krzyż (córki dziedziczą po ojcu, a synowie po matce). Gdy jest
odwrotny układ (cecha dominująca u osobnika homogametycznego), cecha
będzie się dziedziczyć tak jak prosta cecha autosomalna.

157

Ryć. 6-3. Dziedziczenie barwy upierzenia u kur — cecha sprzężona z płcią, w pokoleniu

F, „dziedziczenie na krzyż"

Dziedziczenie na krzyż przedstawiono na rycinie 6-3 na przykładzie

jastrzębiatości upierzenia u kur:

Gen B, warunkujący cechę jastrzębiatości upierzenia, dominuje nad jego

allelem b (gen czarnej barwy upierzenia). Gen ten hamuje okresowo

odkładanie się czarnego pigmentu podczas wzrostu pióra. Skutkiem tego jest

obecność czarnych i jasnych prążków w chorągiewce. Obecność w genotypie

dwóch kopii genu B zahamowuje odkładanie pigmentu na dłuższy okres niż

obecność jednego genu. Dlatego koguty homozygotyczne pod względem tego

genu są jaśniejsze niż hemizygotyczne kurki (ryć. 6-4 wkładka kolorowa).

Cechy sprzężone z płcią wykorzystano w hodowli kur do wytworzenia

ras lub mieszańców autoseksingowych, tj. takich, u których zaraz po

158

wykluciu można rozróżnić płeć. Rasą autoseksingową są polbary, wy-
tworzone przez polską badaczkę Laurę Kaufman, mające gen jastrzębiatego
upierzenia. Do produkcji mieszańców autoseksingowych można wykorzystać
geny srebrzystości (np. rasa sussex) i złocistości upierzenia (rhode island
red), geny kontrolujące tempo opierzania się skrzydeł i ogona (K-k) czy gen
karłowatości (dw, ang. dwarf — karłowaty).

Gen karłowatości u homozygotycznych (dwdw) samców wpływa na

zmniejszenie masy ciała osobnika dorosłego o około 40% w porównaniu
z ptakiem dorosłym. Natomiast kury mające ten gen (dw-) zużywają około
25% mniej paszy niż kury o genotypie Dw-. Potomstwo (brojlery) pochodzące
z kojarzenia koguta DwDw z kurą dw- będzie miało masę ciała tylko o 3%
mniejszą niż brojlery po normalnych rodzicach. Taki dobór par rodzicielskich
jest opłacalny z ekonomicznego punktu widzenia.

Ciekawym przykładem cech sprzężonych z płcią u kotów jest czarna

i ruda barwa sierści, warunkowana przez locus O (ang. orange), zlokalizo-
wany w chromosomie X. Samce mogą być tylko czarne (o-) lub rude (O-).
U samic heterozygotycznych występuje umaszczenie szylkretowe — część
włosów czarnych, inne — rude (genotyp Oo) (ryć. 6-5 wkładka kolorowa).
Jest ono następstwem tego, iż allele czarnego i rudego umaszczenia ujawniają
się fenotypowo niezależnie od siebie, co wynika z losowości inaktywacji
chromosomu X pochodzenia ojcowskiego lub matczynego podczas rozwoju
zarodkowego.

U zwierząt domowych jest wiele cech sprzężonych z płcią, część z nich

przedstawiono w rozdziale: Mutacje.

Znane są przypadki cech sprzężonych z płcią warunkowanych szeregiem

alleli wielokrotnych. Barwa upierzenia u gołębi jest kontrolowana przez
szereg złożony z trzech alleli: B

(popielatoczerwone), B (niebieskie -

dzikie) i b (czekoladowe).

Nie wszystkie cechy typowe dla danej płci są sprzężone z chromosomem

X. Niektóre z nich to tzw. cechy związane z płcią. Geny warunkujące te
cechy należą do autosomalnych (umieszczone w autosomach), ale ich
ekspresja jest uzależniona od płci. Osobniki męskie i żeńskie, mając taki sam
genotyp, mogą się różnić fenotypowo. Przykładem takiej cechy jest rogatość
owiec rasy dorset horn. Zwierzęta homozygotyczne pod względem domi-
nującego genu bezrożności będą bezrogie niezależnie od płci, natomiast
osobniki homozygotyczne recesywne będą rogate. Różnice w fenotypie
wystąpią u zwierząt heterozygotycznych — samce będą rogate, samice zaś
bezrogie. Różna ekspresja fenotypowa tego samego genotypu u osobników
obu płci jest następstwem oddziaływania hormonów wytwarzanych przez
daną płeć. Innymi przykładami cech związanych z płcią są: mahoniowo-białe
i czerwono-białe umaszczenie bydła rasy ayrshire oraz broda u kozłów.

Wpływ płci na fenotypowa ekspresję genów jest także obserwowany

w przypadku cech, których założenia genetyczne znajdują się u osobników
obu płci, ale ujawniają się tylko u jednej płci. Cechy te nazywane są cechami

159

ograniczonymi płcią lub ograniczonymi do płci. Należą do nich: zdolność

wydzielania mleka u samic ssaków, nieśność samic ptaków, wnętrostwo czy

przepuklina mosznowa u samców.

6.1.5. Plejotropia

O plejotropii mówimy wówczas, kiedy jeden gen oddziałuje na powstanie

kilku cech. Plejotropia może być właściwa lub rzekoma. Plejotropia właściwa

występuje wtedy, gdy gen plejotropowy oddziałuje na kilka odrębnych

ośrodków. Przykładem jest gen warunkujący platynową barwę u lisów. Lisy

platynowe w przeciwieństwie do osobników umaszczonych standardowo

są mniej żywotne i bardziej pobudliwe. Osobniki homozygotyczne pod

względem tego genu nie są zdolne do życia i zamierają w okresie

prenatalnym. Podobnie gen warunkujący siwą (sziras) barwę włosów

u karakułów powoduje śmierć jagniąt homozygotycznych w wieku 4-9

miesięcy. Również u koni niektóre geny umaszczenia wykazują działanie

plejotropowe. Na przykład u około 1/4 potomstwa pochodzącego z kojarze-

nia między sobą koni srokatych (overo) występuje zespół „białych źrebiąt",

opisany w podrozdziale: Dziedziczenie umaszczenia. W podrozdziale tym

omówiony jest także plejotropowy efekt genów umaszczenia u innych

gatunków zwierząt.

Przyczyny plejotropii właściwej mogą mieć podłoże biochemiczne. Na

przykład gen warunkuje syntezę enzymu, który bierze udział w syntezie

jakiegoś związku (np. hormonu). Z kolei ten związek ma różnorodne

funkcje fizjologiczne, wpływa zatem na inne właściwości organizmu.

W przypadku plejotropii rzekomej gen kontroluje jakąś cechę, która z kolei

rzutuje (w zależności od wpływów środowiska) na zróżnicowanie innych cech.

Na przykład gen warunkujący szurpatość (zmiany w budowie piór) u drobiu

wpływa także m.in. na tempo przemiany materii, pracę serca i aktywność

procesów trawiennych. Zmiany te są jednak następstwem nieprawidłowego

opierzenia, które nie chroni ptaka przed nadmierną utratą ciepła.

6.2. Współdziałanie genów z różnych loci w

kształtowaniu fenotypu

W omawianych dotychczas przykładach jedna para współdziałających ze

sobą genów allelomorficznych warunkowała powstanie jednej cechy. Jed-

nakże nie tylko geny należące do tej samej pary mogą współdziałać ze sobą

w wytworzeniu cechy. W przypadku wielu cech geny z różnych par alleli,

w wyniku łącznego działania, powodują pojawienie się nowej formy cechy

jakościowej.

160

Gen R warunkuje kształt różyczkowy grzebienia, a jego allel r — pojedynczy,

natomiast gen P powoduje powstanie grzebienia groszkowego, jego allel

p — grzebienia pojedynczego (ryć. 6-6b wkładka kolorowa). Typ grzebienia

pojedynczego jest zatem recesywny zarówno w stosunku do grzebienia

groszkowego, jak i różyczkowego, warunkujący go genotyp to podwójna

homozygota recesywna — rrpp. W wyniku współdziałania genów R i P po-

wstaje czwarta forma cechy — grzebień orzeszkowy, której genotyp może

mieć kilka różnych wariantów, gdyż wystarczy obecność jednego genu

dominującego z każdej pary alleli (R_P_).

Z krzyżowania osobników o ustalonej cesze kształtu grzebienia, tj.

z grzebieniem różyczkowym (Rrpp) i groszkowym (rrPP), w pokoleniu

Ej wszystkie ptaki będą podwójnymi heterozygotami RrPp i będą miały

grzebień orzeszkowy. Natomiast w pokoleniu F

nastąpi rozszczepienie

cech w stosunku 9 orzeszkowych : 3 różyczkowe : 3 groszkowe : l pojedyn-

czy. Różnice między wynikami tego krzyżowania a krzyżowania uwzględ-

niającego dwie niezależnie dziedziczące się cechy polegają na tym, że

w pokoleniu F

pojawia się nowy fenotyp, całkowicie różny od obojga

rodziców, natomiast w pokoleniu F

, w którym wystąpią 4 fenotypy

w stosunku 9:3:3:1, pojawia się również nowy typ — grzebień pojedynczy,

którego nie było w dwóch pokoleniach przodków.

Dwa dominujące geny z różnych par alleli, współdziałające razem

i wytwarzające odmienną formę cechy niż ta, która powstaje w wyniku

działania każdego z nich osobno, nazywamy genami komplementarnymi

lub dopełniającymi się.

6.2.2. Epistaza

Kolejnym rodzajem współdziałania genów nieallelicznych jest epistaza,

charakteryzująca się tym, że od obecności genu z określonej pary alleli

zależy ekspresja innej pary alleli. Gen, który hamuje ujawnienie się genu

z innej pary, nazywany jest genem epistatycznym, natomiast gen hamowany

to gen hipostatyczny.

Zjawisko epistazy występuje na przykład w dziedziczeniu umaszczenia

u świń niektórych ras biało umaszczonych. Gen dominujący z locus I

(inhibitor) hamuje ujawnienie się barwy kolorowej mimo obecności w ge-

notypie genów barwnego umaszczenia.

Zjawisko epistazy może wyjaśnić poniższy przykład. Kury niektórych

ras (np. wyandotte, plymouth rock) mają upierzenie białe, gdyż brak w ich

genotypach genu C, warunkującego wytwarzanie pigmentu (melaniny)

w piórach. Ich genotyp pod względem tej pary alleli jest homozygota

recesywna (cc), która blokuje syntezę tyrozynazy — enzymu biorącego

udział w wytwarzaniu melaniny. U białych leghornów jest inna sytuacja,

podobna do wspomnianej wyżej u świń. Ptaki te są również białe, ale mają

162

Ryć. 6-7. Różny stopień białej plamistości spowodowany działaniem genów modyfiku-

jących

w swych genotypach gen C. Działanie tego genu jest jednak hamowane

przez inny dominujący gen z locus I, który w układzie homozygotycznym

całkowicie uniemożliwia syntezę melaniny w piórach. Genotyp leghornów

pod względem barwy upierzenia jest następujący: IICC. W potomstwie F

którego dziadkowie należeli do dwóch ras białych — leghornów i wyandotte

(iicc), oprócz ptaków białych pojawią się osobniki o upierzeniu barwnym

w stosunku 13 białych : 3 barwnych.

Podobnie umaszczenie białe u świń jest wynikiem epistatycznego

działania genów z locus L Genotyp biało umaszczonych świń (np. rasy

wielkiej białej i landrace pod względem trzech podstawowych loci jest

następujący: aa II E

, natomiast czarno umaszczonych (np. rasy cornwall):

aa ii EE. Allele z locus E i A są opisane w dalszej części tego rozdziału,

dotyczącej dziedziczenia umaszczenia.

Gen epistatyczny nie zawsze jest dominujący w swojej parze. W przypad-

ku albinizmu układ epistatyczny w stosunku do genów barwy stanowią

dwa geny recesywne cc (z tego samego locus co gen C). Inne przykłady

epistatycznego współdziałania genów nieallelicznych przedstawione są także

w podrozdziałach: Dziedziczenie umaszczenia i Antygeny erytrocytarne.

Przedstawiony wcześniej rodzaj współdziałania komplementarnego jest

także formą oddziaływania epistatycznego genu dominującego jednej pary

wobec układu homozygotycznego recesywnego drugiej pary. Jednak nie

zawsze jedna para genów maskuje ekspresję tylko jednej innej pary genów.

Geny epistatyczne mogą tłumić działanie wielu innych par.

6.2.3. Geny modyfikujące

Istnieje pewna grupa genów, które modyfikują przejawianie się jakiejś

prostej cechy, warunkowanej zwykle jedną parą genów. Geny te, zwane

modyfikatorami, powodują duże zróżnicowanie cechy u osobników o jed-

nakowych założeniach warunkujących tę cechę. Na przykład geny mo-

dyfikatory wpływają na zasięg i rozmieszczenie białych plam u bydła

(ryć. 6-7), psów i kotów, mimo iż cecha łaciatości warunkowana jest

inną parą alleli.

163

6.2.4. Sumujące działanie genów

Inną formą współdziałania nieallelicznego genów jest polimeria. Zjawisko

to polega na tym, iż wiele (nawet kilkadziesiąt) genów z różnych loci

warunkuje jedną cechę, powodując różne jej nasilenie, zależne od sumują-

cego się ich działania. Geny te nazywane są genami polimerycznymi,

addytywnymi lub poligenami. Ich sumujące się działanie jest podstawą

dziedziczenia cech ilościowych (np. wydajność mleczna, nieśność itd.).

Należy pamiętać, że kształtowanie się tych cech zależy również od wpływu

czynników środowiskowych. Mechanizm działania genów połimerycznych

omówiony jest w podrozdziale: Zmienność cech ilościowych.

6.3. Dziedziczenie umaszczenia

Umaszczenie zwierząt zależy przede wszystkim od pigmentu zawartego we

włosach i piórach. Synteza, rozmieszczenie i wielkość ziarenek tego pigmentu

są determinowane genetycznie przez wiele różnych loci, ale czynniki

środowiskowe mogą modyfikować umaszczenie, wpływając na przykład na

zmianę ilości wytwarzanego pigmentu. U wielu zwierząt ubarwienie sierści

zmienia się w zależności od pory roku (np. biała w zimie, a czarna lub

brązowa w lecie). Zmiany te spowodowane są działaniem niektórych

hormonów, takich jak gonadotropiny, kortykotropina i hormon melano-

tropowy — MSH (ang. melanocyte stimulating hormone).

U ptaków większość kolorów jest związana z obecnością pigmentów

karoteinowych, natomiast u ssaków pigmentacja zależy od syntezy i roz-

mieszczenia melanin w rdzeniu włosa i korze włosowej oraz naskórku skóry

właściwej.

Wyróżnia się dwa podstawowe typy melanin — eumelaniny (kolor

brązowy lub czarny), syntetyzowane z metabolitów DOPA-chromu, i feo-

melaniny (kolor czerwony lub żółty), wytwarzane z metabolitów cysteinylo-

-DOPA-chinonu.

Enzymem włączonym w syntezę obu typów pigmentu jest tyrozynaza.

Jest to enzym zawierający miedź i katalizujący trzy różne reakcje w procesie

biosyntezy melaniny (ryć. 6-8):

1) hydroksylację tyrozyny do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA)

2) oksydację DOPA do DOPA-chinonu

3) oksydację 5,6-dihydroksyindolu (DHI) do indolochinonu.

Niski poziom tyrozynazy prowadzi do wytwarzania feomelaniny, natomiast

wysoki poziom tyrozynazy powoduje produkcję eumelaniny.

Do niedawna uważano, iż tyrozynaza jest jedynym enzymem niezbęd-

nym do wytwarzania pigmentu. Ostatnie badania wykazały, że przypusz-

czalnie również inne geny specyficzne dla procesu syntezy pigmentu mogą

modulować pigmentację.

164

Ryć. 6-8. Schemat biosyntezy melaniny

Aktywność tyrozynazy jest regulowana przez hormon melanotropowy

(MSH) i receptor MSH. Hormon melanotropowy, zwany również in-
termedyną lub melanotropiną, jest wytwarzany przez część pośrednią
części gruczołowej przysadki. Hormon ten stymuluje produkcję poszcze-
gólnych melanin na przemian. Reakcja na działanie tego hormonu jest
kontrolowana przez locus A (Agouti). Natomiast receptor hormonu me-
lanotropowego (MSH) kontroluje poziom tyrozynazy wewnątrz melanocytu.
Receptor ten jest determinowany przez locus E (Extension). Następstwem
działania tego receptora jest wzrost poziomu tyrozynazy i produkcja
eumelaniny. Główną jego funkcją natomiast jest regulacja syntezy czarnego
pigmentu (eumelanina), a hamowanie produkcji feomelaniny wewnątrz
melanocytów.

Melaniny są wytwarzane w melanocytach. Melanocyty pochodzą

z rdzenia nerwowego, a podczas rozwoju embrionalnego wędrują do
powstającej skóry. Ta wędrówka melanocytów znajduje się pod ścisłą
kontrolą genów.

W determinację koloru jest włączonych wiele loci. Wiele genów, jeśli nie

wszystkie związane z wytwarzaniem pigmentu, ma działanie plejotropowe
na rozwój i różnicowanie organizmu.

Wytwarzanie melanin u ssaków jest kontrolowane przez geny działające

na różnych poziomach: tkankowym, komórkowym i subkomórkowym.

REGULACJA NA POZIOMIE TKANKOWYM

Regulacja genetyczna na poziomie tkankowym polega na kontroli liczby
i rozmieszczenia melanocytów. Jest wiele genów, które współdziałają ze
sobą w sposób kompleksowy. Geny, które zostały już sklonowane, warun-
kujące pigmentację ssaków i działające na poziomie tkankowym to przede
wszystkim: gen srokatości (Piebaldism) i gen nabytego bielactwa (Vitiligo).
Badania genetycznego tła umaszczenia są najbardziej rozwinięte w od-

165

niesieniu do myszy. Do loci działających na poziomie tkankowym,
zmapo-wanych w genomie myszy należą także loci: Splotch (Sp) - -
plamisty, Dominant White Spotting (W) - - dominujący biały nakrapiany i
Steel (Sl) - stalowy.

REGULACJA NA POZIOMIE KOMÓRKOWYM

Geny regulujące wytwarzanie pigmentu na poziomie komórkowym od-
działują na strukturę i/lub funkcje istniejących melanocytów, co wpływa na
koloryt (układ barw). Należą do nich geny z loci D (Dilute — rozjaśniony),
E (Extension - - pełna barwa), A (Agouti — dziki), Pa (Pallid — blady)
i P (Pink-eyed dilution — gen rozcieńczonych różowych oczu). Mutacje
w tych loci wpływają wyraźnie na kolor oczu, w jednolity typowy sposób,
przez działanie na mechanizmy włączone w funkcję melanocytu. Większość
z tych mutacji ma wpływ plejotropowy na rozwój.

Locus D koduje strukturalne białko, które wydaje się istotne dla rozdziału

ziaren melaniny do peryferyjnych melanocytów. U osobników ze zmutowa-
nym allelem w locus D dendryty melanocytów są istotnie mniej rozwinięte
niż u osobników normalnych (typu dzikiego), a konsekwencją tego jest
ograniczenie rozdziału melanosomów i rozjaśniony kolor włosów.

Locus E (Extension) koduje przede wszystkim receptor MSH, pełniący

istotną rolę w interakcji melanocytów z hormonem melanotropowym. Locus
ten kontroluje ilość eumelaniny.

Locus A (Agouti) kontroluje syntezę białka będącego antagonistą receptora

MSH i mającego zdolność blokowania działania tego receptora. Następstwem
działania tego białka jest niski poziom tyrozynazy i wytwarzanie feomela-
niny. Na przykład u bydła zwierzęta homozygotyczne ee będą umaszczone
żółto lub czerwono.

U osobników typu dzikiego, nazywanych agouti, melanocyty wytwarzają

w różnym czasie eumelaninę lub feomelaninę, oba typy melanin nie są więc
syntetyzowane jednocześnie.

Locus Agouti działa wewnątrz mikrośrodowiska mieszków włosowych,

podczas gdy locus Extension działa w melanocytach.

REGULACJA NA POZIOMIE SUBKOMÓRKOWYM

Melanogeneza jest regulowana także na poziomie subkomórkowym (en-
zymatycznym), gdzie krytyczną rolę odgrywa synteza i ekspresja różnych
melanogenicznych enzymów i inhibitorów. Geny, które działają na pigmen-
tację ssaków na poziomie subkomórkowym, wpływają bezpośrednio na
ilość i typ wytwarzanej melaniny. W wyniku ich działania może nastąpić
istotny wzrost lub zmniejszenie ilości pigmentu tworzonego w melanocytach
(np. brak syntezy melaniny w przypadku albinizmu), lub też mogą wystąpić
zmiany typu syntetyzowanej melaniny (np. odwracalna zamiana wy-
twarzania czarnej eumelaniny na produkcję żółtej feomelaniny).

166

Najważniejsze z loci działających na poziomie subkomórkowym to

Albina (C) i Brown (B).

Locus C kontroluje liczbę i intensywność ziaren pigmentu. Historycznie był

on uważany za locus strukturalny dla tyrozynazy, gdyż białkiem kodowanym
przez ten locus jest enzym tyrozynaza, której funkcja jest decydująca dla
wytwarzania pigmentu. Tyrozynaza przejawia swą ekspresję w melanocytach.

Mutacje w locus C powodują brak pigmentu we włosach, skórze

i tęczówce oka, ale mutacje te mają także wpływ plejotropowy jeszcze
dokładnie nie poznany. Jednym ze znanych efektów plejotropowego
działania mutacji w tym locus jest zaburzenie czucia.

Interesujące jest to, iż mutacja w genie tyrozynazy u myszy jest

pojedynczą mutacją punktową, natomiast u ludzi stwierdzono ponad 30
mutacji powodujących albinizm, ale są to mutacje typu nonsens, zmiany
sensu i mutacje zmiany fazy odczytu. Niekiedy mutacje w locus Albino
powstają podczas składania mRNA (splicingu), czyli wycinania intronów,
a konsekwencją tego jest synteza białka o zmienionej sekwencji amino-
kwasowej. Takie białka nie są kompetentne katalitycznie, ale dotychczas nie
stwierdzono, czy pełnią one jakąś rolę (np. inhibitora) w melanocytach.

Badania poszczególnych mutacji w locus Albino u królików, warun-

kujących umaszczenie himalajskie i szynszylowate, wykazały, że melanocyty
mutanty wytwarzają tyrozynazę z istotnie zmienioną aktywnością katalitycz-
ną. Mutacja umaszczenia himalajskiego (c

) polega na zmianie w glikozylacji,

która powoduje uwrażliwienie efektu fenotypowego na temperaturę. U szyn-
szyla (c

) natomiast zwiększona jest wrażliwość na inaktywację proteolitycz-

ną, prowadząca do osłabienia funkcji enzymu. Geny z locus C u królików
tworzą szereg alleli wielokrotnych, w którym występuje dominacja w na-
stępującej kolejności: C, c

, c

, c (ryć. 6-9 wkładka kolorowa).

Tyrozynaza jest najistotniejszym enzymem w wytwarzaniu melaniny,

natomiast inne geny regulują typ formowanego pigmentu, jeszcze inne —
sposób, w jaki pigment ma być formowany.

Locus B (Brown) — struktura i organizacja genu z tego locus jest podobna

do genu Albino, a białko kodowane przez ten gen ma wszystkie cechy
charakterystyczne dla tyrozynazy. Specyficzna funkcja tego białka nie jest
jeszcze poznana. Fenotypowym efektem mutacji w genie Brown jest wytwa-
rzanie brązowej mełaniny, ale mechanizm działania tego genu dotąd nie jest
znany. Wiadomo jednak, iż kolor brązowy wynika z punktowej mutacji
w obrębie genu Brown, która prowadzi do wymiany cysteiny na tyrozynę.
Mutacja ta zachodzi w bogatej w cysteinę pierwszej domenie białka.

Mechanizm dziedziczenia umaszczenia u zwierząt futerkowych
na przykładzie lisa

Istnieją dwa gatunki lisa — lis pospolity (Vulpex vulpex) i lis polarny (Alopex
lagopus). Umaszczenie u obu gatunków determinowane jest głównie genami
z podstawowych loci — A, B i E. Warunkiem ekspresji genów z tych loci jest

167

oczywiście obecność odpowiednich genów z locus C. W przypadku genotypu
homozygoty recesywnej cc będzie fenotyp albinotyczny, bez względu na to,
jakie są geny z innych loci.

Genotypy umaszczenia różnych odmian lisa pospolitego i polarnego są

przedstawione w tabeli 6-1.

U lisa pospolitego w locus A są dwa allele: A

— dominujący i a -

recesywny. Allel A

warunkuje wstrzymanie wytwarzania eumelaniny. Jego

alternatywny allela w podwójnej dawce warunkuje umaszczenie czarne lisa
srebrzystego. Natomiast u lisa polarnego zamiast allelu A jest allel A". Allel
ten odpowiedzialny jest za eliminację eumelaniny. Feomelanina, która
z reguły zajmuje miejsce eumelaniny, u lisa polarnego jest rozcieńczona lub
usunięta w ogóle. Lis polarny o genotypie aa jest czarny, ale genotyp ten
występuje bardzo rzadko (np. w populacji lisa polarnego w Islandii).

W locus B również są dwa allele — dominujący B (czarny pigment) i b,

w układzie homozygotycznym -- pigment czekoladowobrązowy. Jedynie
odmiana burgundzka lisa pospolitego jest homozygotyczna pod względem
allelu b.

W locus E, warunkującym wytwarzanie czarnej/czekoladowobrązowej

eumelaniny, u obu gatunków są dwa allele — E i E

. Allel E w układzie

homozygotycznym nie ma wpływu na umaszczenie, w tym przypadku
kolor jest determinowany allelami z locus A. U obu gatunków lisa allel E

cechuje się niezupełną dominacją.

Oprócz omawianych loci u lisa pospolitego występuje szereg innych loci,

jak G, P, S, R, W, warunkujących różne odmiany umaszczenia. We wszystkich
tych loci, z wyjątkiem locus W, efekt fenotypowy dają tylko genotypy
homozygotyczne recesywne: u lisa burgundzkiego -- genotyp gg, u lisa

168

srebrzystego: genotyp pp - - perłowe umaszczenie oraz genotyp ss —
umaszczenie perłowe Mansfield i rr — umaszczenie Radium. W locus W są
następujące allele: w, W (białopyski), W (platynowy), W

(biały Georgian)

i W

(gen marble), przy czym genotyp ww występuje u lisa rudego

i srebrzystego, natomiast gen marble daje inny efekt fenotypowy u tych
odmian. Mutacje dominujące, takie jak W i W, w układzie homozygotycz-
nym mają efekt letalny. Letalny jest także genotyp WW.

U lisa polarnego na wiele odmian umaszczenia wpływają allele recesywne

(w homozygocie) z loci: D (dd — biały polarny, DD — niebieski), F (ff — szafir)
i G (gg — arktyczny niebieski) oraz u lisa niebieskiego allele dominujące z loci
l (L — Laponia), s (trzy allele: S, S

i S

) i t (T). Mutacja w locus s (Shadow)

charakteryzuje się heterochromią, której skutkiem może być różny kolor oczu
u tego samego osobnika, np. jedno oko niebieskie, a drugie brązowe.

Genetyczne podłoże umaszczenia u bydła

Wyniki wielu badań sugerują, że u bydła umaszczenie czarne, brązowe
i czerwone jest determinowane przez allele z dwóch loci: Extension (E) i
Agouti (A).

Locus E koduje syntezę białka MSH-R (ang. melanocyte stimulating hormon

receptor), złożonego z około 350 aminokwasów. W locus tym, umiejscowionym
w chromosomie 18, są 3 allele: E

warunkujący umaszczenie czarne dominują-

ce, recesywny allel e, który w układzie homozygotycznym warunkuje
umaszczenie czerwone, oraz allel E

umożliwiający ekspresję alleli z locus A.

Allele te powstały w wyniku mutacji punktowych, opisanych w rozdziale:
Mutacje. Allel dominujący E

, kodujący czarny kolor, jest homologiczny do

allelu E

0 u myszy. W łańcuchu polipeptydowym kodowanym przez allel E

nastąpiła zamiana trzech kolejnych cząsteczek leucyny na aminokwasy
leucyna-prolina-leucyna, natomiast u bydła ten sam fragment alłelu E

koduje

następującą kolejność aminokwasów: prolina-leucyna-leucyna.

Locus A koduje syntezę białka, będącego antagonistą białka MSH-R.

W locus tym są dwa allele: dominujący A

(synteza pigmentu brązowego)

i recesywny a. Allele z tego locus mogą wykazać ekspresję tylko wtedy, gdy
w locus E jest genotyp E

_. U zwierząt z genotypem E

lub E

e allel A

koduje umaszczenie brązowe, natomiast allel a w układzie homozygotycz-
nym — recesywne czarne.

Fenotypy czarny dominujący (determinowany przez allel E'') i czarny

recesywny są nieodróżnialne. Niestety dotychczas nie przeprowadzano
badań molekularnych locus A.

Wyniki badań porównawczych wskazują na homologię działania alleli z locus

Extension (E) u bydła i myszy. Wszystkie allele dotychczas zidentyfikowane
w locus E u bydła mają odpowiadające im allele u myszy, natomiast w locus
A tylko w przypadku allelu recesywnego a jest analogiczny allel u myszy. Z kolei
allel A

u bydła wydaje się wywoływać efekt różny od działania większości

innych alleli z locus Agouti (A) opisanych dotychczas u ssaków.

169

Wiele innych loci bierze udział w determinacji różnych odmian umasz-

czenia. Na przykład, cecha jednolitego umaszczenia lub łaciatości znajduje
się pod kontrola genów z locus S (Self): dominujący S — jednolite
umaszczenie, recesywny s — łaciatość. U ras bydła (np. belgijskie błękitne),
u których allel s jest utrwalony, obserwowana jest zmienność w ekspresji
cechy łaciatości, niektóre zwierzęta są niemal całkowicie pozbawione
pigmentowanych łat. W tym samym locus u bydła tej rasy znajduje się allel
S

, warunkujący fenotyp nazwany colorsided — łaciaty, który dominuje nad

s, ale jest recesywny w stosunku do allelu S.

U niektórych ras bydła pewne geny wykazują niekorzystne działanie

plejotropowe, powodując różne zaburzenia. Przykładem jest zmapowany
w 5 chromosomie locus Roan — dereszowate (krasę, mroziate), w którym są
dwa allele: r

czarny (u bydła błękitnego belgijskiego) lub czerwony (u bydła

rasy shorthorn) i R biały. U jałówek obu ras locus Roan wpływa istotnie na
występowanie choroby białych jałowic, kora jest efektem plejotropowego
oddziaływania allelu R na płodność. Choroba ta jest opisana w rozdziale:
Determinacja i różnicowanie płci oraz interseksualizm. Zróżnicowanie umasz-
czenia — czerwone lub czarne wynika z tego, że bydło belgijskie błękitne
charakteryzuje duża frekwencja allelu dominującego E w locus Extension, a mała
allelu e (czerwone umaszczenie), natomiast u shorthornów jest odwrotnie.

Genetyczne podłoże umaszczenia u świń

U świń znane są cztery główne loci determinujące umaszczenie: locus
A (Agouti), locus E (Extension), locus I (biały dominujący) i locus Be (Belted -
opasany).

W locus A zidentyfikowano dwa allele: A

(agouti biały brzuch) i allel

a - - nieagouti. Allel A

jest obecny u dzikich świń i jest dominujący

w stosunku do pozostałych kolorów oraz koloru mangalica, ale recesywny
w stosunku do białego (I). Większość ras świń udomowionych ma allel
recesywny a — nieagouti.

W locus E stwierdzono dotychczas trzy allele: E — umaszczenie jednolite

czarne jak w rasie wielkiej czarnej, cornwall i hampshire, E

— umaszczenie

czarne nakrapiane (spotting) jak u berkshire, poland-china i pietrain, e -
umaszczenie jednolicie czerwone (rude) jak u tamworth i duroc-jersey.
Kolejność dominowania tych alleli jest następująca: E-E

-e. Badania, w któ-

rych do analizy sprzężeń użyto ponad 230 markerów genetycznych,
wskazują, iż locus ten jest umiejscowiony w chromosomie 6, blisko telome-
rowego regionu ramienia p. Wyniki badań porównawczego mapowania
locus Extension u myszy (chromosom 8), bydła (chromosom 18) i świń
(chromosom 6) wskazują na homologię między tymi gatunkami. Podobnie
jak u myszy i bydła, także u świń receptor hormonu melanotropowego
MSH-R jest determinowany przez geny z locus E.

W locus I są dwa główne allele: 7 (inhibicja koloru), odpowiedzialny za

umaszczenie dominujące białe, i allel i — recesywny (kolorowy). Wśród

170

świń domowych dominujący biały jest przeważający, występuje on w homo-
zygocie (II) w rasie wielka biała i wszystkich odmianach landrace, natomiast
inne rasy są homozygotami recesywnymi (ii). Locus I został zlokalizowany
w chromosomie 8. Dziedziczenie umaszczenia u mieszańców niektórych ras
sugeruje istnienie dalszych trzech alleli w tym locus, oznaczonych symbolem
I

(deresz), I

(czarne łaty) oraz i

(brudny szary).

Biały pas, charakterystyczny dla niektórych ras, jak np. wessex sad-

dleback, hampshire (ryć. 6-10 wkładka kolorowa), hannover-braunschweig,
jest kodowany przez allel Be

z locus Be, dominujący w stosunku do

jednolitego umaszczenia. Zmienna szerokość pasa zależy od działania
genów modyfikujących (zmienność poligeniczna). Genotyp tego knura jest
następujący: aa U EE Be

Na umaszczenie świń oprócz wymienionych czterech loci wpływają

także allele z locus C. Na przykład u świń rasy mangalica umaszczenie
brudnobiałe jest prawdopodobnie determinowane przez allel c

z locus C.

Również geny z innych loci u różnych ras świń kodują specyficzne wzory

umaszczenia. Na przykład u świń rasy hampshire stwierdzono obecność
genów recesywnych z loci Red-eye (czerwonych oczu) i Dilution (rozjaśniony).

Genetyczne podłoże umaszczenia u koni

Umaszczenie u koni determinowane jest głównie przez geny znajdujące się
w  locus E (Extension) i  A (Agouti). Rozjaśnienie barwy jest warunkowane
działaniem genów z co najmniej trzech loci: C (Albina), D (Dun — bułany)
i Z (Siher dapple — siwy jabłkowity). Umaszczenie białe, siwe i dereszowate
jest kontrolowane odpowiednio przez allele z loci W (White  — dominujący
biały), G (Gray — siwy) i RN (Roan — deresz). Wzory umaszczenia, takie jak
tobiano (TO), overo (O), sabino (SB) czy tarantowate (LP), są determinowane
przez geny z innych loci.  We wszystkich wymienionych loci  dotychczas
zidentyfikowano po dwa allele, ale prowadzone są badania w celu potwier-
dzenia hipotez o istnieniu innych alleli (np. trzeciego allelu w locus Extension
— E

Locus E warunkuje wytwarzanie określonego rodzaju melaniny, allel

dominujący E determinuje syntezę eumelaniny, w przypadku jego braku
(genotyp ee) syntetyzowana jest feomelanina. Allele z tego locus wpływają
na ekspresję genów z locus A. Allel recesywny e w podwójnej dawce (ee)
tłumi działanie allelu A. Natomiast obecność w genotypie alleli dominujących
z obu loci (E i A) warunkuje umaszczenie gniade.

W locus C u koni nie występuje allel recesywny c, który w układzie

homozygotycznym u innych gatunków zwierząt warunkuje albinizm.
Rozjaśnienie umaszczenia u koni powodowane jest przez allel C"', wykazu-
jący niepełną dominację. W układzie homozygotycznym (C

) allel ten

warunkuje umaszczenie kremowe (ang. cremello).

Umaszczenie białe u koni jest warunkowane przez dominujący allel

W (jest to dominacja całkowita, zatem wystarczy jeden allel W, by było

171

umaszczenie białe), który wykazuje działanie epistatyczne w stosunku do
poznanych dotychczas genów kontrolujących umaszczenie. Wszystkie
rodzaje umaszczenia, z wyjątkiem białego, w locus W mają genotyp
homozygoty recesywnej (ww). Natomiast umaszczenie siwe kontroluje allel
dominujący z locus G, który jest epistatyczny w stosunku do wszystkich
alleli z innych loci, z wyjątkiem allelu W, wobec którego jest hipostatyczny.
Allel G (w homo- i heterozygocie) powoduje redukcję wytwarzania pigmentu
postępującą wraz z wiekiem zwierzęcia.

Locus D kontroluje intensywność wytwarzania eumelaniny i feomelani-

ny. Allel D z locus Dun wykazuje zupełną dominację, osobniki homozygoty-
czne (DD) są nie do odróżnienia na podstawie fenotypu od heterozygot
(Dd). Jego wpływ na rozjaśnienie barwy jest jednak mniejszy niż allelu
C

z locus Albina. Na przykład obecność allelu D w genotypie osobnika

karego powoduje umaszczenie myszate (aaE_CCD_).

Niektóre spośród wymienionych genów umaszczenia działają plejotro-

powo. Należą do nich allele dominujące z loci W, O i RN. Allel W w podwój-
nej dawce (genotyp homozygoty dominującej) powoduje zamieranie zarod-
ków we wczesnym okresie ciąży. Konie umaszczone biało są hetero-
zygotyczne pod względem genów tego locus (Ww). Z kolei większość źrebiąt
homozygotycznych pod względem allelu O jest obarczona zespołem „białych
źrebiąt" - LWFS (ang. lethal white foal syndrome), polegającym na
niemożności wydalenia smółki z powodu braku komórek nerwowych
(zwojów autonomicznych) kontrolujących ruchy perystaltyczne jelita lub,
znacznie rzadziej, na skutek braku części jelita. Natomiast układ homo-
zygotyczny w locus RN (RNRN) jest uważany za letalny.

Genotypy w 7 loci, determinujące wybrane rodzaje umaszczenia koni,

zestawiono w tabeli 6-II.

172

Genetyczne podłoże umaszczenia u owiec

U owiec stwierdzono trzy typy pigmentu: czarna eumelanina, czekoladowo-
brązowa (moorit) eumelanina i brązowoczerwona (tan) feomelanina.

Badania specjalistyczne wykazały, że umaszczenie tan jest warunkowane

wytwarzaniem pigmentu feomelaniny. Przykładem tego jest brązowoczer-
wony kolor wełny karakułów.

Najczęściej występujące umaszczenia u owiec są klasyfikowane zgodnie

z trzema kryteriami: typ pigmentu, wzór koloru i obecność lub brak białych
znaków. Wzory koloru składają się bądź z regularnej mieszaniny jasno
i ciemno ubarwionych powierzchni ciała, bądź mieszaniny jasnych i ciem-
nych włókien wełny.

Owce biało umaszczone są zwykle prawie pozbawione pigmentu, ale

mogą mieć pigment tan, który w fenotypie ujawnia się ze zmienną
intensywnością, od umaszczenia jasnobrązowego do intensywnego czer-
wonawobrązowego.

Umaszczenie owiec jest kontrolowane prawdopodobnie przez geny z 11

loci (tab. 6-III).

Loews Agonii odpowiada za białe lub brązowe (tan) umaszczenie i wzory

umaszczenia. W locus tym stwierdzono ogółem 16 alleli kontrolujących
zmianę syntezy eumelaniny na syntezę feomelaniny. Niektóre z nich
warunkują wytwarzanie pigmentu tylko w poszczególnych partiach ciała,
inne wpływają na typ włókien, bądź też oba efekty występują łącznie.

Allel A

, będący pierwszym w kolejności dominowania z szeregu

alleli z tego locus, warunkuje białe umaszczenie owiec. Głównym efektem
allelu A

jest całkowite zahamowanie wytwarzania eumelaniny, podczas

gdy feomelanina może być syntetyzowana. Konsekwencją tego może
być umaszczenie brązowoczerwone (tan) owiec, w których genotypach
jest allel A

. Ten typ umaszczenia występuje u owiec rasy french solognot i

brązowych (dominujących) karakułów, natomiast o wiele jaśniejsze
umaszczenie brązowoczerwone (tan) występuje u owiec islandzkich i welsh
mountain. Białe umaszczenie owiec ras wełnistych jest wynikiem selekcji
prowadzonej przeciwko umaszczeniu brązowoczerwonemu (tan) u owiec
nosicieli allelu A

Następne geny w szeregu alleli z locus Agouti częściowo hamują syntezę

eumelaniny, natomiast allel recesywny A

w układzie homozygotycznym

umożliwia pełną syntezę eumelaniny.

Niektóre allele z tego locus mają efekt plejotropowy, np. allel A

zmniejsza

płodność owiec o około 0,15 jagnięcia w miocie i hamuje aktywność seksualną
maciorek islandzkich poza normalnym sezonem rozpłodowym.

Locus Brown determinuje syntezę czarnego i czekoladowobrązowego

(moorit) pigmentu. Allel typu dzikiego, B

, warunkuje wytwarzanie czarnej

eumelaniny, natomiast recesywny allel, B

— czekoladowobrązowej eume-

laniny.

173

Na umaszczenie u owiec wpływają także allele z innych loci:

Allel recesywny C

z locus Albino warunkuje w układzie homozygotycz-

nym całkowity albinizm. Umaszczenie czarne dominujące jest kontrolowane
przez allel dominujący E

z locus Extension. Allel ten inaktywuje działanie

alleli z locus Agouti poprzez zahamowanie syntezy feomelaniny. Allel typu
dzikiego, recesywny, E

umożliwia normalną ekspresję alleli z locus Agouti.

Allel recesywny S

z locus Spotting w podwójnej dawce (S

) determinuje

białe znaki u owiec umaszczonych kolorowo. Owce ras wełnistych, z biało
umaszczoną głową są zwykle homozygotyczne pod względem genu białych
plam (S

), a także homozygotyczne białe, A

. U owiec heterozygotycz-

nych pod względem allelu A

' allel S

redukuje pigment tan (brązowy),

natomiast homozygoty S

są całkowicie białe.

U umaszczonych kolorowo owiec kożuchowych białe lub złote końce

włosów są warunkowane allelem G

z locus Sur. Allel ten jest recesywny lub

hipostatyczny w stosunku do barwy czarnej dominującej, ale epistatyczny
do dominującej brązowej (tan).

Umaszczenie białe dominujące (białe perskie, łaciate afgańskie) jest

kontrolowane przez allel W

z locus White. Allel ten jest epistatyczny

174

w stosunku do wszystkich innych genów umaszczenia. Inny allel z tego

locus, W

, warunkuje dominującą szarość u karakułów, która w formie

homozygotycznej jest letalna; również w połączeniu z allelem dominującej

białości allel W

wywołuje w większości przypadków efekt śmiertelny.

6.4. Penetracja i stopień

ekspresji (ekspresywność) genów

Fenotyp rozpatrywany jako całokształt cech jest wynikiem działania wszyst-

kich genów danego osobnika, współdziałania tych genów między sobą oraz

współdziałania ze środowiskiem. Omówione przykłady współdziałania

allelicznego i nieallelicznego świadczą o tym, iż działanie genów może

wywoływać różnorodne efekty.

Często zdarzają się przypadki, kiedy wśród osobników o jednakowych

genotypach niektóre wykazują fenotypową obecność cechy, inne zaś

jej nie mają. Z drugiej strony, ten sam genotyp u różnych osobników

może spowodować różne nasilenie cechy w fenotypie. Pierwsze z tych

zjawisk określane jest jako penetracja genu, natomiast drugie jako eks-

presywność genu, rozumiana także jako stopień ekspresji (przejawiania

się) genu lub wyrazistość. Oba pojęcia — penetracja genu i ekspresywność

genu zostały wprowadzone w 1926 roku przez neuropatologa Oskara

Yogta.

Penetracja, inaczej określana jako przenikliwość, jest to częstość, z jaką

dominujący lub recesywny gen (w homozygocie) albo układ heterozygotycz-

ny ujawnia się w fenotypie nosiciela. Penetracja może być całkowita lub

niezupełna. O penetracji całkowitej mówimy wówczas, gdy u wszystkich

osobników o danym genotypie występuje taki sam fenotyp. Natomiast jeśli

nie wszystkie osobniki, mające taki sam genotyp, wykazują charakterystycz-

ny dla niego fenotyp, mówimy o penetracji niezupełnej. Na przykład, jeżeli

gen dominujący ujawnia swą obecność w fenotypie tylko u 80% osobników,

to mówimy, że jego penetracja wynosi 80%.

Przykładem penetracji niezupełnej u zwierząt gospodarskich może

być wada pojawiająca się u nowo wylężonych kurcząt — wrodzone

drżenie. Natężenie drgań jest bardzo zróżnicowane. Stwierdzono to na

podstawie wyników doświadczenia, w którym po 4 latach prowadzenia

kojarzeń ptaków heterozygotycznych pod względem genu drżenia uzy-

skano jedynie 10% kurcząt dotkniętych tą wadą, zamiast 25% oczekiwanych

zgodnie z klasycznym stosunkiem mendlowskiej segregacji genów.

Penetracja określonego genu może być różna zależnie od płci, a nawet,

w przypadkach krańcowych, ograniczona do jednej płci (patrz podrozdział:

Cechy sprzężone z płcią).

175

Pojęcie stopień ekspresji (ekspresywność, stopień przejawiania się) genu

oznacza poziom zmienności fenotypowej określonej cechy wśród osobników
o tym samym genotypie.

Zmienność ekspresywności genu często jest obserwowana w przypadku

chorób genetycznych i wad dziedzicznych. Przykładem wady dziedzicznej

0 różnym stopniu przejawiania się genu jest miejscowy brak nabłonka
u bydła rasy ayrshire (łagodna forma) i Jersey (forma bardzo ostra) (patrz
rozdział: Mutacje). Obserwowana zmienność stopnia ekspresji genu może
być wywołana działaniem różnych u tych ras genów modyfikujących.
W przypadku chorób genetycznych czy wad dziedzicznych ocenę ekspresy-
wności genu mogą utrudniać takie czynniki, jak: wiek, w którym pojawiają
się pierwsze objawy, czy występowanie fenokopii (patrz podrozdział:
Mutacje genowe wywołujące choroby genetyczne), które nie są dziedziczne.

Zmienność stopnia ekspresji jest dość rozpowszechnioną właściwością

genów. Należy jednak pamiętać o tym, że nie zawsze zmienność fenotypowa
jakiegoś genotypu jest wynikiem różnego stopnia przejawiania się genu.
Geny z różnych loci mogą dawać podobne fenotypy, ujawniające się
w różnym stopniu. Także allele tego samego genu mogą charakteryzować
się podobną ekspresywnością. Pewność, iż mamy do czynienia ze zmienno-
ścią przejawiania się tego samego genu, możemy mieć wtedy, gdy jest ona
obserwowana u osobników spokrewnionych ze sobą.

Pojęcia penetracja i ekspresywność genu są czasem trudne do roz-

dzielenia. Wiele genów o małym stopniu penetracji wykazuje jednocześnie
słabą ekspresywność. Z kolei, geny charakteryzujące się dużą ekspresyw-
nością wykazują wysoki stopień penetracji. Zarówno stopień penetracji,
jak i  fenotypowego  przejawiania  się genu zależą  od współdziałania
tego genu z innymi genami oraz od jego współdziałania ze
środowiskiem. Spośród czynników niegenetycznych wpływających na
ekspresję genu ważną rolę odgrywają wpływy matczyne na rozwijający
się  płód (w szczególności należy do nich zaliczyć hormony, sole
mineralne oraz inne związki krążące we krwi, docierające przez łożysko
do rozwijającego się  płodu). Nie bez znaczenia jest stan zdrowotny
matki, a także położenie zarodka w macicy i nawet obecność innych
płodów.

6.5. Dziedziczenie pozajądrowe

Wszystkie omawiane dotychczas cechy są uwarunkowane genami zawartymi
w DNA jądrowym, a ich sposób dziedziczenia określany jest ogólnym
terminem — dziedziczenie mendlowskie. Już na początku naszego stulecia
zauważono, że niektóre cechy nie podporządkowują się temu terminowi,
dziedziczą się różnie, zależnie od kierunku krzyżowania. Wykrycie obecności
DNA poza jądrem komórkowym — w mitochondriach, a także chloroplas-

176

tach roślin wyjaśniło podłoże tego zjawiska. Powstał nowy termin -

dziedziczenie pozachromosomowe, inaczej pozajądrowe lub cytoplazma-

tyczne.

Mitochondrialny DNA, w przeciwieństwie do DNA jądrowego, jest

przekazywany następnemu pokoleniu wyłącznie przez matki. Wprawdzie

w 1991 roku w doświadczeniu na myszach wykryto u potomstwa cząsteczki

mtDNA pochodzące od ojca, ale częstość ich występowania była minimalna

i wynosiła 10

-4

częstości matczynego mtDNA. Taki sposób dziedziczenia

może być przyczyną powstawania heteroplazmii (równoczesne występowa-

nie zmutowanego i prawidłowego mtDNA u danego osobnika). Jak dotąd,

u żadnego innego gatunku nie potwierdzono przekazywania potomstwu

mtDNA przez ojca. Przyczyną tego, w świetle wyników najnowszych

badań, może być znakowanie (piętnowanie) cząsteczkami białka (zwanego

ubikwityną) mitochondriów w dojrzewających plemnikach podczas procesu

spermiogenezy. Po zapłodnieniu komórka jajowa może rozpoznawać tak

napiętnowane organelle i niszczyć je. Plemnik zawiera od 50 do 100

mitochondriów, natomiast komórka jajowa ma ich około 100 tysięcy. W miarę

rozwoju zarodka liczba mitochondriów ojcowskich maleje.

O mutacjach zachodzących w obrębie mitochondrialnego DNA i ich

skutkach jest mowa w rozdziale: Mutacje.

U zwierząt gospodarskich badania wpływu genów w mitochondrialnym

DNA na cechy produkcyjne najczęściej prowadzone są na bydle mlecznym.

Geny mitochondrialne kodują przede wszystkim enzymy niezbędne do

przebiegu procesów zachodzących w łańcuchu oddechowym. Ponad 90%

energii potrzebnej komórkom sekrecyjnym gruczołu mlecznego jest dostar-

czane przez ATP (adenozynotrifosforan) wytwarzany w mitochondriach.

U bydła rasy holsztyńskiej stwierdzono dodatnią korelację, której wartość

zawiera się w granicach od 0,3 do 0,4, między syntezą ATP w mitochondriach

a wartością genetyczną w zakresie produkcji mleka. Badania wpływu

genotypu w mtDNA krowy na wydajność mleka i tłuszczu wykazały, że

warunkuje on od 2 do 10% zmienności tych cech.

W celu oszacowania wpływu loci mitochondrialnego DNA na cechy

użytkowości mlecznej porównywano średnie wartości tych cech w rodzi-

nach (po określonej matce) z polimorfizmem alleli mtDNA, analizowanego

metodą RFLP. W pewnym doświadczeniu spośród 2713 krów z 131 stad

wybrano rodziny charakteryzujące się wysoką, średnią i niską wydajnością

mleka. Oszacowany dla tych rodzin efekt matki wynosił odpowiednio:

+ 991 ±108 kg, +26 ±99 kg, -879 ±114 kg mleka. Analiza polimorfizmu

fragmentów restrykcyjnych mitochondrialnego DNA wykazała, iż największa

frekwencja alleli występujących we wszystkich grupach wynosiła ^ 0,9.

Natomiast allele charakteryzujące się niską frekwencją (^ 0,1) rozkładały się

nielosowo w grupach wydajności mleka i pochodzeniowych po matce, co

może wskazywać na związek między polimorfizmem mtDNA a wydajnością

mleka.

t l i

Wyniki badań prowadzonych na bydle holsztyńsko-fryzyjskim przez

innych badaczy potwiedzają istnienie tej współzależności. Stwierdzono

bowiem istotny wpływ zamiany (tranzycji - - rodzaj mutacji punktowej

opisany w rozdziale: Mutacje) adeniny na guaninę w 169 nukleotydzie

regionu D-loop (jest to szczególnie ważny region) mitochondrialnego DNA

na zawartość tłuszczu w mleku i wartość energetyczną mleka.

Wpływ matczynego mtDNA na cechy użytkowości mlecznej potomstwa

może być wykorzystany w doskonaleniu bydła. Potencjalne możliwości

stwarzają techniki klonowania oparte głównie na umieszczaniu w enuk-

leowanym (pozbawionym jądra) oocycie jądra komórki somatycznej. Można

zatem wykorzystywać do tego celu oocyty pochodzące od krów mających

szczególnie korzystne allele w mitochondrialnym DNA.

U owiec badania mitochondrialnego DNA, prowadzone za pomocą

technik molekularnych (RFLP), wykazały istotną współzależność między

polimorfizmem fragmentów restrykcyjnych mtDNA a masą jagniąt przy

urodzeniu. Organizacja molekularna mtDNA jest omówiona w rozdziale:

Mapy genomowe.

Rozdział

7.1. Rodzaje zmienności i czynniki ją wywołujące

Zmienność jest to różnorodność wartości lub jakości cech obserwowana

wśród osobników. Zmienność danej cechy może być obserwowana między

osobnikami i jest to zmienność osobnicza, czyli indywidualna. Istnieje także

zmienność grupowa, występująca między osobnikami należącymi do różnych

ras (zmienność rasowa) lub gatunków (zmienność gatunkowa). W przypadku

cech, które ujawniają się periodycznie u tego samego osobnika w kolejnych

sezonach (np. wydajność mleczna w kolejnych laktacjach), mamy do

czynienia ze zmiennością wewnątrzosobniczą.

Wszelkie różnice uzewnętrzniające się (widoczne lub dające się określić

bądź zmierzyć) między zwierzętami określamy mianem zmienności fenoty-

powej. Zmienność ta powstaje w wyniku różnic genetycznych między

zwierzętami (zmienność genetyczna) oraz oddziaływania zróżnicowanych

warunków środowiskowych (zmienność środowiskowa). Na zmienność

fenotypową, zwaną także ogólną, może również wpływać zmienność

wynikająca z wzajemnego współdziałania genotypów z warunkami środo-

wiskowymi, tzw. interakcja genotyp-środowisko. Zmienność oznaczamy

symbolem S

, jeśli rozpatrujemy populację zwierząt, lub S

w przypadku

próby losowej pochodzącej z tej populacji.

179

Podstawą genetycznego doskonalenia zwierząt jest zmienność genetycz-

na. Jej źródłem są przede wszystkim mutacje i rekombinacje genetyczne

oraz w mniejszym stopniu współdziałanie między genami. Mutacje prowa-

dzą do powstawania nowych genów, innych układów w obrębie chromo-

somu lub między chromosomami. Natomiast rekombinacje, będące wynikiem

segregacji chromosomów i crossing over w czasie mejozy oraz losowego

łączenia się gamet zróżnicowanych genetycznie, są przyczyną powstawania

różnych genotypów.

Głównymi składnikami zmienności genetycznej są: zmienność addytyw-

na, odchylenie dominacyjne i odchylenie epistatyczne.

Zmienność addytywna spowodowana jest niejednakowym sumującym

efektem działania alleli z loci poligenów, które kontrolują występowanie

danej cechy. Ten rodzaj zmienności zostanie omówiony szerzej w podroz-

dziale: Zmienność cech ilościowych.

Zmienność dominacyjna jest to część zmienności genetycznej, która jest

powodowana dominacyjnym współdziałaniem genów warunkujących cechę.

Efekt dominacji przejawia się nieaddytywnym zróżnicowaniem wartości

między osobnikiem heterozygotycznym, w którego genotypie funkcjonuje

jeden gen dominujący, i osobnikami homozygotycznymi — dominującym

i recesywnym. Poniższy schemat krzyżowania bydła obrazuje to odchylenie.

Osobniki fenotypowo identyczne (bezrogie), ale różniące się pod względem

założeń genetycznych (homo- i heterozygotyczne) dadzą potomstwo różniące

się nie tylko pod względem genotypu, ale także fenotypu (bezrogie i rogate).

Zmienność epistatyczna jest składową zmienności genetycznej powodo-

waną nieallelicznym współdziałaniem genów — epistazą. Przykładem

epistatycznego działania genów jednej pary alleli na geny innej pary jest

180

białe upierzenie kur rasy leghorn i whiterock. Barwa upierzenia u tych ras

jest warunkowana dwiema parami alleli: C-c (wystąpienie barwy) oraz I-i

(blokada wytwarzania me/aniny, upierzenie biafe). Z krzyżowania osobników

0 białym upierzeniu, należących do tych ras, uzyskuje się mieszańce biało

upierzone. W pokoleniu F

wystąpią natomiast osobniki zarówno biało, jak

1 barwnie upierzone.

W pracy hodowlanej szczególnie ważna jest znajomość udziału zmien-

ności genetycznej, a zwłaszcza jej składnika — zmienności addytywnej,

w zmienności fenotypowej danej cechy ilościowej. Do szacowania tego

udziału stosowane są parametry genetyczne, do których należy odziedziczal-

ność. Szczegółowe informacje dotyczące odziedziczalności i pozostałych

parametrów genetycznych oraz ich wykorzystania w doskonaleniu zwierząt

znajdują się w podręcznikach z zakresu metod hodowlanych.

Zmienność środowiskowa wynika z różnorodnych warunków środo-

wiskowych oddziałujących na zwierzęta stale (np. czynniki klimatyczne)

lub okresowo (żywienie, sposób utrzymania itp.). Do czynników śro-

dowiskowych, mających istotne znaczenie, należy także efekt matki

pre-i postnatalny. Wpływ środowiska matki zostanie omówiony w

dalszej części tego rozdziału.

Zmienność cechy może mieć charakter skokowy lub ciągły w zależności

od jej genetycznego uwarunkowania.

Zmienność skokowa odnosi się przede wszystkim do cech jakościowych,

warunkowanych zwykle jedną parą alleli. Udział pojedynczego genu

w wykształceniu cechy jakościowej jest duży, dlatego gen ten ujawnia się

mimo ewentualnego modyfikującego działania środowiska czy wpływu na

daną cechę innych genów zwanych modyfikatorami. Charakterystyka

zmienności cechy jakościowej polega na określeniu częstości występowania

(frekwencji) genów, genotypów i fenotypów w danej populacji (stadzie).

Zagadnienie to jest szerzej omówione w rozdziale: Podstawy genetyki

populacji.

Zmienność skokowa występuje również w przypadku pewnych cech

ilościowych, których wartość wyrażana jest za pomocą liczb naturalnych,

np. liczba prosiąt w miocie.

Zmiennością ciągłą charakteryzuje się większość cech ilościowych.

Nasilenie tych cech wyrażane jest za pomocą liczb rzeczywistych z przedziału

181

charakterystycznego dla danej cechy, np. wydajność mleka w kilogramach,

wysokość w kłębie w centymetrach, procentowa zawartość tłuszczu w mleku

itp. Charakterystyka zmienności tych cech przedstawiana jest za pomocą

miar zmienności opisanych poniżej.

7.2. Miary zmienności

Określanie zmienności fenotypowej cechy przeprowadzane jest na wybranej

losowo z populacji odpowiednio licznej grupie osobników, zwanej próbą.

Z punktu widzenia statystycznego populacją nazywamy zbiór zwierząt,

którego elementami są poszczególne osobniki.

W celu określenia zmienności cechy musimy ją oznaczyć (np. zmierzyć)

u wszystkich osobników stanowiących próbę. Uzyskany w ten sposób nie

uporządkowany materiał wymaga zestawienia (uporządkowania) np. według

wartości rosnących lub malejących (szereg statystyczny uporządkowany).

Jeśli liczba obserwacji jest duża, a niektóre wartości powtarzają się, dane

zestawia się w tzw. szereg rozdzielczy, w którym na podstawie przyjętych

przedziałów klasowych można wyodrębnić poszczególne klasy. Takie

uporządkowanie danych liczbowych (obserwacji) ułatwia statystyczną

i graficzną analizę zmienności cechy.

Szczegółową charakterystykę populacji można przeprowadzić po osza-

cowaniu odpowiednich parametrów statystycznych, które można podzielić

na dwie grupy:

1) miary skupienia

2) miary rozproszenia (dyspersji).

7.2.1. Miary skupienia

Do miar skupienia należą przeciętne klasyczne (średnia arytmetyczna,

ważona, harmoniczna i geometryczna) oraz przeciętne pozycyjne (wartość

środkowa — mediana i wartość modalna — dominanta).

Średnia arytmetyczna nie odzwierciedla zmienności, ale informuje

o poziomie cechy w danej populacji i obliczana jest ze wzoru:

Średnia arytmetyczna charakteryzuje się następującymi właściwościami:

Przykład (dane z tab. 7-1):

Średnią ważoną obliczamy wówczas, gdy danej wartości cechy od-

powiada kilka obserwacji (tworzy się wówczas przedziały wartości cechy)
lub gdy obliczamy średnią dla populacji na podstawie średnich dla prób.
Wzór na jej obliczanie jest następujący:

Średnia harmoniczna jest stosowana najczęściej do obliczania średnich

wartości otrzymywanych ze wskaźników czasu, np. do obliczania średniej

prędkości.

Wzór na obliczanie średniej harmonicznej jest następujący:

Przykład:

Ważono mleko oddawane przez krowę w kolejnych minutach doju.
W pierwszej minucie uzyskano 4 kg mleka, w drugiej 2 kg, a w trzeciej l kg.
Stosując wzór na obliczanie średniej harmonicznej uzyskujemy wynik
mówiący, jaka była średnia szybkość oddawania mleka:

183

Przykład:

Określano masę ciała cieląt od urodzenia do 6 miesięcy w odstępach

miesięcznych, a następnie obliczono wskaźnik wzrostu dla kolejnych

miesięcy (wskaźnik wzrostu jest to przyrost masy ciała wyrażony w procen-

tach średniej masy ciała w danym okresie). Wartości zlogarytmowane tego

współczynnika wyniosły: 0,3010; 0,1239; 0,0864; 0,0697; 0,0414; 0,0294,

natomiast ich suma = 0,6518. Chcąc określić tempo wzrostu cieląt w okresie
6 miesięcy należy obliczyć średnią geometryczną:

Średni wskaźnik tempa wzrostu cieląt w okresie 6 miesięcy wyniósł 1,28,

czyli 128%.

Wartość środkowa (mediana) jest to wartość cechy, która dzieli szereg

uporządkowany malejąco lub rosnąco na połowę.

Wartość modalna (średnia modalna) jest to wartość cechy, która najczęś-

ciej powtarza się w szeregu liczbowym.

7.2.2. Miary rozproszenia

Podstawowe miary rozproszenia to wariancja, standardowe odchylenie

i współczynnik zmienności.

Wariancja jest to średni kwadrat odchyleń obserwacji (xi) od średniej

arytmetycznej

Biorąc pod uwagę, że najczęściej średnia arytmetyczna nie jest liczbą
całkowitą, w celu ułatwienia obliczeń stosuje się wzór roboczy, w którym
licznik jest sumą kwadratów odchyleń:

Jeśli próbę stanowi mała liczba obserwacji, w celu uniknięcia błędu

zalecane jest dzielenie nie przez N obserwacji, ale przez N—1.. Za mało

liczną próbę przyjmuje się poniżej 100 obserwacji. Wariancja nie może

mieć wartości ujemnej. Ma ona miano takie jak analizowana cecha,

ale podniesione do kwadratu.

185

Standardowe odchylenie jest pierwiastkiem kwadratowym z wariancji.

Jego wartość informuje o średnim odchyleniu in plus i in minus od średniej

arytmetycznej i jest liczbą mianowaną w jednostkach badanej cechy.

Charakteryzując zmienność cechy podaje się wartość średniej arytmetycznej

i standardowego odchylenia

Współczynnik zmienności obliczany jest ze wzoru:

gdzie:

Współczynnik zmienności wyraża zmienność w procentach, dzięki

czemu znajduje zastosowanie do porównywania zmienności różnych cech

(mierzonych w różnych jednostkach, np. wydajność mleczna [kg] i zawar-

tość tłuszczu w mleku [%]) w tej samej populacji, a także zmienności tej

samej cechy w różnych populacjach (np. wydajność mleczna w stadzie

krów rasy nizinnej czarno-białej i czerwonej polskiej). Współczynnik

zmienności może być również miarą precyzji w doświadczeniu prze-

prowadzanym na kilku grupach zwierząt. Dobór zwierząt do grup

doświadczalnych powinien być losowy, tak więc zmienność badanej cechy

we wszystkich grupach musi być zbliżona. Różnica wartości współczynnika

zmienności w granicach 5-10% oznacza możliwą do przyjęcia precyzję

doświadczenia.

Sposób obliczania miar rozproszenia przedstawiono niżej, wykorzystując

dane liczbowe zawarte w tabeli 7-1, dotyczące masy ciała owiec w wieku 10

miesięcy. Wariancja:

7.3. Zmienność cech ilościowych

7.3.1. Dziedziczenie cech ilościowych

Cechy o znaczeniu gospodarczym w zdecydowanej większości należą do

kategorii cech ilościowych. W przeciwieństwie do cech jakościowych

mechanizm ich dziedziczenia jest złożony i trudny do pełnego wyjaśnienia.

Ponadto zmienność tych cech zależy również od wpływu czynników

środowiskowych.

Cechy ilościowe warunkowane są wieloma genami z różnych loci

(poligeny). Poligeny, nazywane inaczej genami polimerycznymi, addytyw-

nymi lub kumulatywnymi, specyficznie ze sobą współdziałają. Przyjmuje

się, że efekty poszczególnych poligenów sumują się i w ten sposób

warunkują nasilenie cechy. Liczba poligenów kontrolujących cechy ilościowe

jest nieznana. Zakłada się, że każdy poligen ma dwa allele, pomiędzy

którymi zachodzi dziedziczenie pośrednie, przy czym jeden z nich ma

działanie pozytywne (tzn. zwiększające wartość cechy), a drugi neutralne,

czyli obojętne dla wartości cechy. Kolejnym założeniem jest to, że efekty

alleli pozytywnych z różnych loci poligenów są sobie równe i wreszcie

— efekty te sumują się przy kształtowaniu fenotypu. Genetyczne tło cech

ilościowych stwarza możliwość bardzo dużej liczby kombinacji układów

alleli kontrolujących daną cechę. Najczęściej występują genotypy warun-

kujące wartości fenotypowe cechy, które skupiają się wokół wartości średniej,

natomiast zmniejsza się częstość występowania form skrajnych.

Zagadnienie to obrazuje przykład, w którym hipotetycznie przyjęto,

że nieśność kur warunkowana jest trzema parami alleli z różnych

loci. Kury o genotypach „pozytywnych" AABBCC są zdolne do produkcji

240 jaj rocznie, natomiast o genotypach zawierających allele neutralne

aabbcc — do produkcji 120 jaj rocznie. Założono również, że efekty

genów A, B i C są identyczne (A = B = C) i każdy z tych genów

zwiększa nieśność kur o 20 jaj. Koguty o genotypach AABBCC, mające

założenia genetyczne warunkujące nieśność 240 jaj rocznie, skrzyżowano

z kurami o genotypach aabbcc, niosącymi 120 jaj rocznie.

AABBCC x aabbcc

240 120

Uzyskane w pokoleniu F

potomstwo było heterozygotyczne (AaBbCc),

czyli miało założenia genetyczne warunkujące nieśność 180 jaj rocznie.

U potomstwa w pokoleniu F

nastąpiło rozszczepienie, uzyskano 64

genotypy, warunkujące 7 poziomów nieśności (fenotypów tej cechy).

Szeregując w pionie genotypy warunkujące takie same wartości cechy

i łącząc linią krzywą genotypy znajdujące się najwyżej, uzyskujemy

przedstawiony niżej obraz graficzny:

187

Po zestawieniu wartości fenotypowych cechy, determinowanych przez okreś-
lone genotypy i obliczeniu średniej wartości cechy w pokoleniu F

uzyskujemy:

W podanym przykładzie celowo pominięto wpływ czynników środowis-

kowych. Czynniki te oraz ich wpływ na fenotypową ekspresję cech

ilościowych będą omówione nieco później. Znaczenie tych czynników jest

istotne, gdyż zacierają one różnice między fenotypami, co w przypadku

cech ilościowych o zmienności ciągłej powoduje, że graficznym obrazem tej

zmienności jest krzywa rozkładu normalnego, zwana krzywą Gaussa.

Rozkład normalny charakteryzuje się tym, iż:

• jest to rozkład, w którym najwięcej osobników wykazuje wartość

cechy zbliżoną do średniej, a najmniej skrajne wartości, poniżej i powyżej

średniej,

• rozkład ten jest symetryczny, a oś symetrii przechodzi przez punkt,

w którym jest średnia wartość cechy,

188

• mediana i wartość modalna (opisane wcześniej) znajdują się w tym

samym punkcie, co wartość średniej arytmetycznej,

• w przedziale x±S znajduje się ok. 68,2% wszystkich obserwacji,

• w przedziale x ±2 S znajduje się ok. 95,4% wszystkich obserwacji,

• w przedziale x±3 S znajduje się ok. 99,6% wszystkich obserwacji cechy.

Jak już wspomniano, na fenotypowe ujawnienie się każdej cechy

ilościowej wyraźny wpływ wywierają czynniki środowiskowe. Mogą one

maskować oddziaływanie poligenów. Spośród czynników środowiskowych

na szczególną uwagę zasługuje efekt matki (ang. maternal effect). Mimo iż

potomstwo otrzymuje od ojca i od matki taką samą liczbę chromosomów,

wpływ matki na potomstwo jest większy od wpływu ojcowskiego. Wpływ

ten wynika z trzech źródeł:

• pierwszym jest podłoże genetyczne — dodatkowe założenia dziedzicz

ne przekazywane przez matkę poza chromosomami (tzw. dziedziczenie

pozajądrowe, omówione w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedzicze

nia cech),

• dwa następne źródła wynikają z oddziaływania środowiska matki

w okresie życia płodowego (efekt prenatalny) i po urodzeniu (efekt

postnatalny).

Efekt prenatalny został wykryty przez wykorzystanie transferu zarodków

zwierzęcych i analizę ich rozwoju. Na ten efekt składa się przede wszystkim

wpływ: wielkości macicy, ilości substancji odżywczych dostarczanych płodowi

(lub płodom), wielkości matki oraz jej stanu fizjologicznego i zdrowotnego.

Wielkość prenatalnego efektu matki zależy również od założeń genetycz-

nych przekazywanych potomstwu zarówno w jądrowym, jak i mitochon-

drialnym DNA. Niedawno u bydła mlecznego wykazano istotny wpływ

genów mitochondriałnych na wydajność mleka, procent tłuszczu w mleku

oraz wartość energetyczną mleka.

Efekt postnatalny występuje przede wszystkim u ssaków i został

określony za pomocą eksperymentów krzyżowego podsadzania noworod-

ków innym matkom (np. z innych ras). Efekt ten wynika bowiem z mlecz-

ności samicy i jej zachowania opiekuńczego (tzw. behawior matczyny).

U trzody chlewnej, na przykład, stwierdzono, że wpływ efektu matki jest

najistotniejszy dla wzrostu prosiąt do 21 dnia życia, a więc wówczas gdy

prosięta odżywiają się jedynie mlekiem matki.

Wielkość efektu matki prę- i postnatalnego zależy od gatunku, rasy,

a także wielu czynników środowiskowych.

7.3.2. Zmienność transgresywna

Zwierzęta gospodarskie, nawet ras o ustalonym genotypie, są hetero-

zygotyczne pod względem znacznej liczby loci. W wyniku krzyżowania

takich osobników potomstwo może mieć założenia genetyczne warunkujące

189

wartości cechy takie, jakie obserwowano u rodziców, bądź wartości wyższe

lub niższe niż u rodziców, czyli wykazujące większą zmienność cechy.

Zjawisko to nosi nazwę transgresji. Ilustruje je przykład:

Załóżmy, że wydajność mleczna krów jest kontrolowana przez geny

z 3 loci — D, E i F. Efekty genów D, E i F są identyczne (D = E = F), a

każdy z nich zwiększa produkcję mleka o 400 kg. Genotyp ddeeff

warunkuje wydajność 2400 kg mleka, DDEEFF — 4800 kg, natomiast

heterozygotyczny DdEeFf— 3600 kg mleka.

W potomstwie rodziców heterozygotycznych pod względem genów

kontrolujących produkcję mleka mogą wystąpić różne genotypy (typowe

rozszczepienie przy krzyżowaniu heterozygot), warunkujące różną wydaj-

ność mleczną. Przeważająca część potomstwa będzie się charakteryzować

średnią wartością cechy, równą wartości cechy u rodziców. Pojawią się

jednak także inne wartości cechy — wyższe niż u rodziców (np. genotyp

DDEEFF, warunkujący produkcję 4800 kg mleka) lub niższe (ddeeff 2400 kg

mleka).

Zjawisko transgresji jest dość często obserwowane w hodowli zwierząt

gospodarskich i jest źródłem zmienności transgresywnej, wykorzystywanej

w pracy hodowlanej.

7.3.3. Geny o dużym efekcie

W podanych wyżej przykładach determinacji cech ilościowych zakładano

udział kilku lub kilkunastu par alleli z różnych loci o małym efekcie

addytywnym (dziedziczenie poligeniczne). Cechy takie charakteryzują się

rozkładem normalnym. W przypadku niektórych cech zaobserwowano

zmienność, której graficzny obraz odbiega od krzywej Gaussa i może być

dwumodalny lub przesunięty, spłaszczony albo nadmiernie uwypuklony.

Jest to wynikiem dziedziczenia, w którym obok poligenów działa gen

o dużym efekcie, zwany inaczej genem głównym.

Gen o dużym efekcie jest identyfikowany wówczas, gdy u przeciwstaw-

nych homozygot różnice wartości fenotypowej cech wynoszą co najmniej

jedno standardowe odchylenie. Identyfikacja tych genów poprzez statystycz-

ną analizę rozkładu zmienności cechy w populacji jest trudna. Niektóre geny

o dużym efekcie zostały wykryte przypadkowo. Od niedawna dla genów

o dużym efekcie fenotypowym w zakresie cech produkcyjnych używa się

określenia locus cechy ilościowej — QTL (ang. quantitative trait locus).

Jednym z genów mających duży wpływ na różne cechy produkcyjne

zwierząt gospodarskich jest gen hormonu wzrostu GH (ang. growth

hormone). U bydła locus GH znajduje się w chromosomie l (w regionie

1q23-q25). Wykazano istotny wpływ polimorfizmu w tym locus na wydajność

krów ras mlecznych. W badaniach prowadzonych na simentalerach stwier-

dzono, iż zwierzęta homozygotyczne pod względem allelu B hormonu

190

wzrostu charakteryzowały się o 382 + 18,5 kg większą wydajnością mleka

w porównaniu z osobnikami homozygotycznymi AA. U bydła mięsnego gen

hormonu wzrostu wpływa na cechy użytkowości mięsnej. Wspólnie z genem

czynnika wzrostu insulinopodobnego l (IGF-1) odgrywa on istotną rolę

w kształtowaniu tempa wzrostu i składu tuszy. Hormon wzrostu reguluje

rozwój mięśni, a IGF-1 wspomaga jego działanie. Badania prowadzone na

mieszańcach piedmontese x chianina wskazują na istotną zależność między

polimorfizmem tego genu a długością i obwodem klatki piersiowej. Stwier-

dzono także, iż gen hormonu wzrostu oddziałuje na proces starzenia się

i reprodukcję oraz na odpowiedź immunologiczną organizmu.

Loews GH u świni znajduje się w chromosomie 12pl4 i wykazuje dużą

homologię do genu GH u człowieka, bydła i szczura. Wykazano wpływ

hormonu wrostu na zwiększenie masy mięśni, z równoczesnym zmniej-

szeniem otłuszczenia, a także na poprawę wykorzystania paszy i przyrosty

dzienne masy ciała. Opisano dotychczas około 20 alleli hormonu wzrostu

u tego gatunku. Dalsze badania zmierzają do ustalenia, które allele mają

związek z użytkowością mięsną.

Wpływ polimorfizmu genu hormonu wzrostu na cechy użytkowości

mięsnej i tempo wzrostu jest przedmiotem badań prowadzonych także na

drobiu. Dotychczas wykazano, iż polimorficzne warianty genu hormonu

wzrostu (u kur znanych jest już 16 alleli) są odpowiedzialne za niektóre

zaburzenia rozwojowe, jak karłowatość i akromegalia.

Pozostałe ważniejsze geny o dużym efekcie zostaną przedstawione

z podziałem na gatunki zwierząt, a najnowsze osiągnięcia są omówione

w rozdziale 12.3.5.

Świnie

U trzody chlewnej zidentyfikowano kilka genów o dużym efekcie.

Gen receptora rianodyny (KYR1). Autosomalny recesywny allel (gorączki

złośliwej) genu RYR1 jest najlepiej poznanym genem o dużym efekcie

u trzody chlewnej. Badania cytogenetyczne wykazały, iż jest on zlokalizo-

wany w chromosomie 6 (lokalizacja ta przedstawiona jest w rozdziale:

Mapy genomowe). W wyniku działania tego genu zwiększa się podatność

świń na stresy (zespół PSS — ang. porcine stress syndrome), powodowane

transportem, warunkami termicznymi i niektórymi czynnikami chemicznymi.

Następstwem miopatii stresowych są niekorzystne zmiany fizykochemiczne

w organizmie, prowadzące do pogorszenia jakości mięsa — odbarwienie

i nieprzyjemny zapach. Przypadek takich zmian po raz pierwszy został

opisany w 1957 roku przez Ludwigsena. Jednocześnie gen ten ma dodatni

wpływ na niektóre cechy związane z użytkowością mięsną, jak zawartość

mięsa w tuszy i powierzchnia oka polędwicy. Paramety tych cech są

najkorzystniejsze u zwierząt heterozygotycznych, będących nosicielami

zmutowanego allelu. Zwierzęta takie są więc dobrym materiałem do tuczu.

191

Ponieważ gen gorączki (hipertermii) złośliwej powoduje specyficzną

wrażliwość na gaz używany w anestezji — halotan, początkowo oznaczono

go symbolem Hal

. U osobników Hal

Hal

(homozygoty recesywne) wy-

stępuje nadmierny transport jonów Ca

z retikulum endoplazmatycznego

do cytoplazmy komórek. Badania przeprowadzone przez naukowców

kanadyjskich wykazały, że fenotypowo rozpoznany Hal

jest mutacją

genu receptora rianodyny (RYR1), jednej z podjednostek kanału wa-

pniowego w mięśniach szkieletowych. Dlatego obecnie gen hipertermii

złośliwej jest oznaczany symbolem RYR1. W obrębie genu RYR1 stwierdzono

18 mutacji punktowych, z których najistotniejsza jest mutacja w 1843

nukleotydzie, powodująca zamianę argininy w cysteinę w pozycji 615

łańcucha polipeptydowego. Mutacja ta likwiduje miejsce trawienia nie-

którymi enzymami, co umożliwiło opracowanie molekularnych testów

diagnostycznych. W jednym z nich stosowane są dwa enzymy restrykcyjne

(HgiAI oraz HinPI). W innym, opatentowanym przez badaczy kanadyjskich,

fragment genu receptora rianodyny zawierający mutację trawiony jest

enzymem Hhal. Procedurę tego testu przedstawiono na rycinie 7-1. Zam-

plifikowany fragment DNA długości 81 par zasad obejmuje rejon wystąpienia

mutacji punktowej C

→T. W normalnym genie enzym HhaI rozpoznaje

sekwencję GCGG i tnie DNA na dwa odcinki, natomiast w zmutowanym

192

allelu zmiana tej sekwencji powoduje, że enzym nie znajduje miejsca cięcia,

czego wynikiem jest uzyskanie nie strawionego fragmentu genu. Obraz

elektroforetycznego rozdziału zamplifikowanego odcinka genu dla osobnika

homozygotycznego (NN) wykaże dwa prążki długości 49 pz i 32 pz, dla

homozygotycznego (nn) - - jeden prążek długości 81 pz, natomiast dla

heterozygoty trzy prążki: 81 pz, 49 pz, 32 pz.

Diagnostyka wrażliwości świń na stres za pomocą testu molekularnego

umożliwia eliminowanie z hodowli osobników podatnych. W pracy hodow-

lanej należy prowadzić kojarzenia tak, by wykorzystać wspomniane już

wcześniej zalety genotypu heterozygotycznego.

Gorączka złośliwa występuje także u innych gatunków zwierząt oraz

u ludzi. Gen hipertermii u ludzi jest zlokalizowany w chromosomie 19,

u bydła w 18, a u koni w 10 chromosomie.

Gen „kwaśnego mięsa" — gen podjednostki

kinazy białkowej ak-

tywowanej przez AMP (PRKAG3). Pierwsze sugestie co do istnienia genu

o dużym efekcie, wpływającego na wzrost zawartości glikogenu w tkance

mięśniowej u świń rasy hampshire pojawiły się w 1986 roku. Loews

odpowiedzialny za cechę kwaśnego mięsa zlokalizowano w chromosomie

15 na podstawie analizy asocjacji przeprowadzonej dla rodzin referencyjnych

z wykorzystaniem markerów genetycznych i oznaczono symbolem RN.

Dalsze badania z zastosowaniem precyzyjnych metod analizy genomu

zostały uwieńczone w 2000 roku wykryciem mutacji w genie PRKAG3 (gen

trzeciej izoformy podjednostki y kinazy białkowej aktywowanej przez

AMP). W genie tym stwierdzono siedem mutacji, ale tylko tranzycja G-»A

w kodonie 200, powodująca zamianę argininy na glicynę w łańcuchu

polipeptydowym, warunkuje cechę kwaśnego mięsa. U nosicieli zmutowa-

nego allelu stwierdza się dwukrotnie większą zawartość glikogenu w mięś-

niach (zwłaszcza w szynce). Test molekularny wykrywający mutację genu

PRKAG3 został opatentowany.

Gen wpływający na wielkość miotu (ESR). Niektóre chińskie rasy świń

charakteryzują się niezwykłą plennością. Badania prowadzone w USA miały

na celu wykrycie genetycznego podłoża tej cechy. Wyniki tych badań

wskazują, iż zlokalizowany w chromosomie l (1p2.5-2.4) locus genu receptora

steroidowego hormonu płciowego estrogenu — ESR (ang. estrogen receptor

gene) może mieć istotny wpływ na wielkość miotu. Stwierdzono, że jeden

z alleli tego genu, występujący w chińskiej plennej rasie meishan, wykazuje

związek z wielkością miotu i może być uważany za gen główny kontrolujący

tę cechę. Lochy mające w swym genotypie dwie kopie tego genu dają mioty

większe o l do 1,4 prosięcia żywo urodzonego w porównaniu z lochami nie

mającymi tego genu. Badania molekularne (z zastosowaniem enzymów

restrykcyjnych) genu receptora estrogenu, prowadzone u świń innych ras

(niemiecka landrace, yorkshire, duroc), pozwoliły na wykrycie dwóch

mutacji punktowych (zamiana A

→T w kodonie 1665 i A→G w kodonie

193

1754). Gen ten nie wykazuje plejotropowego negatywnego działania na

inne, ekonomicznie ważne cechy, jak wzrost i grubość słoniny na grzbiecie.

Polimorfizm tego genu może mieć szczególne znaczenie w pracach zmie-

rzających do utworzenia syntetycznych linii świń, wyprowadzanych z udzia-

łem rasy meishan.

Bydło

Geny białek mleka. Do genów głównych o szczególnym znaczeniu dla

wyników ekonomicznych hodowli bydła należą geny białek mleka:

κ-kazeiny

β-laktoglobuliny.

Gen

κ-kazeiny, zlokalizowany w chromosomie 6, ma długość około 13

tysięcy par zasad i zawiera 5 eksonów. W najdłuższym eksonie 4 znajduje

się większość sekwencji kodujących dojrzałe białko

κ-kazeiny. Wykazano

związek między genami kazein a cechami użytkowości mlecznej (wydajność

mleka, białka i tłuszczu). Mleko krów z genem

κ-kazeiny typu B ma większą

zawartość białka oraz lepszą przydatność do produkcji serów niż mleko

z wariantem

κ-kazeiny A.

Allele kontrolujące syntezę poszczególnych wariantów tego białka

powstały w wyniku mutacji punktowej w genie

κ-kazeiny wariantu A.

W następstwie takiej mutacji w pozycji 136 łańcucha polipeptydowego

κ-

kazeiny wariantu A znajduje się aminokwas izoleucyna (kodon ATC),

podczas gdy w wariancie B — treonina (w DNA kodon ACC). Natomiast

w pozycji 148 wariant B

κ-kazeiny ma kwas asparaginowy (kodon GAT),

wariant A alaninę (GCT). Te dwa warianty

κ-kazeiny można rozróżnić za

pomocą analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Pod-

stawienia zasad w nukleotydach powodują powstanie miejsc cięcia dla

enzymu HindIII, natomiast zniknięcie miejsca trawienia przez enzym Hm/L

Dzięki różnicy w składzie nukleotydowym genu możliwe jest określanie

genotypu kontrolującego wariant

κ-kazeiny w mleku za pomocą testu

PCR-RFLP (ryć. 7-2). Opracowana została metoda identyfikacji genotypów

κ-kazeiny, wykorzystywanych jako dodatkowe kryterium selekcji buhajów,

utrzymywanych w zakładach unasieniania. Dotychczas genotyp ojca można

było określić na podstawie segregacji polimorficznych wariantów

κ-kazeiny,

identyfikowanych w mleku córek, przy czym genotypy homozygotyczne

mogły być weryfikowane jako statystycznie bardziej lub mniej praw-

dopodobne.

Gen

β-laktoglobuliny uważany jest za gen o dużym efekcie, gdyż

określony wariant tego białka, podobnie jak

κ-kazeiny, wpływa na wydajność

mleka i jego składników. Mleko zawierające

β-laktoglobulinę B różni się od

mleka z wariantem A większą zawartością suchej masy, tłuszczu i kazein

oraz lepszą przydatnością technologiczną. Gen

β-laktoglobuliny ma długość

około 7800 par zasad, zawiera 7 eksonów. Białko wariantu A różni się od

B dwoma aminokwasami. Jest to konsekwencja różnic w sekwencji nukleo-

194

AB AA BB

Ryć. 7-2. Identyfikacja genotypu

κ-kazeiny (wariant A i B) metodą PCR-RFLP.

a — marker, b — produkt nie strawiony, l — trawienie enzymem restrykcyjnym Hinfi,

2 — trawienie enzymem restrykcyjnym Hindlll

tydowej obu alleli. Stosowane są różne warianty molekularnej identyfikacji

genotypów

β-laktoglobuliny z zastosowaniem metod PCR-RFLP i SSCP.

Wyniki oznaczeń są wykorzystywane jako dodatkowe kryterium selekcyjne

w doskonaleniu cech użytkowości mlecznej.

Gen hipertrofii mięśniowej (MH — ang. muscular hypertrophy).

Hipertrofia mięśniowa występująca u niektórych ras bydła mięsnego

(belgijskiego błękitnego i asturiana) determinowana jest zmutowanym

allelem genu miostatyny (locus miostatyny zmapowano w chromosomie 2,

jego lokalizacja jest przedstawiona w rozdziale: Mapy genomowe). Gen

miostatyny należy do rodziny TGF

β (ang. transforming growth factor β).

Zmutowany allel różni się od normalnego delecją 11 nukleotydów między

821 a 831 nukleotydem, dlatego mutacja ta jest oznaczona jako

nt821(del11). Bezpośrednim następstwem ekspresji tego allelu jest

zwiększona zawartość chudego mięsa w tuszy oraz jego lepsze właściwości

dietetyczne, spowodowane zmniejszoną ilością tłuszczu i tkanki łącznej.

Dlatego cecha ta jest preferowana przez hodowców zarówno w hodowli

czystych ras, jak i ich mieszańców. Obecność zmutowanego allelu w

genotypie ma jednak także niekorzystne następstwa, należą do nich:

opóźnienie okresu dojrzałości płciowej u osobników obu płci,

zmniejszona zdolność rozpłodowa — u buhajów mniejsze stężenie

hormonów płciowych w osoczu krwi, mniejszy obwód i masa jąder,

natomiast u krów dłuższa ciąża. Duża masa płodu stwarza wyraźne

trudności naturalnego porodu. Rozwiązaniem

195

ograniczającym śmiertelność okołoporodową cieląt jest poród przez cesars-

kie cięcie. Powoduje ono jednak wydłużenie okresu międzywycieleniowego

o około 20 dni. Pomimo ujemnych następstw związanych z hipertrofią

mięśni, cecha ta ze względów ekonomicznych (koszt cesarskiego cięcia jest

równy tylko 1/10 wartości mięsa cielęcia) jest w niektórych krajach

utrwalana w hodowli bydła typu mięsnego (ryć. 7-3 wkładka kolorowa).

Najnowsze badania struktury molekularnej genu miostatyny w różnych

rasach mięsnych wykazały obecność kolejnych czterech mutacji, które

uszkadzają funkcję kodowanego białka. Trzy z nich powodują przedwczes-

ne pojawienie się kodonu „stop" i w efekcie skrócenie łańcucha polipep-

tydowego miostatyny. Są to: a) insercja 10 nukleotydów powiązana z delecją

7 nukleotydów, począwszy od pozycji 419 nukleotydu, b) tranzycja C

→T

w 610 nukleotydzie, c) transwersja G

→ T w nukleotydzie 676. Czwarta

mutacja d) polega na tranzycji G

→A w nukleotydzie 938, która jest

odpowiedzialna za substytucję cysteiny przez tyrozynę. Co ciekawe,

mutacje te są charakterystyczne dla określonych ras bydła mięsnego.

Mutacje a) i c) występują u bydła francuskiego maine-anjou, b) u charolaise

(Francja) i d) u gasconne (Francja) i piedmontese (Włochy).

Owce

Gen hipertrofii mięśniowej (CLPG). U owiec występuje mutacja powodu-

jąca hipertrofię mięśniową, która jest związana ze wzrostem masy mięśni

o około 32% i zmniejszeniem zawartości tłuszczu o około 8% oraz lepszym

wykorzystaniem paszy. Analiza molekularna DNA przeprowadzona u rodzin

referencyjnych z wykorzystaniem 21 markerów genetycznych bydła umoż-

liwiła zmapowanie genu hipertrofii mięśniowej w 18 chromosomie. Jest to

pojedynczy autosomalny gen, nazwany callipyge (z greckiego calli — piękne,

pyge -- pośladki) -- symbol CLPG. Prowadzone są badania w celu jego

izolacji. Przypuszcza się, że istnieją dwa allele — CLPG i clpg, przy czym

zwierzęta o genotypie CLPG/clpg cechuje hipertrofia, natomiast osobniki

z genotypem clpg/clpg i CLPG/CLPG mają normalny fenotyp. Jak wykazały

ostatnie badania, w przypadku genotypu heterozygotycznego wystąpienie

hipertrofii zależy od tego, czy gen CLPG pochodzi od ojca, czy od matki.

Gen CLPG pochodzący od matki jest nieaktywny. Hipertrofia ujawnia się

u potomka wówczas, gdy dziedziczy on gen CLPG od ojca (piętno game-

tyczne). Ostatnio ustalono, że podłoże molekularne tej cechy związane jest

z mutacją w niekodującym regionie DNA. Jest to substytucja nukleotydowa

→G w regionie niekodującym żadnego białka. Przypuszcza się, że locus

ten podlega transkrypcji, a jego produkt to niekodujący RNA (ncRNA -

ang. noncoding RNA), który pełni nieznaną jeszcze funkcję regulacyjną.

Gen wysokiej plenności (BMPR-IB) u owiec rasy merynos

booroola. U owiec wykryto geny główne, warunkujące zwiększony stopień

owulacji, takie jak gen Inverdale (FecX

, zlokalizowany w chromosomie

płci X)

196

u owiec rasy romney, „Thoka" u owiec islandskich, gen wysokiej plenności

u owiec rasy olkuskiej w Polsce czy u syntetycznej rasy owiec Cambridge.

Jednak najbardziej znany jest gen wysokiej plenności zidentyfikowany na

początku lat 80. ubiegłego wieku u owiec rasy merynos booroola w Australii

i określony wówczas symbolem FecB (ang. fecundity gene of booroola).

W przeciwieństwie do owiec ras wysokopiennych (owca romanowska, owca

fińska), u których zwiększona plenność jest cechą poligeniczną, uwarun-

kowaną genami o addytywnym efekcie, wysoki stopień owulacji u maciorek

rasy merynos booroola jest wynikiem wpływu genu FecB na rozwój

pęcherzyków Graafa i ciałek żółtych. Ponadto maciorki mające ten gen

w swym genotypie wydzielają mniej hormonów inhibitorów działających

na hormony gonadotropowe.

Ponieważ obecność nawet jednej jego kopii w genotypie maciorki

powoduje znaczny wzrost stopnia owulacji (w konsekwencji zwiększa jej

plenność o około l jagnię w miocie), w niektórych krajach czynione są

próby wprowadzenia tego genu do ras miejscowych i wykorzystania go

w programach intensyfikacji produkcji żywca jagnięcego.

Prowadzone przez badaczy nowozelandzkich badania segregacji cechy

dużej plenności w rodzinach referencyjnych, połączone z badaniami

polimorfizmu w loci markerowych (markery klasy I i II), wskazały lokalizację

tego genu w chromosomie 6 (6q23-q21). Dalsze wieloletnie badania z za-

stosowaniem metod genetyki molekularnej zaowocowały wykryciem w 2001

roku mutacji w genie receptora białka oznaczonego symbolem BMP-IB,

odpowiedzialnej za dużą plenność owiec rasy merynos booroola. W locus

BMPR-IB wykryto mutację w 830 nukleotydzie, polegającą na tranzycji

adeniny na guaninę, której konsekwencją jest zamiana glutaminy na argininę

w pozycji 249 łańcucha polipeptydowego. Opracowany test molekularny

(PCR-RFLP) identyfikacji genotypu w locus BMPR-IB z zastosowaniem

restryktazy AvaII wykorzystuje to, że mutacja powoduje powstanie sekwencji

rozpoznawanej przez ten enzym. Obraz rozdziału elektroforetycznego

zamplifikowanego i strawionego enzymem fragmentu genu BMPR-IB,

zawierającego miejsce mutacyjne, będzie następujący: 2 prążki (110 pz

i 30 pz) dla osobników homozygotycznych pod względem allelu zmutowa-

nego, trzy prążki (110 pz, 30 pz i 140 pz) dla heterozygotycznego i jeden

prążek (140 pz; produkt PCR nie strawiony) dla homozygoty typu dzikiego.

Rozdział

Podstawy genetyki populacji

Przedstawione w poprzednich rozdziałach genetyczne uwarunkowania

zmienności cech i mechanizmy ich dziedziczenia, mimo iż dotyczyły nieraz

grupy zwierząt, w istocie odnoszone były do genotypu czy zwierzęcia jako

jednostki. Wiele zjawisk i procesów nie dotyczy jednak pojedynczych

osobników, lecz zbiorowości określonej jako populacja. Hodowla jest

działalnością genetyczno-populacyjną. Populację stanowią zwierzęta należące

do jednego gatunku, mogące się rozmnażać i występować na danym

obszarze. Suma wszystkich genów występujących w genotypach zwierząt

tworzących populację nazywa się pulą genową.

Szczegółowe omówienie wszystkich zagadnień z zakresu genetyki

populacji zainteresowani znajdą w innych podręcznikach. W rozdziale

tym przedstawiono jedynie zagadnienie struktury genetycznej populacji

oraz wykorzystanie frekwencji alleli w szacowaniu zmienności gene-

tycznej.

Podstawowym prawem genetyki populacji, opisującym częstość wystę-

powania (frekwencję) poszczególnych alleli i genotypów, jest prawo

równowagi genetycznej sformułowane w 1908 roku przez angielskiego

matematyka G.H. Hardy'ego i niemieckego lekarza W. Weinberga. Ponie-

waż badacze ci działali niezależnie od siebie, prawo to nosi nazwę

Hardy' ego-Weinberga.

8.1. Prawo równowagi genetycznej

Struktura genetyczna populacji

Populację tworzy określona, teoretycznie nieskończona liczba osobników.

Rozpatrując daną cechę można powiedzieć, że każdy osobnik ma określony

fenotyp, tak więc w populacji występuje określona liczba fenotypów,

198

z których każdy reprezentowany jest przez pewną liczbę osobników.
Częstość występowania, inaczej frekwencja danego fenotypu, oznacza
stosunek tego fenotypu do całkowitej liczby fenotypów. Frekwencję wyra-
żamy w procentach lub w postaci ułamka dziesiętnego. Suma frekwencji
wszystkich fenotypów równa się l lub 100%. Z kolei stosunek liczby
osobników o danym genotypie do ogólnej liczby osobników występujących
w populacji określamy mianem frekwencji genotypów. Natomiast frekwencja
genów jest to udział liczby loci zajętych przez dany allel względem ogólnej
liczby loci, które ten allel mógłby zająć w badanej populacji. Frekwencja
genotypów i frekwencja genów są elementami składowymi ogólniejszego
pojęcia — struktury genetycznej populacji. Oba te elementy są od siebie
zależne. Frekwencja genów w danym pokoleniu zależy od frekwencji
poszczególnych genotypów, natomiast frekwencja genotypów w pokoleniu
następnym zależy od frekwencji genów w gametach pokolenia poprzedniego
(rodzicielskiego).

Obliczenie frekwencji genów na podstawie fenotypów jest najprostsze

w przypadku cech dziedziczących się pośrednio (z niezupełną dominacją).
Fenotyp osobnika jest bowiem odzwierciedleniem jego genotypu. Sposób
postępowania obrazuje poniższy przykład.

W stadzie kur andaluzyjskich (barwa upierzenia dziedzicząca się z nie-

zupełną dominacją) liczącym 1000 ptaków jest 250 ptaków czarnych, 250
białych i 500 o upierzeniu niebieskim (andaluzyjskim). Frekwencja po-
szczególnych fenotypów i jednocześnie genotypów jest następująca:

Łączna liczba alleli warunkujących omawianą cechę wynosi 2000 (1000

ptaków, każdy ma dwa allele). 250 ptaków czarnych ma w swych genotypach

500 genów A, ptaki niebieskie mają 500 genów A i 500 genów a. W genoty-

pach 250 ptaków białych jest 500 alleli a. Zatem w stadzie tym jest 1000 alleli

A i 1000 a.

Częstość występowania (frekwencja) allelu A = 1000/2000 = 0,5 (50%),

podobnie frekwencja allelu a = 1000/2000 = 0,5 (50%).

Suma frekwencji obu alleli wynosi l (100%). Jeśli frekwencję allelu

dominującego oznaczymy symbolem p, a allelu recesywnego symbolem q, to:

199

Rozpatrywana cecha dziedziczy się z niezupełną dominacją, zatem rozkład
fenotypów i genotypów w tej populacji wynosi:

Suma frekwencji genotypów jest rozwinięciem kwadratu dwumianu (p + q)

i wynosi l (100%). Jeśli w populacji będą kojarzenia losowe oraz będzie
jednakowa frekwencja genów u obu płci, wówczas struktura genetyczna
w pokoleniu potomnym będzie następująca:

czyli:

Zatem struktura genetyczna populacji w pokoleniu potomnym jest taka
sama jak w pokoleniu rodzicielskim. Prawidłowość ta zawarta jest w prawie
Hardy 'ego-Weinberga, które mówi o tym, że: w dużej, losowo
kojarzącej się populacji, w której frekwencje genów u obu płci są jednakowe,
a osobniki charakteryzują się równą płodnością i żywotnością,
frekwencje genów i genotypów nie zmieniają się z pokolenia na pokolenie,
jeśli nie działają czynniki naruszające równowagę.

Prawo to rzadko jest spełnione w odniesieniu do wszystkich loci,

bowiem nawet w naturalnych populacjach następuje dobór naturalny
i selekcja naturalna, a' zdarzają się również migracje i mutacje, które
wpływają na zmianę struktury genetycznej populacji. O czynnikach naru-
szających równowagę genetyczną będzie mowa nieco dalej.

200

8.2. Frekwencja genów i genotypów w

przypadku dominowania

W przypadku cechy dziedziczącej się z dominacją zupełną fenotyp domi-
nujący występuje u osobników będących homozygotą dominującą lub
heterozygotą pod względem danego locus. Zatem obliczanie frekwencji
zarówno tych genotypów, jak i genów stwarza pewne trudności. W populacji
rozmnażanej losowo źródłem informacji do obliczeń frekwencji genów jest
częstość genotypów homozygotycznych recesywnych, gdyż w ich przypadku
wiadomo na pewno, że zawierają jedynie allele recesywne. Wiedząc, że
frekwencja homozygot recesywnych wynosi q

, łatwo jest wyliczyć frekwen-

cję allelu recesywnego

Z kolei frekwencja allelu dominującego

wynosi p = l— q.

Tok postępowania obrazuje poniższy przykład:

W pewnym stadzie bydła na 1000 krów 910 jest czarno umaszczonych, a 90

czerwonych. W stadzie tym prowadzone są kojarzenia losowe. Frekwencja
genotypów recesywnych (osobniki czerwone — ee) wynosi 0,09. Pozostałe 910
krów ma genotypy homo- (E

) lub heterozygotyczne (E

e). Znając frekwencję

genotypu recesywnego (ee) można obliczyć frekwencję allelu czerwonego
umaszczenia e —q, która wynosi

Stąd frekwencja genu

czarnego umaszczenia (E

= p) wynosi l —0,3 = 0,7. Wiedząc, że w przypadku

losowych kojarzeń rozkład genotypów jest następujący:

łatwo jest obliczyć frekwencję pozostałych genotypów:

W stadzie tym na 910 krów czarno umaszczonych należy oczekiwać 490

osobników o genotypach homozygotycznych dominujących i 420 hetero-

zygot. Podany sposób obliczania częstości genów i genotypów stosuje się do

populacji będących w stanie równowagi genetyczej.

8.3. Frekwencja genów i genotypów w przypadku

cech uwarunkowanych szeregiem (serią)

alleli wielokrotnych

W przypadku cech warunkowanych szeregiem alleli wielokrotnych

rozkład genotypów w populacji będzie następujący:

201

przy czym p,q, r lub inne litery symbolizują częstość występowania genów

w szeregu alleli wielokrotnych. Suma frekwencji wszystkich alleli tworzących

szereg wynosi l (100%). Sposób obliczania frekwencji poszczególnych

genów i genotypów zostanie przedstawiony na przykładzie cechy warun-

kowanej szeregiem złożonym z trzech alleli.

U królików podstawowe typy umaszczenia warunkowane są szeregiem

alleli wielokrotnych

Umaszczenie dzikie warunkuje gen C,

himalajskie —

i albinotyczne — gen c w układzie homozygotycznym

(cc). W rozmnażającej się losowo populacji złożonej ze 150 królików

stwierdzono 135 osobników dziko umaszczonych (pełna barwa), 13

himalajskich i 2 albinosy. Frekwencja poszczególnych fenotypów wynosi

zatem:

Frekwencję genów oznaczono symbolem p dla genu C, q dla genu

dla

genu c.

W populacji tej, w której są kojarzenia losowe, fenotypy, genotypy i ich

frekwencja są następujące (tab. 8-1):

202

Po dodaniu takich samych genotypów uzyska się rozkład:

Z zestawienia tego wynika, że suma częstości fenotypów umaszczenia

himalajskiego i albinotycznego wynosi:

Zatem suma częstości genów d

i c wynosi q + r i równa się pierwiastkowi

kwadratowemu z sumy częstości występowania fenotypów umaszczenia

himalajskiego i albinotycznego. Podstawiając dane liczbowe, (q + r) równa

się:

Frekwencję genu c = r można obliczyć, znając frekwencję fenotypu (jedno-
cześnie genotypu) królików albinotycznych (cc). W danym przykładzie
r

= 0,013, stąd r =

= 0,114.

Frekwencję genu

można obliczyć następująco:

W badanej populacji królików frekwencja genów umaszczenia jest więc

następująca:

203

ogółem = 1,000

8.4. Frekwencja genów i genotypów w przypadku

cech sprzężonych z płcią

W odróżnieniu od cech warunkowanych genami znajdującymi się w chromo-

somach autosomalnych, których liczba w genotypach jest jednakowa bez

względu na płeć osobnika, geny warunkujące cechy sprzężone z płcią mogą

występować także w formie hemizygotycznej.

Osobniki płci heterogametycznej mogą mieć jedynie dwa rodzaje

genotypów pod względem cechy sprzężonej z płcią (cecha występuje lub

nie na skutek braku genu, który ją warunkuje). U osobników homo-

gametycznych dodatkowo może wystąpić nosicielstwo genu recesywnego

(osobniki heterozygotyczne).

Rozkład genotypów u osobników płci heterogametycznej nie będzie

zatem rozkładem dwumianowym, lecz przyjmie postać:

przy czym A jest genem dominującym, natomiast a — jego recesywnym allelem.

Natomiast u osobników homogametycznych frekwencja poszczególnych

genotypów będzie taka jak w przypadku cech autosomalnych, czyli zgodna

z rozkładem dwumianowym.

U ludzi jedną z najczęściej występujących cech sprzężonych z płcią jest

daltonizm. Frekwencja genu d warunkującego daltonizm w populacji

ludzkiej wynosi średnio q = 0,08. Na tej podstawie można oszacować

częstość występowania daltonizmu zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn.

U kobiet (płeć homogametyczna) frekwencja poszczególnych genotypów

pod względem tej cechy wynosi:

U mężczyzn (płeć heterogametyczna) frekwencja genotypów jest równa

frekwencji genów rozróżniania barw lub daltonizmu:

204

D - = p = 0 , 9 2

d- = q = 0,08

Zatem wśród 10000 kobiet daltonizm (dd) wystąpi u 64, 1472

kobiety będą rozróżniały barwy, ale będą nosicielkami genu daltonizmu
(Dd), pozostałe zaś 8464 nie mają w swych genotypach genu daltonizmu
(DD). W grupie mężczyzn o tej samej liczebności aż 800 mężczyzn
będzie daltonistami (d — ), pozostali natomiast (9200) będą normalnie
rozróżniać barwy (D — ).

8.5. Czynniki naruszające równowagę genetyczną

Do czynników naruszających równowagę genetyczną populacji należą:
mutacje, migracje, selekcja, dobór par do kojarzeń i dryf genetyczny. O ile
mutacje i dryf genetyczny nie zależą od hodowcy, o tyle pozostałe czynniki
są związane z jego świadomą działalnością. Wszystkie te czynniki, z wyjąt-
kiem doboru, wpływają na zmianę frekwencji genów i genotypów. Dobór
zmienia jedynie frekwencję genotypów (będzie o tym mowa dalej).

Mutacje

Mutacje genowe zmieniając frekwencję genów naruszają równowagę
genetyczną populacji. W następstwie tych mutacji nie tylko ulega zmianie
frekwencja alleli istniejących w danym locus, ale także mogą się pojawić
nowe allele. Konsekwencją zmiany frekwencji genów jest zmiana frekwencji
genotypów.

Ekspresja fenotypowa mutacji, która może wpłynąć na zmianę struktury

genetycznej populacji, zależy od genetycznego uwarunkowania danej cechy.
Jeśli zmutuje jeden z genów addytywnych, kontrolujących cechę ilościową,
mutacja ta może być fenotypowo niezauważalna i nie ma wówczas szans
na utrwalenie jej w drodze selekcji. Natomiast mutacja genu warunkującego
cechę jakościową, np. umaszczenie zwierząt futerkowych, powodująca
pojawienie się nowej barwy okrywy włosowej, może przyczynić się do
wytworzenia odmiany z frekwencją genów umaszczenia inną niż w popu-
lacji, w której mutacja wystąpiła.

W rozdziale dotyczącym mutacji podano, iż częstość mutacji allelu

dominującego w recesywny oznaczamy symbolem u,  natomiast częstość
mutacji odwrotnej symbolem v.  Jeśli zmutuje allel dominujący, jego
frekwencja zmaleje o wartość równą  up.  Analogicznie, mutacja allelu
recesywnego spowoduje zmniejszenie jego frekwencji o vq. Łączna zmiana
frekwencji allelu recesywnego w przypadku dwukierunkowej mutacji
wyniesie:

205

Frekwencja allelu dominującego zmieni się o wartość:

Na przykład: w pewnym stadzie liczącym 100 krów frekwencja allelu

czarnego umaszczenia (locus E) wynosiła E

= p = 0,7, allelu czerwonego

umaszczenia e = q = 0,3. Pula alleli w tym locus składała się z 140 alleli

czarnego i 60 alleli czerwonego umaszczenia. W wyniku mutacji genowej,

której częstość była taka sama dla allelu dominującego i recesywnego

i wynosiła 0,1,14 alleli E

zmutowało w kierunku allelu e, a 6 alleli e w kierunku

allelu E

. W konsekwencji frekwencja allelu E

zmieniła się o wartość:

i wyniosła 0,66, natomiast częstość allelu e zmieniła się o:

czyli wzrosła do 0,34.

Zmianie uległa także frekwencja genotypów. Zgodnie z prawem Har-

dy'ego-Weinberga frekwencja genotypów w tym stadzie była następująca:

przed mutacją: E

= p

= 0,49; E

e = 2pq = 0,42; ee = q

= 0,09, po

mutacji: E

= p

= 0,4356; E

e = 2pq = 0,4488; ee = q = 0,1156.

Migracje

Migracje zwierząt polegają na wprowadzaniu nowych osobników do stada

lub ich usuwaniu. Wpływ tego czynnika na strukturę genetyczną populacji

zostanie omówiony na przykładzie imigracji (wprowadzania) osobników do

populacji.

Przy krzyżowaniu różnych ras w zależności od tego, ile razy dokonywane

jest to krzyżowanie, wielkość zmian frekwencji genów i genotypów jest różna.

Jeśli jest to zabieg jednorazowy, po pewnym czasie populacja wróci do

równowagi, czyli ustali się nowy układ genetyczny. Natomiast krzyżowanie

uszlachetniające, które polega na kilkakrotnym przekrzyżowaniu pogłowia

prymitywnego z rasą szlachetną, powoduje zdecydowaną zmianę frekwencji

genów istniejących w populacji wyjściowej. Może nawet, w przypadku

wielokrotnego krzyżowania, doprowadzić do całkowitego wyparcia genów rasy

prymitywnej przez geny rasy szlachetnej (jest to tzw. krzyżowanie wypierające).

W hodowli niektórych gatunków zwierząt stosowana jest sztuczna

inseminacja, zatem migracja nie zawsze wiąże się z wprowadzaniem

osobników, może ona dotyczyć wprowadzania nasienia. Sztuczna insemina-

cja może powodować bardzo szybkie rozpowszechnianie genów.

Rozpatrzmy przykład wprowadzenia do populacji (stada) jakiejś grupy

zwierząt. Jeśli stosunek nowo wprowadzonych genotypów do całkowitej

liczby genotypów w populacji po imigracji (jest to intensywność imigracji)

206

oznaczymy literą m, to część osobników rodzimych będzie równa (1 —m).

Z kolei frekwencję genu w stadzie wyjściowym oznaczamy literą p,

a frekwencję genu u osobników wprowadzonych do stada literą p', zatem

nowa frekwencja genu będzie równa:

a zmiana frekwencji tego genu będzie wynosiła:

Załóżmy, że do omawianego wcześniej stada liczącego 100 krów, w którym

frekwencja allelu E

wynosiła 0,7, wprowadzono 20 krów, z frekwencją allelu

wynoszącą 0,9. Frekwencja genotypów w stadzie wynosiła:

= p

= 0,49; E

e = 2pq = 0,42; ee = q= 0,09

natomiast w grupie zwierząt imigrantów:

= p

= 0,81; E

e = 2pq = 0,18; ee = q = 0,01. Nowa

frekwencja allelu E

wynosi teraz:

= 0,2 • 0,9 + (l -0,2) • 0,7 = 0,74

czyli wzrosła o 0,4. Nowa frekwencja allelu e wynosi (1 — 0,74) = 0,26.

Można to sprawdzić za pomocą wzoru:

Frekwencja poszczególnych genotypów w stadzie po imigracji przedstawia

się następująco:

= p

= 0,5476; E'e = 2pq = 0,3848; ee = q

= 0,0676

Po imigracji w stadzie wzrosła liczba zwierząt z genotypem homozygotycz-

nym E

, zmalała osobników heterozygotycznyh E

e i homozygotycznych ee.

Wielkość zmiany frekwencji genotypów w przypadku imigracji zależy od

intensywności imigracji (m) oraz różnicy we frekwencji genów między

zwierzętami w danej populacji i osobnikami wprowadzonymi do niej.

Selekcja

Wybór zwierząt, które hodowca zamierza pozostawić do hodowli, nazywany

jest selekcją. Hodowca preferuje geny korzystne, a eliminuje z populacji

zwierząt geny niepożądane. Selekcjonując zwierzęta najlepsze hodowca

pozostawia w populacji określone genotypy. Równocześnie z selekcją

prowadzone jest brakowanie (usuwanie) zwierząt w związku z ich nieprzy-

datnością wynikającą z wieku, stanu zdrowotnego, obniżenia płodności

i produkcyjności lub niepożądanego genotypu. Zmiany w strukturze genety-

cznej populacji zależą od tego, jakie geny czy genotypy są preferowane.

Zmiany te są trwałe i pozostają nawet po zaprzestaniu prowadzenia selekcji.

207

Siłę oddziaływania selekcji określa się mianem współczynnika selekcji

i oznacza symbolem s. Współczynnik ten może przybierać wartość od O do l,
co oznacza, że wartość O jest wówczas, gdy nie ma w ogóle selekcji, wartość
l współczynnik osiąga, gdy usuwane są wszystkie niepożądane genotypy.

Zmiana frekwencji genu, będąca konsekwencją selekcji, zależy od rodzaju

tej selekcji. Jeśli selekcja w zakresie cechy dziedziczącej się z dominacją
zupełną prowadzona jest przeciwko genotypom recesywnym, zmianę
częstości genu recesywnego, będącą jej konsekwencją, można obliczyć ze

wzoru:

Jeśli natomiast selekcja preferuje genotyp recesywny, wówczas frekwencja

genu tworzącego ten genotyp wyniesie:

Od pewnego czasu w hodowli bydła cecha rogatości jest uważana za

niekorzystną. Cecha ta dziedziczy się z dominacją zupełną, czyli osobniki

bezrogie mają genotyp homozygoty dominującej lub heterozygotyczny pod

względem locus P (polled). W pewnym stadzie, w którym frekwencja allelu

bezrożności wynosi 0,8, prowadzona jest selekcja przeciwko genotypowi

recesywnemu pp. Jeśli współczynnik selekcji będzie wynosić 0,4, to oznacza,

że w każdym pokoleniu będzie usuwanych 40% osobników z genotypem

homozygoty recesywnej. Wówczas korzystając ze wzoru możemy obliczyć

wielkość zmiany częstości genu recesywnego:

Frekwencja allelu recesywnego w stadzie w wyniku selekcji przeciwko

genotypowi recesywnemu zmniejszy się o 0,013 i wyniesie 0,187.

Jeśli selekcję przeprowadzimy tylko w jednym pokoleniu i nie będą

działały inne czynniki naruszające równowagę genetyczną populacji, wów-

czas w pokoleniu potomnym ustali się nowa frekwencja genów oraz

genotypów i populacja wróci do równowagi. Efekt selekcji zostanie za-

chowany.

Dobór par do kojarzeń

W hodowli zwierząt nie zawsze stosowane są kojarzenia losowe. Jeśli celowo

dobierane są zwierzęta w pary rodzicielskie, prowadzi to do naruszenia

równowagi genetycznej populacji poprzez zmianę frekwencji genotypów.

Załóżmy, że w omawianym już wcześniej stadzie kur andaluzyjskich,

złożonym z 1000 ptaków, zastosowano kojarzenia w obrębie takich samych

208

genotypów. Oznacza to, iż kojarzono koguty czarne z kurami czarnymi,

koguty niebieskie (forma pośrednia cechy) z kurami niebieskimi i koguty

białe z kurami białymi. W stadzie tym frekwencja genów jest jednakowa

u osobników obu płci i wynosi p = 0,5 (allel A) i q = 0,5 (allel a). W

pokoleniu rodzicielskim frekwencja genotypów była następująca:

0,25 AA + 0,5 Aa + 0,25 aa = l

Po zastosowaniu kojarzeń „podobnego z podobnym" frekwencja uległa

zmianie

Frekwencja genów pozostała nie zmieniona, pod warunkiem że hodowca

nie prowadził selekcji i nie wprowadzono do stada nowych zwierząt. Aby

się o tym przekonać, można przeprowadzić obliczenia:

Jeżeli hodowca znów zastosuje kojarzenia losowe w stadzie i nadal nie
będzie prowadzić selekcji, stado powróci do stanu równowagi genetycznej.

Przy kojarzeniach osobników o genotypach identycznych wzrasta frek-

wencja genotypów homozygotycznych, maleje natomiast częstość genoty-

pów heterozygotycznych. Odwrotna sytuacja zaistniałaby, gdyby kojarzono

między sobą osobniki będące przeciwstawnymi homozygotami. Wówczas

zwiększyłaby się częstość genotypów heterozygotycznych kosztem homo-

zygotycznych.

Niekiedy, na przykład w celu wzmocnienia (utrwalenia danej cechy)

w populacji, stosowane są kojarzenia osobników spokrewnionych, np.

ojca z córką czy matki z synem. Kojarzenia takie powodują wzrost

częstości występowania homozygot w pokoleniu potomnym. W hodowli

zwierząt laboratoryjnych kojarzenia w bliskim pokrewieństwie (najczęściej

209

brat x siostra) prowadzą do wytworzenia tzw. szczepów wsobnych, w któ-

rych stopień homozygotyczności jest bliski 100%. Szczepy wsobne są

wykorzystywane w badaniach biomedycznych.

Dryf genetyczny

Dryf genetyczny, zjawisko tak nazwane przez Wrighta w 1931 roku, polega

na zmianie frekwencji genów i genotypów w małych populacjach, która jest

wynikiem odchyleń w losowej segregacji genów do gamet i losowego

łączenia się gamet. Dryf genetyczny jest zjawiskiem całkowicie niezależnym

od woli hodowcy. Rozkład genotypów w pokoleniu potomnym zależy od

frekwencji genów u rodziców. Prawidłowość tego rozkładu wynika z praw-

dopodobieństwa losowego połączenia gamet w następstwie kojarzeń loso-

wych. Wszelkie odstępstwa od oczekiwanego rozkładu są konsekwencją

dryfu genetycznego, zwłaszcza w małych populacjach, w których działa on

najsilniej. Dryf przyczynia się do zwiększania się różnic między małymi

populacjami w zakresie struktury genetycznej, jednocześnie zmniejsza się

zmienność genetyczna w obrębie poszczególnych populacji. Niekorzystnym

następstwem dryfu jest także wzrost frekwencji genotypów homozygotycz-

nych kosztem heterozygotycznych. Biorąc pod uwagę, iż allele niekorzystne

z reguły są recesywne, szczególnie niebezpieczny może być wzrost homo-

zygot recesywnych, którego skutkiem będzie zmniejszenie płodności,

żywotności czy ujawnienie się wad dziedzicznych.

Dla zobrazowania tego zjawiska grupę 20 owiec heterozygotycznych pod

względem locus A skrzyżowano z trykiem również heterozygotycznym w tym

locus. Przy losowej segregacji genów do gamet i losowym łączeniu gamet

w zygoty należy oczekiwać, iż w potomstwie uzyskamy 5 osobników homozygot

dominujących, 10 heterozygot i 5 homozygot recesywnych pod względem

rozpatrywanego locus. Może jednak się zdarzyć tak, że jedynie plemniki

zawierające allel dominujący wnikną do komórek jajowych. Wtedy w potomst-

wie będzie 10 osobników (50%) homozygot dominujących i 10 heterozygot. Jeśli

było to jednorazowe zaburzenie, to w następnym pokoleniu ustali się nowa

równowaga genetyczna, w której frekwencja genu dominującego wyraźnie

wzrośnie. Jeżeli zaburzenie kojarzeń losowych będzie się powtarzać, to struktura

genetyczna populacji będzie się zmieniać (dryfować) w różnych kierunkach.

8.6. Wykorzystanie frekwencji alleli do szacowania

zmienności genetycznej wewnątrz i między

populacjami

Zmienność genetyczna ma ogromne znaczenie dla wszystkich gatunków

zwierząt. Im większa jest pula genów w jakiejś populacji, tym silniejsze są

zdolności adaptacyjne tej populacji do zmiennych warunków środowisko-

210

wych. Na skutek długotrwałej selekcji, zwłaszcza w małych populacjach,
może dojść do znacznego ograniczenia puli genów, czego wynikiem będzie
utrata zdolności adaptacyjnych. By temu niekorzystnemu zjawisku zapobiec,
zalecane jest monitorowanie zmian w strukturze genetycznej populacji,
które zachodzą w wyniku pracy hodowlanej. W tym celu szacuje się
zmienność genetyczną w populacji na podstawie frekwencji alleli w loci
markerowych, na przykład warunkujących antygeny erytrocytarne, różne
typy białek surowicy krwi czy enzymy erytrocytarne. Mogą to być loci
kontrolujące syntezę transferyny, albuminy, esterazy, amylazy, ceruloplaz-
miny czy anhydrazy węglanowej, należące do markerów genetycznych
klasy I, opisanych w rozdziale: Markery genetyczne. Od pewnego czasu do
tego celu wykorzystywane są niekodujące sekwencje DNA (polimorfizm
mini- i mikrosatelitarny, czyli markery genetyczne klasy II).

Parametrem charakteryzującym zmienność genetyczną w populacji jest

współczynnik heterozygotyczności. Wartość tego parametru zawiera się
w granicach od O do l, można także przedstawiać ją w procentach. Średnia
heterozygotyczność (H) w danej populacji obliczana jest ze wzoru:

211

Parametrem charakteryzującym stopień zmienności (polimorficzności)

danego locus jest wskaźnik określany symbolem PIĆ (ang. polymorphic

Information content). Jednak najczęściej parametr ten służy do określenia

przydatności danego markera genetycznego do analizy sprzężeń z

innymi loci. O markerach genetycznych jest mowa w innym

rozdziale. By obliczyć wartość PIĆ, należy znać frekwencję wszystkich

alleli w danym locus:

Dystans genetyczny

Zróżnicowanie genetyczne między populacjami można określić

porównując częstość występowania określonych genów w tych

populacjach i szacując tzw. dystans genetyczny na podstawie

polimorfizmu grup krwi i białek lub sekwencji mikrosatelitarnych.

Sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się wyjątkowo wysokim

stopniem polimorfizmu i dzięki temu są bardziej przydatne niż markery

klasy I do szacowania dystansu genetycznego między gatunkami

blisko ze sobą spokrewnionymi, a także między populacjami w obrębie

gatunku.

Szacowanie dystansu genetycznego i wybór ras, które cechuje duża

zmienność genetyczna, służy zachowaniu biologicznej różnorodności

zwierząt gospodarskich. Do szacowania dystansu genetycznego (Dr), tak

na podstawie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych, jak i

polimorfizmu białek i antygenów erytrocytarnych, najczęściej stosowany

jest wzór:

Dystans genetyczny może być przedstawiany graficznie w postaci

dendrogramów, obliczonych różnymi metodami, na przykład:

najbliższego sąsiedztwa — SLM (ang. single linkage method),

najdalszego sąsiedztwa — CLM (ang. complete linkage method) lub

skupienia parami — UPGM (ang. unweighted pair group method).

212

Sposób szacowania dystansu genetycznego obrazuje poniższy przykład

(wg: Niemczewski i wsp., Prace i Materiały Zootechniczne, 50:111-120, 1997).

Na podstawie frekwencji alleli w 14 loci obliczono dystans genetyczny

między liniami męskimi koni czystej krwi arabskiej ze stadnin państwowych.

Częstość występowania poszczególnych alleli zawarto w tabelach 8-II i 8-III.

Analizą objęto 141 koni z linii El Paso, 219 z linii Palasa, 146 z linii Celebesa,

150 z linii Banata, 369 z linii Probata, 146 z linii Partnera i 202 z linii Bandosa.

Do sporządzenia dendrogramu dystansu genetycznego wykorzystano ob-

liczenia wykonane metodą najbliższego sąsiedztwa — SLM. Największy

dystans genetyczny stwierdzono między liniami El Paso i Celebesa, naj-

mniejszy między linią Celebesa a Probata, Palasa a Partnera, a także między

linią Banata a Celebesa i Probata. Na przykład, wartość dystansu genetycz-

nego między liniami Celebesa a Banata wyniosła 0,32, Partnera a Banata 0,39

oraz Palasa a Partnera 0,37 (ryć. 8-1).

213

Do szacowania zmienności genetycznej i dystansu genetycznego wyko-

rzystuje się również markery genetyczne klasy II (sekwencje mikro-

i minisatelitarne), a także metodę RAPD, opisaną w rozdziale: Metody

analizy i modyfikacji genomu. W przypadku polimorfizmu mikrosatelitar-

nego postępowanie jest podobne do opisanego wyżej. W wyniku analizy

polimorfizmu minisatelitarnego (tzw. odcisk palca DNA, opisany w rozdziale:

Markery genetyczne) i RAPD uzyskujemy obraz prążków DNA w danej

próbie DNA (może to być DNA jednego osobnika bądź zbiorczy DNA dla

grupy osobników losowo wybranych z populacji). Porównując wzory

prążkowe dwóch prób DNA można obliczyć indeks podobieństwa BS

- ang. band sharing), określający prawdopodobieństwo, że prążek wy-

stępujący w jednej próbie będzie wykryty także w drugiej próbie DNA,

wykorzystując wzór:

gdzie:

— liczba identycznych prążków w obu próbach DNA (a i b)

— całkowita liczba prążków odpowiednio w próbie a i próbie b

Wartość tego prawdopodobieństwa zawiera się w granicach 0-1. Im

mniejsza zmienność genetyczna w danej populacji, tym większa wartość

tego współczynnika.

Rozdział

Determinacja i różnicowanie płci

oraz interseksualizm

Ewolucja kręgowców doprowadziła do powstania różnych mechanizmów

determinujących płeć organizmów. Płeć może zależeć od warunków

środowiska zewnętrznego, głównie temperatury, w jakich rozwijają się

zarodki. Przy takim mechanizmie determinacji zostaje ona ustalona raz

w momencie różnicowania się gonad i nie zmienia się przez całe życie. Ten

typ determinacji płci obserwuje się u wielu gatunków gadów, w tym

u wszystkich krokodyli, wielu gatunków żółwi i niektórych gatunków

jaszczurek. Z kolei u niektórych gatunków ryb zachodzi tzw. behawioralna

determinacji płci. Zwierzęta takie są zazwyczaj obojnakami, tzn. mają

gonady męskie i żeńskie. Zależnie od środowiska społecznego osobnik

przyjmuje rolę męską lub żeńską. Wśród ryb spotyka się również gatunki,

które są hermafrodytami sekwencyjnymi, czyli zmieniają one płeć w ciągu

życia. U ptaków i ssaków płeć osobnika zależy od układu chromosomów

płci, a konkretnie od genotypu w loci odpowiedzialnych za kształtowanie

cech płciowych. W przypadku ssaków wyróżnia się chromosomy X oraz Y,

a w przypadku ptaków Z oraz W. U ssaków płcią heterogametyczną są

samce (układ XY), a płcią homogametyczną są samice (układ XX). U ptaków

sytuacja jest odwrotna — samce są homogametyczne (układ ZZ), a samice

heterogametyczne (układ Z W).

9.1. Determinacja płci ssaków

Ukształtowanie się cech płciowych ssaków obejmuje trzy zasadnicze etapy:

1) powstanie w wyniku zapłodnienia układu chromosomów płci XX lub XY

w zygocie — kształtuje się wówczas tzw. płeć chromosomowa, 2) rozwój

niezróżnicowanych gonad zarodka w kierunku jądra lub jajnika — wy-

kształcenie tzw. płci gonadowej i 3) uformowanie się wewnętrznych

216

Dotychczasowe badania wykazały, że różnicowanie się gonad w okresie

rozwoju płodowego jest kontrolowane przez co najmniej 15 genów, a w tym:
WT1, SF1, SOX9, SRY, Fgf9, ZFX i  FOXL2.  Gen WT2 (ang. Wilms' tumor l
gene) został pierwotnie zidentyfikowany jako onkogen odpowiedzialny za
rozwój raka nerki — nowotwór Wilmsa u dzieci. Ekspresję tego genu
stwierdzono również w grzebieniu płciowym rozwijającego się zarodka.
Produktem tego genu jest białko zawierające tzw. palce cynkowe, które pełni
rolę czynnika transkrypcyjnego, czyli kontrolujące uruchomienie i przebieg
transkrypcji innych genów. Gen SF1 (ang. steroidogenic factor 1) koduje białko
receptora jądrowego, regulującego ekspresję hydroksylaz steroidowych. Gen
ten podlega ekspresji, oprócz kory nadnerczy, także w niezróżnicowanej
gonadzie. W ukształtowanej gonadzie męskiej ekspresja genu SF1  nadal
zachodzi, w przeciwieństwie do jajnika, gdzie obserwuje się zanik jego
ekspresji. W jądrze płodowym produkt genu SF1 pojawia się w komórkach
Sertolego i wpływa on na regulację ekspresji genu hormonu antymullerowskie-
go. Trzecim genem oddziałującym na wzrost niezróżnicowanej gonady jest gen
SOX9,  którego produkt należy, podobnie jak białko SRY, do grupy białek
określanych skrótem HMG (ang. high mobility group). Wiadomo o nich, że
pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych.

W rosnącej gonadzie wyróżnia się część korową i rdzeniową. Część

rdzeniowa szczególnie intensywnie rozwija się w gonadzie różnicującej się
w kierunku jądra, a część korowa w jajniku. W rozwijającym się jądrze
istotną rolę dla procesu różnicowania płci męskiej odgrywają komórki
podporowe (Sertolego) i śródmiąższowe (Leydiga).

Od końca lat 50. wiadomo było, że zasadniczą rolę w procesie determina-

cji płci męskiej u ssaków odgrywa chromosom Y. Badania cytogenetyczne
prowadzone u ludzi dowiodły, że w istocie tylko niewielki fragment
krótkiego ramienia chromosomu Y ma podstawowe znaczenie. Przyjęto, że
jest tam zlokalizowany gen TDF (ang. testis determining factor) — czynnik
determinujący jądro. Produkt tego genu miał odpowiadać za tzw. przełącze-
nie rozwojowe, polegające na wprowadzeniu niezróżnicowanej gonady
płodowej na tory rozwoju zmierzające do powstania gonady męskiej.
Badania molekularne pokazały, że funkcja tego genu jest tożsama z funk-
cją genu SRY (ang. sex determining region Y), którego locus występuje
w chromosomie Y. Gen SRY zbudowany jest z pojedynczego eksonu
i koduje informację o peptydzie składającym się z ponad 200 aminokwasów.
Białko kodowane przez ten gen składa się z trzech regionów (ryć. 9-2).

218

Region środkowy, składający się z 79 aminokwasów, ma strukturę podobną

do białek z grupy HMG, które mają zdolność wiązania się z DNA i dlatego

uważane są za czynniki transkrypcyjne, czyli białka wpływające na urucho-

mienie i przebieg procesu transkrypcji. Bardzo ciekawe jest również to, że

w części poprzedzającej gen SRY znajduje się sekwencja CpG (tzw. wysepka

CpG), w której obrębie występuje sekwencja nukleotydów przyłączająca

czynnik transkrypcyjny WT1, omówiony wcześniej. Białko SRY, tak jak

białka WT1 i SOX9, pełni funkcję czynnika transkrypcyjnego, odpowiedzial-

nego za kontrolę ekspresji genów związanych z różnicowaniem się pierwot-

nej gonady w kierunku jądra. Jego ekspresja zachodzi w grzebieniu

płciowym (listwie płciowej), w momencie kiedy rozpoczyna się proces

formowania gonady męskiej. Bardziej szczegółowe dane wskazują, że

ekspresja genu SRY występuje w różnicujących się komórkach Sertolego.

Na podstawie przedstawionych informacji o sekwencji nukleotydów po-

przedzających gen SRY można przypuszczać, że jego ekspresja jest kon-

trolowana przez produkt genu WTL Z kolei produkt genu SRY zawiaduje

ekspresją genu SOX9, a pod kontrolą genu SOX9 znajdują się geny AMH

i Fgf9 (czynnik wzrostu fibroblastów 9). Kaskadowe włączanie tych genów,

po pojawieniu się produktu genu SRY, odpowiada za prawidłowe róż-

nicowanie się gonady męskiej.

Rozwojowi gonad towarzyszy powstanie zawiązków przewodów wy-

prowadzających komórki płciowe. Z przewodów Wolffa rozwinąć się mogą

nasieniowody, a z przewodów Miillera — jajowody i macica. Zależnie od

przyjętego kierunku rozwoju jeden z tych przewodów zanika, a drugi

rozwija się. W przypadku rozwoju płci męskiej zanikowi podlegają przewody

Miillera. Proces ten jest zależny przede wszystkim od ekspresji genu MIS

(ang. Miillerian inhibitor substance), określanego także jako hormon

antymiillerowski (ang. anti-Mullerian hormone — AMH). Ekspresja tego

genu zachodzi w komórkach Sertolego. Białko AMH wpływa na zatrzymanie

rozwoju i zanik przewodów Miillera. Równolegle w komórkach Leydiga

następuje ekspresja genu kodującego testosteron, który podtrzymuje rozwój

przewodów Wolffa. Z testosteronu powstaje dihydrotestosteron, który pełni

zasadniczą rolę w różnicowaniu się zewnętrznych narządów płciowych.

Gdy gen SRY jest nieobecny, niezróżnicowana gonada płodowa rozwija

się spontanicznie w jajnik. Wiedza na temat kontroli genetycznej róż-

nicowania się jajnika jest dużo mniejsza, aniżeli w odniesieniu do jądra.

Początkowo przypuszczano, że proces ten jest w znacznej mierze kont-

rolowany przez ekspresję genu DAX1. Wiadomo, że jego locus występuje

w chromosomie X, a jego produktem jest jądrowy receptor dla hormonów.

Ekspresja tego genu jest stwierdzana już w niezróżnicowanej gonadzie.

Obecnie większą rolę przypisuje się genowi ZFX (tzw. gen palca cynkowego),

również położonemu w chromosomie X, oraz autosomalnemu genowi

FOXL2 (receptor hormonu stymulującego rozwój pęcherzyków jajnikowych).

W rozwijającym się jajniku nie zachodzi ekspresja genu MIS oraz genu

219

kodującego testosteron. W efekcie następuje spontaniczny rozwój przewo-

dów Miillera w jajowody, macicę i górną część pochwy. Procesowi temu

towarzyszy równoczesny zanik przewodów Wolffa.

Interesujące są wnioski płynące z obserwacji osobników z układem

chromosomów XY, w których genotypie występuje duplikacja locus DSS

(DAX1). U takich osobników następuje rozwój interseksualny

wynikający z niepełnego zróżnicowania gonady w kierunku jądra. Jeśli w

genotypie wystąpi delecja tego locus, to rozwój w kierunku męskim

nie jest zakłócony. Mutacje tego typu (duplikacja lub delecja) nie mają

wpływu na rozwój cech płciowych samic. Zakłada się, że produkt

locus DSS (DAX1) konkuruje z produktem genu SRY w wiązaniu się z

promotorami innych genów odpowiedzialnych za kształtowanie się

gonady męskiej. Jeśli w genotypie osobnika męskiego występują dwie

kopie locus DSS (DAX1), to wówczas dochodzi do zakłócenia procesu

kontroli ekspresji genów przez białko SRY.

Poznanie molekularnych podstaw determinacji płci ma w hodowli duże

znaczenie praktyczne. Wczesna ocena płci zarodków pozwala na uzys-

kiwanie potomstwa o pożądanej płci, jeśli stosuje się nowoczesne biotechniki

rozrodu powiązane z przenoszeniem zarodków do tzw. samic biorczyń.

Zarodki mogą być pozyskiwane od superowulowanych samic dawczyń lub

powstawać podczas zapłodnienia pozaustrojowego (in vitro), czy też klono-

wania. Bardzo przydatną metodą określania płci zarodków jest wykrywanie

sekwencji genu SRY w DNA wyizolowanym z komórek zarodka męskiego.

Zastosowanie znajduje też metoda polegająca na analizowaniu sekwencji

molekularnych genu amelogeniny (AMEL). Gen ten umiejscowiony jest

w obu chromosomach płci, z tym jednak że gen położony w chromosomie

Y obarczony jest delecja (jest krótszy o 63 pary nukleotydów) względem

genu położonego w chromosomie X. Wykrywanie obecności genu SRY oraz

alleli genu amelogeniny prowadzone jest na podstawie amplifikacji techniką

PCR (patrz rozdział: Metody analizy i modyfikacji genomu) wybranego

fragmentu DNA oraz elektroforezy uzyskanych produktów.

Należy również zwrócić uwagę, że w chromosomie Y poza genem SRY,

który pełni zasadniczą rolę w procesie różnicowania się gonady męskiej,

występują także inne geny. Szczególnie istotną częścią chromosomu Y jest

region AZF. Jego nazwa pochodzi od słów angielskich azoospermia factor,

oznaczających czynnik odpowiedzialny za powstanie azoospermii, czyli

brak plemników w ejakulacie. W regionie tym występują geny, których

ekspresja związana jest z przebiegiem spermatogenezy. Delecje w tym

regionie prowadzą do zaburzeń procesu spermatogenezy, takich jak cał-

kowity brak spermatogoniów, lub do zahamowania podziału mejotycznego.

Do tej pory udało się zidentyfikować tylko kilka genów z tego obszaru

chromosomu Y, np. gen RBM (ang. RNA binding motif) biorący praw-

dopodobnie udział w procesie składania (ang. splicing) mRNA. Znane są też

geny położone w innych częściach chromosomu Y, np. gen Ube1Y (ang.

220

ubiąuitin activating enzyme-1), który prawdopodobnie jest zaangażowany

w ubikwitynację histonów w spermatydach, co może z kolei mieć związek

z wymianą histonów na protaminy w chromatynie plemników. Z przed-

stawionych wyżej informacji można wyciągnąć wniosek, że informacja

genetyczna zawarta w chromosomie Y jest bogatsza, niż to wcześniej

zakładano.

9.2. Interseksualizm

Zaburzenie procesu determinacji i różnicowania płci prowadzi do powstania

wrodzonych wad rozwojowych układu rozrodczego, które określa się

terminem interseksualizmu lub obojnactwa. Zaburzenia tego typu wywoły-

wane są przez mutacje chromosomów płci lub mutacje genów zaan-

gażowanych w proces determinacji i różnicowania płci oraz mogą być

skutkiem nieprawidłowego przebiegu ciąży (np. frymartynizm). Precyzyjna

diagnoza przypadków interseksualizmu stwarza niejednokrotnie problemy,

ze względu na bardzo duże zróżnicownie obserwowanych zmian. Kiedy

niemożliwe jest jednoznaczne określenie podłoża obserwowanych zmian,

często takie przypadki klasyfikuje się na dwie kategorie: 1) hermafrodytyzm

prawdziwy, kiedy stwierdza się równoczesną obecność gonad męskich

i żeńskich lub gdy występują struktury złożone typu jajnikojądro (ovotestis)

i 2) pseudohermafrodytyzm męski, kiedy gonadom męskim towarzyszą

zaburzenia w przekształcaniu się przewodów Wolffa i Miillera lub w po-

wstawaniu zewnętrznych narządów płciowych.

Frymartynizm

Frymartynizm jest najczęściej występującą postacią interseksualizmu u zwie-

rząt domowych, głównie przeżuwaczy. Podczas rozwoju ciąży mnogiej

może dojść do powstania połączeń naczyniowych (anastomoz) między

łożyskami rozwijających się płodów. Jeśli połączenie łożysk dotyczy płodów

różnopłciowych, to wówczas rozwój cech płciowych samicy (frymartyna)

jest zaburzony, co w konsekwencji prowadzi prawie zawsze do niepłodności.

Połączenie krwiobiegów bliźniąt różnopłciowych sprawia, że związki hor-

monalne oraz inne czynniki aktywne wytwarzane przez jądra płodowe

docierają do organizmu samicy i wpływają na proces różnicowania się

żeńskich cech płciowych. Rozmiar zaburzeń w ukształtowaniu cech płcio-

wych samicy frymartyna zależy od momentu, w którym powstały połączenia

naczyniowe. W rozwoju embrionalnym różnicowanie się jąder poprzedza

okres, w którym kształtują się jajniki. Jeśli do połączeń tętniczo-żylnych

łożysk doszło w okresie różnicownia się pierwotnej gonady w kierunku

jądra u osobnika męskiego, to wydzielany czynnik transkrypcyjny SRY

może zakłócić proces kształtowania jajników u osobnika bliźniaczego płci

221

żeńskiej w takim stopniu, że rozwinie się nawet gonada męska, a w ślad za

tym drogi płciowe będą miały charakter męski. Jeśli anastomozy powstaną

w chwili gdy jajnik jest już ukształtowany, to wówczas wydzielany przez

jądra płodowe hormon antymiillerowski i testosteron spowodują zakłócenia

w różnicowaniu się dróg wyprowadzających gamety oraz zewnętrznych

narządów płciowych. Możliwe jest również powstanie połączeń, w okresie

gdy przewody Miillera będą już przekształcone w jajowody i macicę.

Wówczas dihydrotestosteron, powstający z wydzielanego przez komórki

Leydiga testosteronu, może zakłócić, w mniejszym lub większym zakresie,

proces kształtowania się zewnętrznych narządów płciowych. Trzeba pod-

kreślić, że prawie we wszystkich przypadkach, niezależnie od stopnia

zakłócenia procesu różnicowania cech płciowych, stwierdza się niepłodność

samic frymartynów. Jednocześnie cechy płciowe męskiego bliźniaka są

rozwinięte prawidłowo. Buhaje takie mogą być wykorzystywane w roz-

rodzie, chociaż parametry określające ich przydatność rozpłodową (np.

obraz nasienia, wskaźnik niepowtarzalności rui itp.) są często obniżone.

Istotną kwestią jest możliwość wykrywania frymartynizmu u samic

hodowlanych, a także wskazywanie samców pochodzących z ciąż bliź-

niaczych różnopłciowych. Okazuje się, że badania kliniczne samic są

niewystarczające, szczególnie wówczas, gdy zewnętrzne narządy płciowe są

prawidłowo uformowane. Bardzo pomocne okazało się badanie cyto-

genetyczne, polegające na ustaleniu zestawu chromosomów płci w leuko-

cytach. Ze względu na wspólną cyrkulację krwi u płodów, których łożyska

są połączone anastomozami, dochodzi do zagnieżdżenia się komórek

macierzystych szpiku kostnego samicy w szpiku kostnym samca i odwrotnie.

Z tego powodu we krwi frymartynów, a także samców będących bliźniętami

frymartynów, stwierdza się obecność dwóch linii komórkowych — jednej

własnej, a drugiej współbłiźniaka. Linie te różnią się układem chromosomów

płci — w jednej występuje układ XX, a w drugiej układ XY. Ponieważ linie

te pochodzą od dwóch różnych genotypów, dlatego stan taki określany jest

jako chimeryzm leukocytarny XX/XY. Chimeryzm dotyczy również ery-

trocytów, które — jak wiadomo — pozbawione są u ssaków jąder komór-

kowych. Chimeryzm erytrocytarny można stwierdzić przez badanie grup

krwi. Postęp genetyki molekularnej umożliwia wykrywanie chimeryzmu

leukocytarnego nie tylko za pomocą metod cytogenetycznych, ale także

molekularnych (np. sekwencje mikrosatelitarne). Identyfikacja sekwencji

typowych dla chromosomu Y (np. sekwencja SRY) w DNA wyizolowanym

z komórek krwi samicy, przy jednoczesnym ich braku np. w komórkach

błony śluzowej, może być wskazówką, że badany osobnik jest frymartynem.

Powstawanie anastomoz jest bardzo często stwierdzane u bydła. Szacuje

się, że w przypadku ponad 90% ciąż bliźniaczych rozwijane są anastomozy.

Znacznie rzadziej zdarza się to u owiec (od l do 10%, zależnie od rasy). Biorąc

jednak pod uwagę, że ciąże mnogie występują bardzo rzadko u bydła

(poniżej 2% ciąż), a często u owiec (od 40 do blisko 100% ciąż, zależnie od

222

rasy), w konsekwencji częstość frymartynizmu u tych gatunków kształtuje

się na zbliżonym poziomie, w zakresie od 0,5% (bydło) do kilku procent

(niektóre rasy owiec, np. merynos booroola). Nieznane jest do tej pory

molekularne podłoże powstawania anastomoz. Z badań przeprowadzonych

na owcach wynika, że skłonność do tworzenia anastomoz może być uwarun-

kowana genetycznie. Wniosek taki wyciągnięto na podstawie pojawiania się

chimeryzmu leukocytarnego XX/XY u zwierząt spokrewnionych.

Mutacje chromosomów płci

Przyczyną rozwoju interseksualnego często są mutacje związane z chromo-

somami płci. Z jednej strony mogą to być aneuploidie, wśród których

najczęściej obserwuje się przypadki monosomii chromosomu X (zespół

chorobowy X0) oraz trisomii chromosomów płci (zespoły chorobowe XXY,

XYY lub XXX). U ludzi monosomia chromosomu X odpowiada za powstanie

zespołu Turnera, a trisomia XXY jest przyczyną rozwoju zespołu Klinefeltera.

Z drugiej strony ważną rolę odgrywają mutacje strukturalne, w które są

zaangażowane chromosomy płci. Przyczyny powstawania tych mutacji

zostały omówione w rozdziale: Mutacje. Aneuploidie chromosomów płci

prowadzą przede wszystkim do upośledzenia funkcji gonad. Zazwyczaj nie

towarzyszą im zaburzenia polegające na równoczesnym rozwoju struktur

typowych dla dwóch płci. Monosomia chromosomu X najczęściej jest

diagnozowana u klaczy, które są fenotypowo prawidłowo rozwinięte.

U nosicielek ruja nie występuje w ogóle lub występuje nieregularnie.

Gonady są niedorozwinięte i brak w nich rozwijających się pęcherzyków

jajnikowych. Zmiany te prowadzą do trwałej bezpłodności samic z mono-

somia chromosomu X. W grupie trisomii chromosomów płci najwięcej

przypadków dotyczy trisomii XXY. Kilkanaście takich przypadków opisano

u buhajów. Charakteryzowały się one gorszym tempem wzrostu, miały

niedorozwinięte jądra, a w nasieniu takich osobników zazwyczaj nie

stwierdzano plemników, co oczywiście prowadziło do bezpłodności. Z kolei

trisomie XXX oraz XYY zazwyczaj nie prowadzą do bezpłodności oraz nie

wywołują zmian fenotypowych.

Zespół niewrażliwości na androgeny

Mutacje genów zaangażowanych w proces determinacji i różnicowania płci

są przyczyną wielu przypadków interseksualizmu. Przykładem może być

zespół niewrażliwości na androgeny (zespół feminizujących jąder). Zwierzęta

obarczone tym zespołem chorobowym mają w swoich komórkach układ

chromosomów płci XY i prawidłowo rozwinięte zewnętrzne narządy płciowe

żeńskie, niedorozwinięte wewnętrzne narządy płciowe żeńskie oraz jądra.

Przyczyną tych zaburzeń jest mutacja zlokalizowanego w chromosomie X

genu kodującego receptor dla androgenów. Konsekwencją występowania

223

nieprawidłowego receptora dla androgenów jest nieodbieranie przez komór-

ki docelowe sygnału związanego z obecnością testosteronu i dihydrotestoste-

ronu, co prowadzi do różnicowania się wewnętrznych i zewnętrznych

narządów płciowych w kierunku żeńskim.

Zespół odwróconej płci u koni

W hodowli koni częstym typem interseksualizmu jest tzw. zespół odwróconej

płci (ang. sex reversal), który polega na niezgodności między płcią fenoty-

pową i chromosomową. Najczęściej zespół ten diagnozowany jest u fenoty-

powych samic, które mają układ chromosomów XY. Zewnętrzne narządy

płciowe są zazwyczaj prawidłowo rozwinięte, chociaż zdarzają się zwierzęta

z powiększoną łechtaczką. Wewnętrzne narządy płciowe wywodzą się

z przewodów Miillera i są prawidłowo wykształcone lub przejawiają oznaki

niedorozwoju. W zdecydowanej większości przypadków stwierdza się

niedorozwinięte gonady żeńskie, a w nielicznych przypadkach opisano

obecność niedorozwiniętych jąder lub jajnikojąder. Badania molekularne

genów położonych w chromosomie Y, z wykorzystaniem techniki PCR,

ujawniały u samic z zespołem odwróconej płci obecność genów charak-

terystycznych dla tego chromosomu (AMEL, ZFY, STS), przy jednoczesnym

braku kluczowego genu SRY. Przyczyny takiego stanu mogą być różne,

a wśród nich należy wymienić: mutację w locus SRY (np. częściowa lub

całkowita delecja), przeniesienie genu SRY podczas nierównoważonego

crossing over do chromosomu X lub translokację chromosomową między

chromosomem Y i autosomem.

U koni występują również przypadki odwrócenia płci u osobników

z układem chromosomów XX. Zewnętrzne narządy płciowe takich zwierząt

mogą być bardzo zróżnicowane, od prawie typowo samczych do samiczych,

ale z powiększoną łechtaczką. Zazwyczaj stwierdza się obecność niefunk-

cjonalnych jąder, w których kanaliki plemnikotwórcze są wyścielone jedynie

komórkami Sertolego. W genotypie tych zwierząt nie ma genu SRY, który

uznawany jest za niezbędny do rozwoju gonady męskiej. Taki typ od-

wrócenia płci spotykany jest również u kóz, świń i psów.

Interseksualizm bezrogich kóz

Ze szczególnym przypadkiem interseksualizmu można się spotkać w hodowli

kóz. Bezrożność kóz uwarunkowana jest przez dominujący allel P, a wy-

stępowanie rogów związane jest wyłącznie z genotypem homozygoty

recesywnej pp. Okazało się, że wśród osobników bezrogich często zdarzają

się zwierzęta obojnacze, które mają układ chromosomów płci XX, a w ich

genotypie nie stwierdza się genu SRY. Osobniki takie powinny być samicami,

tymczasem w procesie różnicowania płci występują zaburzenia dotyczące

zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych cech płciowych, a stopień

224

nasilenia tych zmian jest bardzo zróżnicowany. Gonady zazwyczaj mają

strukturę jądra, a rzadko jajnikojądra. Jądra takich osobników nie wykazują

jednak aktywności spermatogenetycznej. Usytuowanie gonad może być

pachwinowe lub mogą być położone w worku mosznowym. Zewnętrzne

cechy płciowe mogą mieć nieomal prawidłowy charakter żeński i wówczas

odróżnienie takiego obojnaka od prawidłowej samicy jest praktycznie

niemożliwe. Czasami stwierdza się zwiększoną odległość między odbytem

i sromem lub znaczne powiększenie łechtaczki. W przypadku takich

osobników stosunkowo łatwo udaje się zdiagnozować interseksualizm.

Wreszcie mogą występować również osobniki, które mają zdecydowanie

samczy fenotyp. Są one trudne do odróżnienia od samców o prawidłowej

płci chromosomowej, czyli mających układ chromosomów płci XY, a w ich

genotypie występuje gen SRY. W wyniku przeprowadzonych badań nad

zmapowaniem locus genu bezrożności ustalono, że jest on położony

w chromosomie l — w części dystalnej. Ciekawe jest, że locus genu

bezrożności bydła został umiejscowiony również w chromosomie l, ale

w części proksymalnej (w pobliżu centromeru). Z badań porównawczych

wiadomo, że kariotypy obu gatunków są prawie identyczne, również

w zakresie układu loci w chromosomach. Można z tego wyciągnąć wniosek,

że za występowanie rogów odpowiedzialne są co najmniej dwa loci u tych

gatunków. Co więcej należy podkreślić, że u bydła występowanie rogów nie

wpływa na zakłócenie różnicowania się płci. W 2001 r. ukończono wieloletnie

badania, których celem była identyfikacja locus odpowiedzialnego za oboj-

nactwo bezrożnych kóz (tzw. gen PIS — ang. polledness and intersexuality

syndrome). Okazało się, że odpowiedzialna za to jest delecja 11 700 par

zasad, zlokalizowana w niekodującym fragmencie DNA, co zakłóca ekspresję

dwóch położonych w pobliżu genów: PISRT1 (zaangażowany w determina-

cję płci poprzez oddziaływanie na produkt genu SOX9) oraz FOXL2

(uczestniczy prawdopodobnie w rozwoju jajników w okresie płodowym).

Choroba białych jałowic

Innym przykładem genu o działaniu plejotropowym, który jest odpowie-

dzialny za rozwój interseksualny, jest allel R genu Roan (umaszczenie

dereszowate) u bydła. Allel R odpowiada za powstanie białego umaszczenia,

allel r

za umaszczenie czarne (u bydła belgijskiego błękitnego) lub czerwone

(u shorthornów). Allele te prezentują typ dziedziczenia pośredniego, z tym

jednak że genotyp Rr

wykazuje niepełną penetrację, tzn. około 9% białych

zwierząt ma genotyp heterozygotyczny i podobna proporcja heterozygot

ma umaszczenie barwne. U obu ras bydła stwierdzono, że allel R zakłóca

różnicowanie się przewodów Miillera w kierunku żeńskich wewnętrznych

narządów płciowych u jałówek. Zaburzenia te polegają na braku lub

niedorozwoju pochwy, szyjki macicy i macicy, natomiast jajniki są rozwinięte

prawidłowo. Zespół tych zmian jest określany jako choroba białych jałowic

225

(ang. white heifer disease), bowiem ponad 90% chorych jałówek ma
umaszczenie białe, a wśród pozostałych 10% przeważają jałówki umaszczone
niebiesko (belgijskie błękitne) lub mroziato (shorthorny). Dotychczasowe
obserwacje dowodzą, że choroba białych jałowic ma złożone podłoże,
w którym oprócz czynników genetycznych (allel R)  istotną rolę odgrywają
również nie rozpoznane jeszcze wpływy  środowiskowe.  Locus  genu  Roan
umiejscowiono w chromosomie 5 w kariotypie bydła. Przypuszcza się,  że
genem  roan  może być gen kodujący czynnik wzrostu komórek tucznych.
Locus tego genu został wcześniej zmapowany w regionie, w którym ostatnio
umiejscowiono locus genu Roan.

Interseksualizm u świń

Przypadki interseksualizmu u świń obserwuje się z częstością około 0,3%.
Tło genetyczne tych przypadków jest słabo poznane. Badania chromo-
somowe wykazują,  że zdecydowana większość zwierząt obarczonych
interseksualizmem ma kariotyp żeński — 38,XX. Wśród nich niejednokrotnie
zdarzają się przypadki, gdzie gonady mają strukturę  jądra lub jajnikojądra,
pomimo nieobecności genu SRY,  a zewnętrzne i wewnętrzne narządy
płciowe są nieprawidłowo rozwinięte. Sytuacja taka wskazuje, że powstanie
gonady męskiej może nastąpić pomimo braku genu SRY.  Zakłada się,  że
produkt genu SRY  wstrzymuje ekspresję nieznanego genu autosomałnego,
który koduje polipeptyd wpływający na zahamowanie ekspresji innych
genów uczestniczących w różnicowaniu płci męskiej. Zatem rozwój w kie-
runku męskim osobników z chromosomami XX byłby spowodowany tym,
że produkt tego zmutowanego genu nie hamuje rozwoju cech męskich.
W Polsce opisano powtarzające się przypadki takiego właśnie intersek-
sualizmu na fermie tuczu trzody chlewnej. W potomstwie jednego knura
pojawiło się kilkanaście obojnaków, w których kariotypie występowały dwa
chromosomy X. U zwierząt tych stwierdzano obecność jąder, pomimo braku
genu  SRY  w ich genotypie, macicy i nasieniowodów oraz zewnętrznych
narządów płciowych  żeńskich, z tym jednak że  łechtaczka była bardzo
powiększona, a srom tworzył z odbytem wspólny otwór (ryć. 9-3 wkładka
kolorowa). Rozwój interseksualizmu u świń stwierdzano także u osobników
z układem chromosomów XY lub chimeryzmem leukocytarnym 38,XX/38,XY.
Badania cytogenetyczne nie dają oczywiście wiążącej odpowiedzi na pytanie
o podłoże genetyczne różnych form interseksualizmu. Można natomiast
przypuszczać, że chimeryzm leukocytarny XX/XY wskazuje na frymartynizm,
a układ chromosomów XY i zewnętrzne narządy  żeńskie są oznakami
zespołu niewrażliwości na androgeny.

Rozdział

Genetyczne podstawy odporności i

oporności

Układ odpornościowy jest pod względem „inteligencji" drugim po układzie

nerwowym układem komórkowym organizmu. Ma on, podobnie jak układ

nerwowy, zdolność uczenia się, zapamiętywania, reagowania na różne

bodźce i umiejętność oceny tych bodźców pod kątem ich oddziaływania na

organizm. Główną rolą tego układu jest rozróżnianie obcych białek (anty-

genów) i reakcja immunologiczna, której celem jest zwalczenie, usunięcie

tych obcych białek. Zastanawiające jest, iż układ może rozróżnić ogromną

liczbę antygenów i odpowiedzieć na infekcje, mimo że ma tylko pięć klas

przeciwciał. Zdolność ta wynika przede wszystkim ze specyficznego sposobu

genetycznej kontroli syntezy przeciwciał, ale także z posiadania przez

organizmy wyższe unikatowego układu genetycznego, jakim jest główny

układ zgodności tkankowej.

10.1. Genetyczne podłoże różnorodności

przeciwciał

Immunoglobuliny, czyli przeciwciała, wykryte w 1890 roku przez von

Behringa i Shibasaburo Kitasato, są grupą złożonych białek obecnych

w surowicy krwi i płynach tkankowych wszystkich ssaków. Ich wytwarzanie

przez limfocyty B jest stymulowane przez kontakt układu odpornościowego

organizmu z obcą immunogenetycznie cząsteczką (antygenem). Są one

elementem odporności swoistej (nabytej, adaptatywnej), ich zadaniem jest

rozpoznanie i neutralizacja obcych antygenów (np. bakterii czy wirusów).

Cząsteczka przeciwciała ma masę 150 kDa i składa się z dwóch łańcuchów

ciężkich (ang. heavy — H), po 50 kDa każdy, połączonych z dwoma

łańcuchami lekkimi (ang. light — L), o masie po 25 kDa. Jest pięć typów

łańcuchów ciężkich (gr.

α - - alfa, δ - - delta, ε - - epsilon, γ - - gamma

227

μ - - mi) i dwa typy lekkich (κ— kappa i λ. — lambda). Stosunek

przeciwciał, które mają łańcuch lekki typu

κ, do łańcucha

zależy od

gatunku (np. u ludzi wynosi on 70:30, u myszy l: 20, u koni l: 25).
Immunoglobuliny dzieli się na podstawie różnic w budowie łańcuchów
ciężkich na 5 klas : IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Nazewnictwo to pochodzi od:
Ig — skrót od angielskiego słowa immunoglobulin, natomiast A, D, E,
G i M od symboli łańcuchów ciężkich.

Przeciwciało ma kształt litery Y (ryć. 10-1), utworzonej przez łańcuchy

ciężkie, a wzdłuż jej ramion znajdują się łańcuchy lekkie. Łańcuchy ciężkie
połączone są ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi, których liczba i miejsce
zależą  od klasy i podklasy immunoglobuliny. Zarówno łańcuchy ciężkie,
jak i lekkie mają części zmienne (ang. variable — V) oraz części stałe (ang.
constant — C). W części zmiennej znajdują się trzy regiony hiperzmienne
(ang. hypervariable), oznaczone HV1, HV2 i HV3. Ponieważ regiony te
determinują swoistość przeciwciał, nazywane są także regionami deter-
minującymi dopasowanie (ang. complementarity  determining  regions -
CDR). W części stałej  łańcucha ciężkiego, między domeną CH1 i CH2,
znajduje się tzw. region zawiasowy (ang. hinge region), w którym są
wiązania dwusiarczkowe łączące oba łańcuchy ciężkie.

Genetyczne podłoże powstawania przeciwciał zostało wyjaśnione przez

Susumu Tonegawa w 1976 roku. Badacz ten odkrył, iż informacja genetyczna

228

immunoglobulin zawarta jest w znajdujących się w różnych chromo-

somach czterech grupach „minigenów", które nazwał segmentami. Róż-

norodność przeciwciał, ich swoistość wynikają z tego, iż dziedziczone

są nie całe geny immunogłobulinowe, ale ich segmenty. Proces syntezy

przeciwciała następuje po skompletowaniu genów, czyli połączeniu

się segmentów po jednym z każdej grupy minigenów. Dopiero po

połączeniu w całość segmenty te tworzą kompletny funkcjonalny gen.

Proces ten zachodzi w poszczególnych limfocytach B podczas ich doj-

rzewania. Za to odkrycie Tonegawa otrzymał w 1987 roku Nagrodę Nobla.

Część zmienna łańcucha lekkiego jest determinowana przez dwa geny

V (ang. variable) i J (ang. joining), natomiast łańcucha ciężkiego przez

trzy geny: V, D (ang. diversity) i J. Część stała obu rodzajów łańcuchów

jest kodowana przez gen C. Geny kodujące łańcuch ciężki znajdują

się u człowieka w 14 chromosomie, natomiast geny łańcucha lekkiego

typu

w 2, typu

λ w 22 chromosomie, u myszy natomiast odpowiednio

w chromosomach 2, 6 i 16.

Różnorodność przeciwciał wynika z wielu przyczyn, przede wszystkim z:

• rearanżacji genów części zmiennych (V) i stałych (C) łańcuchów

immunoglobulin

• rekombinacji między wieloma genami V

• insercji minieksonów

• mutacji somatycznych

Różnorodność ciężkich łańcuchów immunoglobulinowych wynika z re-

kombinacji (rearanżacji) genów V, D, J i C, a łańcuchów lekkich z rekom-

binacji regionów V, ] i C. Teoretycznie jest możliwość powstania do 10

różnych immunoglobulinowych sekwencji domen. Jednak rzeczywista liczba

powstałych wariantów przeciwciał wynosi 10

-10

. Przypuszczalnie jest

wiele genów kodujących region V. Dla łańcucha ciężkiego ich liczba nie jest

dokładnie znana (kilkadziesiąt, może kilkaset), dla lekkiego — kilka. Istnieją

co najmniej 3 rodziny genów (liczące 1-9 genów każda) dla regionu D,

6 genów funkcjonalnych i 3 pseudogeny regionu J, natomiast dla regionu

C > 30 genów u ludzi i > 300 u myszy dla łańcucha lekkiego typu

oraz

6 u ludzi i 4 u myszy dla łańcucha typu A,. Ogólnie liczbę genów

determinujących poszczególne regiony łańcuchów immunoglobulin można

określić jako kilkaset genów V, kilkadziesiąt genów D i kilka genów J. Geny

determinujące region C różnią się od pozostałych tym, że wpływają na

funkcję przeciwciała, a nie na jego powinowactwo do antygenu.

Kompletne funkcjonalne geny kodujące cząsteczki przeciwciał powstają

z omówionych wyżej genów, których kolejność łączenia się jest następująca:

gen D z genem J, następnie z genem V; powstały kompleks DJV łączy się

z genem kodującym część stałą łańcucha ciężkiego. W funkcjonalnym genie

łańcucha lekkiego nie ma genu D (ryć. 10-2). Rekombinacyjne łączenie się

genów, zachodzące dzięki aktywności enzymu — rekombinazy, jest głów-

nym źródłem różnorodności przeciwciał.

229

Podczas procesu powstawania genu kompletnego do połączeń między

genami — segmentami (V-J, V-D i D-J) mogą być wstawiane nukleotydy (od

l do 15), bądź też usuwane (do około 20 nukleotydów). Ponieważ są to

nowo powstałe odcinki DNA, prowadzi to do zmienności na złączach

i utworzenia nowego genu, tym samym liczba wariantów genu D] może być

zwiększona około 10 razy, natomiast genu VDJ następne 10 razy.

Dodatkowo na różnorodność sekwencji przeciwciał mają wpływ mutacje

somatyczne zachodzące w rekombinowanym genie VJ (dla łańcucha lek-

kiego) i VDJ (dla łańcucha ciężkiego). Każdy limfocyt B wytwarza tylko

jeden rodzaj łańcucha ciężkiego i jeden lekkiego, które razem stanowią

przeciwciało, będące specyficznym receptorem tego limfocytu. Geny kodu-

jące łańcuchy mają zdolność niezwykle szybkiego mutowania w odpowiedzi

na pobudzenie limfocytu B poprzez związanie obcego białka (antygenu).

Najczęściej są to mutacje punktowe, powodujące zmianę pojedynczego

aminokwasu, rzadziej natomiast delecje, insercje lub konwersje. Pojedyncza

nawet zmiana aminokwasu w części zmiennej łańcucha ciężkiego może

doprowadzić do całkowitej utraty przez przeciwciało zdolności wiązania

antygenu lub też do zwiększenia jego powinowactwa do antygenu.

10.2. Genetyczne podłoże różnorodności

receptorów limfocytów J

W odpowiedzi immunologicznej organizmu biorą udział dwie populacje

limfocytów: limfocyty T i limfocyty B, przy czym limfocyty T uczestniczą

w odpowiedzi typu komórkowego, atakując i niszcząc komórki zakażone

— cytotoksyczne limfocyty T), oraz odpowiedzi typu humoralnego

230

— pomocnicze limfocyty T), podobnie jak limfocyty B, które odpowiadają

za syntezę przeciwciał.

Dwie subpopulacje limfocytów T (T

i T

) różnią się receptorami

błonowymi. Limfocyty pomocnicze mają receptory CD4, cytotoksyczne -

CD8. Reaktywność tych receptorów znajdujących się na limfocytach

pomocniczych i cytotoksycznych jest skierowana odpowiednio na

antygeny MHC klasy II i klasy I.

Proces rearanżacji elementów genów receptorowych, który następuje

podczas dojrzewania komórek T w grasicy, zachodzi podobnie jak rekom-

binacja genów przeciwciał. Poprzez proces rearanżacji genów, jeden do

czterech elementów zostaje włączonych do genów kodujących pierwotną

strukturę białek receptora komórki T. Znane są dwa rodzaje receptorów

limfocytów T — receptory składające się z łańcuchów

α i β oraz receptory

składające się z łańcuchów

γ i δ. U człowieka geny kodujące łańcuchy

receptorów znajdują się w chromosomie 7 (dla łańcuchów

β i γ) i 14 (dla

łańcuchów

α i δ). Części zmienne łańcuchów kodowane są przez

geny V i J (łańcuchy a i y) i przez geny V, D i J (łańcuchy p i §).

Na przykład u myszy 100 regionów łańcucha

-V i 50 regionów

łańcucha

α-J może tworzyć do 5000 różnych genów dla łańcucha α.

Podobnie, około 500 różnych genów kodujących łańcuch

β może być

utworzonych z 20 genów

β-V, 2 regionów D i 12 genów dla łańcucha β-J.

Oczywiście jest mało prawdopodobne, że wszystkie elementy genów są

włączone w rearanżacje, ale teoretycznie losowe kombinacje łańcuchów

β mogą dać do 2,5 x 10

α-β heterodimerów. Gdyby zostały wzięte pod

uwagę wszystkie mechanizmy biorące udział w tworzeniu różnorodności

struktury receptorów limfocytów T, liczba różnych receptorów wyniosłaby

do 10

receptorów

α-β i 10

γ-δ. Potencjał dla różnorodności receptorów

komórek T jest istotnie wyższy niż wynosi liczba komórek T obecnych w

organizmie.

10.3. Główny układ zgodności tkankowej — MHC

Główny układ zgodności tkankowej został odkryty w wyniku badań nad

genetycznym tłem przyjmowania lub odrzucania przeszczepu u myszy.

Bodźcem do podjęcia tych badań było odkrycie przez Landsteinera grup

krwi systemu ABO i wyjaśnienie zjawiska aglutynacji krwinek

czerwonych biorcy pod wpływem surowicy krwi dawcy. Prowadzone w

latach 30. przez Petera Gorera poszukiwania innych antygenów

grupowych krwi, odpowiedzialnych za przyjęcie przeszczepu,

doprowadziły do wykrycia grup (klas) antygenów oznaczonych I, II i III.

Przełomowe znaczenie dla poznania i wyjaśnienia roli tych antygenów

miało wytworzenie przez Georga Snella linii kongenicznych myszy

różniących się tylko locus zgodności tkankowej, który kontroluje ich

syntezę. Badania polegające na przeszczepach skórnych

231

między tymi liniami, wykonywanych dla kilkunastu kolejnych pokoleń,

wykazały, iż reakcja na ten zabieg zależy przede wszystkim od locus

głównego układu zgodności tkankowej (ang. major histocompatibility

complex — MHC), a tylko w niewielkim stopniu od innych loci, nazwanych

słabymi antygenami zgodności tkankowej (ang. minor histocompatibility

loci). Za badania nad MHC Snęli wraz z Francuzem Daussetem i Ameryka-

ninem Benacerrafem otrzymali w 1980 roku Nagrodę Nobla.

Różnice między słabymi antygenami zgodności tkankowej a MHC są

zarówno natury jakościowej, jak i ilościowej. Geny słabych antygenów

zgodności tkankowej nie są jeszcze dobrze poznane i, być może dlatego, często

ich efekt jest niedoceniany. Tymczasem niektóre z tych antygenów stymulują

silniejszą odpowiedź transplantacyjną niż antygeny MHC. W zasadzie

antygeny minor H loci nie biorą udziału w reakcji immunologicznej

prowadzącej do syntezy przeciwciał, natomiast mogą być rozpoznawane

przez limfocyty T w połączeniu z antygenami MHC, podobnie jak to

występuje przy rozpoznawaniu antygenów wirusowych. U myszy loci słabych

antygenów zgodności tkankowej (minor H loci) są najlepiej poznane

i wiadomo, że większość z nich znajduje się w chromosomie 2. Do słabych

antygenów transplantacyjnych myszy należą między innymi: H-Y (tylko

u samców), H-l, H-3, H-5 i inne. Antygeny te są istotną barierą podczas

transplantacji tkanek, zwłaszcza transplantacji szpiku kostnego. Nawet

wówczas, gdy biorca i dawca są zgodni pod względem haplotypów MHC,

słabe antygeny transplantacyjne mogą spowodować odrzucenie przeszczepu.

W dziedziczeniu słabych antygenów zgodności tkankowej obserwuje się

pewne charakterystyczne zjawiska. Antygen H-Y występuje tylko u samców,

gdyż gen kodujący go jest zlokalizowany w chromosomie Y. Zatem jest on

przekazywany przez ojca męskim potomkom. Natomiast inny antygen,

nazwany Mta (ang. maternally transmitted antigen), pochodzi tylko od

matki, ponieważ jest on kontrolowany przez gen mitochondrialny (zjawisko

to jest omówione w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech).

Tabela 10-1

Lokalizacja MHC i nazwa u poszczególnych gatunków

232

Ponieważ główną funkcją genów MHC jest determinowanie antygenów

leukocytarnych (ang. leukocyte antigens — LA), nazewnictwo tego układu

u poszczególnych gatunków stanowi symbol zawierający w pierwszym

członie nazwę gatunku, a drugim podstawową funkcję — LA (tab. 10-1).

Główny układ zgodności tkankowej jest ogromnie konserwatywnym

regionem DNA, jego struktura i funkcje są podobne u ludzi i wszystkich

gatunków zwierząt. Umożliwia to prowadzenie badań molekularnych MHC

u jednego gatunku z zastosowaniem sond molekularnych uzyskanych

z DNA innego gatunku.

10.3.1. Struktura i funkcje głównego układu

zgodności tkankowej

U ludzi i zwierząt MHC jest odcinkiem DNA składającym się ze specyficz-

nych regionów genów kodujących trzy klasy białek — klasę I, II i III,

będących glikoproteinami. U drobiu nie stwierdzono regionu klasy III.

Wykryto natomiast specyficzny region klasy IV, kodujący białka zlokalizo-

wane na krwinkach czerwonych. Z powodu powiązań tego układu z ukła-

dem grupowym krwi B, MHC u drobiu nazwano kompleksem B. Ponieważ

wiele białek MHC zostało zidentyfikowanych metodą serologiczną, często

są one nazywane antygenami MHC. Białka (cząsteczki) MHC tak ze względu

na podobieństwo na poziomie struktury białka, jak i na poziomie genów

zaliczane są do nadrodziny immunoglobulin.

Mechanizm dziedziczenia układu zgodności tkankowej jest taki jak

w przypadku jednej pary alleli. Potomek otrzymuje od każdego rodzica po

jednym chromosomie z każdej pary chromosomów homologicznych, a wraz

z nim — haploidalny genotyp MHC (haplotyp). Ponieważ MHC zawiera

wiele genów oraz, jak już wspomniano, układ ten cechuje ogromny

polimorfizm, w populacji istnieje bardzo duża liczba różnych haplotypów.

Zwłaszcza niektóre geny MHC, należące do klasy I i II (np. regionu K,

D i L u myszy i B, C i A u ludzi), są wysoce polimorficzne. W wielu

przypadkach polimorfizm ten jest wynikiem konwersji genów, rzadziej

mutacji punktowych, crossing over czy rekombinacji wewnątrzgenowych.

W obrębie MHC znajdują się regiony szczególnie często uczestniczące

w rekombinacjach genetycznych.

Polimorfizm alleliczny obserwowany w loci MHC charakteryzuje się

tym, iż:

• liczba alleli w większości loci jest bardzo duża (> 50)

• allele często różnią się dużą liczbą mutacji punktowych typu zmiany

sensu, powodujących podstawienia aminokwasów w cząsteczce MHC (> 20

dla loci klasy II i > 30 dla loci klasy I); w większości innych systemów

genetycznych allele różnią się nielicznymi podstawieniami nukleotydów

233

• polimorfizm występuje głównie w odcinkach istotnych funkcjonalnie,

a więc w tych, które kodują miejsce wiązania peptydów; zjawisko polimor-

fizmu w innych systemach genetycznych częściej obserwowane jest w re

gionach, których znaczenie funkcjonalne jest mniej istotne

• polimorfizm w obrębie MHC, co zostało już udowodnione, wpływa

na możliwość immunologicznego rozpoznania obcych białek.

Mimo iż początkowo uważano, że MHC pełni funkcję tylko w odrzucaniu

przeszczepu, obecnie wiadomo, że białka kodowane przez ten region biorą

udział w mechanizmach rozpoznania immunologicznego, w tym także

w interakcji różnych komórek limfoidalnych oraz limfocytów i komórek

prezentujących antygen.

Cząsteczki MHC klasy I są obecne na powierzchni wszystkich komórek

jądrzastych i warunkują zachowanie się cytotoksycznych limfocytów T,

biorąc tym samym udział w reakcji przeciwko infekcji wirusowej, a także

w odrzucaniu przeszczepu. Cząsteczki te składają się z dwóch łańcuchów

polipeptydowych — lekkiego i ciężkiego (ryć. 10-3). Łańcuch ciężki jest

kodowany przez geny MHC, natomiast związany z nim niekowalencyjnie

łańcuch lekki p

-mikroglobuliny (białko o masie 12 kDa) jest determinowany

przez gen znajdujący się poza układem MHC.

Łańcuch ciężki składa się z trzech części:

• Najdłuższy, N-końcowy fragment łańcucha ciężkiego, stanowi około

80% jego długości i znajduje się na zewnątrz komórki. Jest on kodowany

przez geny MHC i ma trzy koliste domeny, oznaczone symbolami

αl,

α2 i α3, każda złożona z około 90 aminokwasów. Domena α3 jest

ściśle sprzężona z

-mikroglobuliną. Ma ona wewnątrzłańcuchowe

dwusiarczkowe wiązanie i podobną strukturę trzeciorzędową do domeny

immunoglobuliny. Domeny

αl i α2 odznaczają się polimorfizmem,

który jest podstawą różnic między cząsteczkami MHC klasy I

pochodzącymi od różnych osobników. W domenach tych występują

alloantygeniczne miejsca,

234

zawierające determinanty specyficzne dla osobników. Fragment

węglowodanowy (CHO) jest dołączony do domeny

α2. Domeny αl i

α2 tworzą rowek osadzony na β

-mikroglobulinie i domenie

α3, które

są między nim a błoną komórkową. W rowku tym wiązane są antygeny,

które następnie są prezentowane limfocytom T.

• Druga część łańcucha ciężkiego to zawierający około 20

aminokwasów fragment hydrofobowy, przechodzący przez błonę

komórkową.

• Trzecią częścią jest liczący około 20-40 aminokwasów

fragment hydrofilowy cząsteczki MHC klasy I (C-końcowy), który leży w

cytoplazmie komórki.

Cząsteczki MHC klasy II, stwierdzane tylko na powierzchni

wyspecjalizowanych komórek układu odpornościowego (makrofagi,

komórki den-drytyczne i limfocyty B), regulują immunologiczne

rozpoznanie antygenów za pomocą limfocytów B i T. Cząsteczki te są

zbudowane z dwóch niekowalencyjnie połączonych łańcuchów o

podobnej budowie, oznaczonych symbolami

α i β, kontrolowanych

przez geny zlokalizowane w obrębie MHC (ryć. 10-4). Łańcuchy te,

podobnie jak łańcuch ciężki cząsteczki klasy I, składają się z trzech

części: zewnątrzkomórkowej N-końcowej,

śródbłonowej i

wewnątrzkomórkowej. Oba łańcuchy mają w części N-końcowej po

dwie koliste domeny. Domeny

α2 i α2 są strukturalnie podobne do

domen części stałych łańcuchów ciężkich im-munoglobulin. Domeny

zewnętrzne (

αl i βl) obu łańcuchów tworzą rowek podobny do

tworzonego przez domeny

αl i α2 łańcucha ciężkiego białek MHC

klasy I. Polimorfizm cząsteczek MHC klasy II dotyczy przede wszystkim

domen

αl i βl. Cząsteczki MHC klasy II mają zdolność wytwarzania

dimerów złożonych z dwóch łańcuchów a i dwóch łańcuchów

β.

235

Zarówno białka MHC klasy I, jak i klasy II prezentują obcy peptyd

(antygen) limfocytom T. Jednak cząsteczki klasy I mogą wiązać jedynie

krótki, złożony z kilku aminokwasów peptyd, ponieważ mają zamknięte

miejsce wiążące. Natomiast białka MHC klasy II mogą wiązać peptydy

różnej długości, od kilkunastu do ponad 20 aminokwasów, gdyż ich miejsce

wiążące pozostaje otwarte z obu stron.

Cząsteczki MHC klasy III wchodzą w skład układu dopełniacza

(komplementu). Zadaniem układu dopełniacza jest uzupełnianie (do-

pełnianie) roli przeciwciał w zakresie unieszkodliwiania antygenu. W jego

skład wchodzą białka surowicy i płynów tkankowych, których jest

łącznie z czynnikami regulującymi około 30. Białka te są oznaczane

literą C (ang. complement) i liczbą. Białka C2, C4 i czynnik B (BF)

u ludzi są kontrolowane przez loci MHC klasy III, u myszy natomiast

przez loci regionu S w obrębie H-2.

10.3.1.1. Główny układ zgodności tkankowej myszy

Badania głównego układu zgodności tkankowej były prowadzone począt-

kowo u myszy, a ich wyniki miały ogromne znaczenie dla późniejszych

badań MHC człowieka, a potem również zwierząt gospodarskich.

Pierwotnie w MHC u myszy zidentyfikowano regiony K, I, S i D, które

określono symbolem H-2 (ryć. 10-5). Późniejsze badania ujawniły, że także

geny w regionach sprzężonych Qa i Tlą kodują cząsteczki MHC. Geny

kodujące białka MHC klasy I znajdują się w regionach H-2K i H-2D (tzw.

klasyczne cząsteczki klasy I, oznaczane symbolem la). Geny zlokalizowane

w regionach Qa ł Tlą kodują cząsteczki zaliczane także do klasy I, z tym

jednak że określane są one jako cząsteczki nieklasyczne (Ib), niektóre z nich

też biorą udział w odpowiedzi immunologicznej. Geny klasy I MHC mają

po osiem eksonów kodujących funkcjonalne domeny białek MHC klasy I.

Dotychczas wykryto co najmniej 15 genów klasy la, kontrolujących syntezę

klasycznych białek MHC klasy I. Badania sekwencji genu Qa-2,3 wskazują

na wysoką homologię (80%) tego genu z genami klasycznych antygenów

transplantacyjnych. Natomiast produkty genów kompleksu Tlą i Qa wyka-

236

żują wiele różnic w porównaniu z antygenami transplantacyjnymi. W
regionie Qa-2,3 i Tla zmapowano dotychczas 31 genów.

Gen kodujący łańcuch lekki (

-mikroglobulinę) cząsteczek klasy I,

bardzo istotny dla ekspresji produktów genów klasy I, znajduje się
poza MHC, u myszy w 2, u człowieka w 15 chromosomie, w grupie
sprzężeniowej z locus dehydrogenazy sorbitolu. Gen ten u ludzi składa
się z ośmiu eksonów, natomiast u myszy z trzech eksonów. Sekwencja
aminokwasowa

-mikroglobuliny wykazuje wysoką homologię z domeną

immunoglobulin i odpowiednimi domenami antygenów
transplantacyjnych klasy I.

Białka klasy II są determinowane przez geny zlokalizowane w sub-

regionach H2-A i -E, -P, -O/N oraz -M. Każda podklasa ma co najmniej
jeden gen łańcucha

α i β, z wyjątkiem H2-P, który ma pojedynczy

pseudogen oznaczony symbolem H-2Pb. Wzór eksonów i intronów genów
klasy II wskazuje na bliską współzależność między tymi genami i
podobieństwa struktury z genami klasy I oraz genem

-mikroglobuliny.

Białka klasy III są kontrolowane przez geny regionu S.

Wśród regionów H-2 na szczególną uwagę zasługuje region I (między

regionami K i S), w którym znajdują się geny kontrolujące odpowiedź
immunologiczną (wytwarzanie przeciwciał przeciwko ponad 40 różnym
antygenom), oznaczone symbolem Ir (ang. immune response).

10.3.1.2. Główny układ zgodności tkankowej człowieka

•

U ludzi MHC (HLA) znajduje się w krótkim ramieniu chromosomu 6,
zajmuje łącznie około 4 mpz DNA (4 miliony par zasad), czyli ponad 0,1%
całego genomu. Częstość rekombinacji między skrajnymi końcami tego
kompleksu genów wynosi około 1%.

Struktura HLA przedstawiona jest na liniowym diagramie (ryć. 10-6).

Klasyczne cząsteczki klasy I kodowane są przez 3 loci — HLA-A, -B i -C,

natomiast cząsteczki kontrolowane przez loci HLA-E, -F i -G należą do
nieklasycznych cząsteczek klasy I. Geny klasy II HLA znajdują się w pięciu
podklasach: DQ, DR, DP, DOB/DNA i DM, przy czym trzy
pierwsze

kodują klasyczne cząsteczki klasy II, podczas gdy czwarta podklasa,
DOB/DNA, determinuje syntezę nieklasycznych cząsteczek klasy II. Od-
kryty niedawno locus DM jest nieco inny niż pozostałe, bowiem jego
sekwencja jest w takim samym stopniu podobna do genów klasy I, jak i do
genów klasy II. Cząsteczka MHC kodowana przez ten locus odgrywa
szczególną rolę w prezentacji antygenów, co potwierdza fakt, iż komórki
nie wykazujące ekspresji tej cząsteczki mają upośledzoną zdolność
prezentacji antygenów.

Podobnie jak u myszy, region klasy II HLA zawiera także geny, które

strukturalnie nie należą do genów klasy II. Najbardziej interesujące z im-
munologicznego punktu widzenia są geny włączone w przetwarzanie
własnych białek komórkowych. Biorą one udział w proteolizie białek, m.in.
białek transkrypcyjnych oraz białek nieprawidłowych. Są to geny
TAP1 i TAP2 kodujące peptydowe transportery, przenoszące peptydy
(pocięte białka) do siateczki śródpłazmatycznej w celu prezentacji ich przez
cząsteczki klasy I MHC. Dwa inne geny LMP2 i LMP7 kodują podjednostki
kompleksu białek cytoplazmatycznych nazywanych proteasomami. O
szczególnej roli proteasomu świadczy określanie go jako
„wewnątrzkomórkowego układu immunologicznego".

Dotychczas wykryto 267 allełi klasy I HLA, 314 alleli klasy II i 40

alłeli klasy III. Ta liczba alleli wynika z ogromnego polimorfizmu genów
MHC. Stwierdzono na przykład, że geny HLA-A, -B, -DRB i -DPB
występują w postaci kilkudziesięciu alleli (tab. 10-11). Nieliczne z
genów MHC, na przykład DRA, mają tylko 2 allele. Jest pewnym
paradoksem, iż cząsteczka DR jest kodowana przez wysoko
polimorficzny gen DRB (determinujący syntezę łańcucha

β) oraz

dialleliczny gen DRĄ (kontrolujący syntezę łańcucha

α).

Ponadto w obrębie HLA wykryto także kilkanaście pseudogenów, nie

podlegających transkrypcji (np. HLA klasy II — DPB2 i DPA2) oraz geny
kodujące inne białka, m.in. geny dla 21-hydroksylazy (CYP21), białek
szoku

238

cieplnego 70 (HSP70) i dwa geny dla czynnika martwicy nowotworu (TNFA
i TNFB).

Jak wspomniano na początku tego podrozdziału, główny układ zgodności

tkankowej jest regionem względnie konserwatywnym i istnieje wiele
homologii między MHC u ludzi i różnych gatunków zwierząt. Na przykład
homologia genów klasy II u ludzi i myszy jest następująca:

myszy: Aa A

β P O/N M

ludzie: DQ

α DQβ DKα DRβ DP DOB/DNA DM

10.3.1.3. Główny układ zgodności tkankowej

zwierząt gospodarskich

Główny układ zgodności tkankowej zwierząt gospodarskich jest mniej
poznany. Wiadomo jednak, iż homologia między poszczególnymi gatunkami
i człowiekiem jest duża. Porównanie genów znajdujących się w obrębie
MHC u poszczególnych gatunków zwierząt zawarto w tabeli 10-111.

Główny układ zgodności tkankowej bydła

Główny układ zgodności tkankowej bydła zlokalizowano w 23 chromosomie,
w którym znanych jest także ponad 30 genów strukturalnych i kilkanaście
markerów mikrosatelitarnych. Jest to najlepiej poznany chromosom bydła.
Liczba poznanych haplotypów BoLA jest już bardzo długa i stale się
zwiększa. Struktura BoLA przedstawiona jest na rycinie 10-7.

Produkty genów klasy I są to klasyczne cząsteczki MHC. Nie wykryto

dotąd cząsteczek klasy I będących nieklasycznymi cząsteczkami. Geny klasy
I należą do dwóch grup — A i B, różniących się delecją 6 par zasad
w eksonie 5, który koduje krótki fragment transbłonowy łańcucha cząsteczki

239

MHC. W obrębie klasy II obserwowany jest duży polimorfizm genów. Za
pomocą analizy molekularnej (RFLP) zidentyfikowano już 46 haplotypów
DRB, 26 DQB i 31 DQA. W locus DRB wykryto pseudogen (DRB1), różniący
się od genów tego locus kodonem „stop" w eksonie kodującym transbłonowy
fragment łańcucha cząsteczki MHC. Homologia między genami BoLA i HLA
jest stosunkowo duża. Na przykład gen DRB3 wykazuje 85% homologii
z genem HLA — DRB1, natomiast DQA bydła i człowieka — 75% homologii.

Główny układ zgodności tkankowej świni

Główny układ zgodności tkankowej świń został zmapowany w chromosomie
7 ponad ćwierć wieku temu. Regiony klasy I i II znajdują się blisko siebie,
odległość między nimi wynosi 0,4 cM. Natomiast odległość między genami
klasy I i III oraz III i II jest co najmniej o 100 tyś. par zasad mniejsza niż
w MHC u ludzi. Nie jest znana dokładna liczba genów klasy I SLA, szacuje
się, że jest ich około 7-10. Tylko kilka genów regionu klasy I wykazuje
ekspresję. Są to PD1, PD7 i PD14, których homologia wynosi około 80-85%,
i bardziej różniące się od nich (podobieństwo około 50%) PD6 i PD15.
Wydaje się, że region klasy I SLA jest mniejszy od analogicznego regionu
u ludzi i myszy.

Region klasy II zawiera wiele genów, spośród których przypuszczalnie

tylko DR i DQ wykazują ekspresję na poziomie białka. Niektóre geny, DQA,
DQB, DRĄ i DRB, mają dużą homologię, w granicach 75-87%, z od-
powiadającymi im genami HLA. Podobnie jak u innych gatunków, w SLA

240

Ryć. 10-8. Schemat głównego układu zgodności tkankowej świni (SLA) (wg: Schook

i Lamont, 1996, zmodyfikowano)

znajdują się także pseudogeny. Jest nim na przykład gen DRB2, w którym
stwierdzono delecję nukleotydu w kodonie 53.

W regionie klasy III, w przeciwieństwie do innych gatunków, znajdują

się po jednym genie CYP22, C2 i C4. W regionie tym są także inne geny
typowe dla tego układu (ryć. 10-8).

Główny układ zgodności tkankowej owcy

Główny układ zgodności tkankowej owiec oznaczony jest skrótem OLA,
ale można również spotkać określenie Ovar (ang. ovine  aries). Dotąd nie
sporządzono mapy fizycznej tego układu, ale informacje uzyskane za
pomocą analizy sprzężeń wykazują podobieństwa OLA do MHC u ludzi
i bydła. Mapa sprzężeniowa owczego chromosomu 20, w którym znajduje
się  główny układ zgodności tkankowej, ma długość 5,6 cM. W regionie
OLA klasy I zidentyfikowano blisko sprzężone loci: OLA -A i -B, a częstość
rekombinacji między nimi wynosi 0,6%. W regionie klasy II, podobnie jak
u bydła, obok genów MHC znajdują się pseudogeny. Najlepiej poznany
jest pseudogen DRB2.  W wyniku mutacji, które wykryto w tym pseudo-
genie, w eksonach 3 i 4 znajdują się kodony „stop", powodujące, iż nie
jest on funkcjonalny. Geny klasy II wykazują duży polimorfizm, przy
czym geny z locus DQB cechuje większy polimorfizm niż z locus DQA i DRĄ.

241

Struktura genetyczna regionu OLA klasy III wykazuje dużą homologię do
HLA. Długość tego regionu u owiec wynosi około 150 tyś. par zasad. Cecha
charakterystyczną klasy III OLA jest duplikacja loci dopełniacza C4 i 21--
hydroksylazy (CYP21).

Główny układ zgodności tkankowej kury

U drobiu geny MHC są zlokalizowane w dwóch kompleksach: B i Rfp-Y,
które są klasyfikowane niezależnie. Kompleks B znajduje się w 16 mikro-
chromosomie, natomiast w odniesieniu do Rfp-Y większość badaczy uważa,
że jest on zlokalizowany również w tym chromosomie (ryć. 10-9). Chromo-
som 16 jest jedynym chromosomem u drobiu mającym obszar jąderkotwór-
czy (NOR). Za typowy MHC uważany jest kompleks B, przypuszcza się
natomiast, że kompleks Rfp-Y jest włączony w proces rozpoznania przez
komórki NK — naturalnych zabójców.

Długość kompleksu B u drobiu wynosi prawdopodobnie 300-400 kpz,

częstość rekombinacji między skrajnymi loci tego układu -- około 0,5%.
Z kolei, częstość rekombinacji regionu Rfp-Y z regionem B wynosi 100%.
Badania MHC u drobiu koncentrują się na kompleksie B. Dotychczas
stwierdzono ponad 30 haplotypów tego kompleksu. Region klasy I ozna-
czony jest symbolem B-F, klasy II — B-L, a klasy IV — B-G. O ile funkcje
regionów B-F i B-L są znane, o tyle funkcja regionu B-G wciąż nie jest
wyjaśniona. U drobiu nie ma regionu klasy III, chociaż niedawno zmapo-
wano w obrębie MHC u drobiu gen G9a należący do klasy III HLA.
Wyniki badań prowadzonych na dużych populacjach referencyjnych
wskazują na możliwość sprzężenia przynajmniej kilku genów klasy III
z MHC drobiu.

Jak już wspomniano przy omawianiu budowy cząsteczki klasy I, gen

łańcucha lekkiego (

-mikroglobuliny) znajduje się poza głównym układem

242

zgodności tkankowej. U drobiu zlokalizowano go metodą FISH (hybrydyza-

cja fluorescencyjna in situ) w dużym mikrochromosomie (numer 9 lub 10

pod względem wielkości).

10.3.2. Identyfikacja cząsteczek głównego układu

zgodności tkankowej

Określanie genotypu osobnika pod względem układu zgodności tkankowej

(haplotypu) może być przeprowadzane dwoma podstawowymi sposobami:

1) za pomocą metod serologicznych, pozwalających na identyfikację

określonej cząsteczki (białka, antygenu) MHC,

2) poprzez analizę molekularną DNA, dzięki której możliwe jest wykrycie

obecności danego allelu MHC.

Do badań serologicznych wykorzystywane są surowice lub, od pewnego

czasu, przeciwciała monoklonalne. Natomiast bezpośrednia identyfikacja

genów MHC jest możliwa dzięki takim technikom genetyki molekularnej, jak:

• hybrydyzacja z sondą komplementarną do danego allelu (ang. allele

specific oligonucleotides — ASO), poprzedzona amplifikacją danego frag

mentu DNA (PCR),

• metoda RFLP.

Cząsteczki MHC klasy II można również identyfikować w mieszanej

hodowli limfocytów (MLC). Udoskonaleniem tej techniki jest test HTC,

w którym używane są homozygotyczne komórki stymulujące. Zaintereso-

wani tym zagadnieniem znajdą szczegółowe informacje w podręczniku

immunologii.

10.3.3. Znaczenie głównego układu zgodności tkankowej

10.3.3.1. Związek MHC z odpornością na choroby

Najważniejszą funkcją cząsteczek MHC jest udział w odpowiedzi immunolo-

gicznej organizmu na infekcje wewnątrzkomórkowe. Mechanizm ten przed-

stawiony jest w podrozdziale: Zarys przebiegu reakcji odpornościowej.

Rola głównego układu zgodności tkankowej w odporności/podatności na

wiele chorób u ludzi jest przedmiotem intensywnie prowadzonych badań.

Znane są już powiązania antygenów MHC z zapadalnością na różne choroby.

U zwierząt gospodarskich analogiczne badania są znacznie mniej zaawan-

sowane, ale ich wyniki świadczą o wpływie MHC na podatność/odporność na

niektóre choroby.

Na przykład, badania układu zgodności tkankowej u bydła (BoLA)

wykazały jego związek z odpornością na mastitis, białaczkę, tuberkulozę,

inwazję kleszczy i pasożytów oraz trypanosomatozę (tab. 10-IV).

243

U owiec najbardziej zaawansowane są badania nad zależnością między

podatnością/odpornością na inwazje pasożytnicze a głównym układem
zgodności tkankowej. Podstawowym celem tych badań jest ustalenie
antygenów MHC mogących być wskaźnikami selekcyjnymi odporności
owiec na pasożyty wewnętrzne.

Główny układ zgodności tkankowej u koni (ELA) jest najmniej poznany,

ale stwierdzono już jego związek z odpornością na raka skóry.

U trzody chlewnej geny klasy I są przypuszczalnie głównymi genami

włączonymi w regulację odpowiedzi immunologicznej na inwazję nicieni
Trichinella spiralis.

U kur główny układ zgodności tkankowej jest związany z odpornością

na chorobę Mareka, kokcydiozę, mięsaka Rousa i cholerę ptasią.

Coraz częściej u zwierząt gospodarskich identyfikowane są haplotypy

związane z określoną reakcją na infekcje. Na przykład, haplotypy klasy II bydła
uznane za skorelowane z odpornością/podatnością na białaczkę są następujące:

DQA*3A-DQB*3A-DRB2*2A-DRB3.2*11 — odporność
DQA*12-DQB*12-DRB2*3A-DRB3.2*8 — podatność

10.3.3.2. Związek MHC z cechami produkcyjnymi i reprodukcyjnymi

Główny układ zgodności tkankowej, oprócz szczególnej roli w reakcji
immunologicznej, oddziałuje także na inne cechy (produkcyjne i reproduk-
cyjne). U bydła mlecznego stwierdzono istotne oddziaływanie niektórych

244

cząsteczek MHC klasy I na cechy związane z użytkowością mleczną,

natomiast u bydła ras mięsnych zauważono korelację między przyrostami

masy ciała i przekrojem mięśnia najdłuższego grzbietu a obecnością

określonych antygenów MHC.

Wyniki badań prowadzonych na trzodzie chlewnej świadczą o wpływie

MHC na cechy tuczne i rzeźne świń, przy czym stwierdzono różną

współzależność danego haplotypu z cechami produkcyjnymi zależnie od rasy.

Badania znaczenia głównego układu zgodności tkankowej w reprodukcji

zwierząt gospodarskich prowadzone były przede wszystkim na świniach.

Dotyczyły one wpływu MHC na stopień owulacji, przeżywalność zarodków

i płodów oraz liczebność miotu. Wykazano wyraźny wpływ haplotypu

rodziców na te cechy. Również u bydła antygeny MHC mogą wpływać na

zamieralność zarodków, obniżać stopień przeżywalności i masę ciała cieląt.

Wykazano ponadto istotny związek niektórych antygenów klasy II z za-

trzymaniem łożyska. U koni natomiast stwierdzono, iż geny ELA mogą

wpływać na zmniejszenie płodności przy kojarzeniach ogierów i klaczy

o identycznych haplotypach.

Dokładne poznanie struktury i funkcji głównego układu zgodności

tkankowej zwierząt gospodarskich oraz jego związku z odpornością,

reprodukcją i produkcyjnością powinno w przyszłości umożliwić wykorzy-

stanie cząsteczek (antygenów) MHC jako markerów genetycznych w dos-

konaleniu zwierząt pod względem tych cech.

10.4. Zarys przebiegu reakcji odpornościowej

W odpowiedzi na wniknięcie patogenów (wirusy, bakterie i pasożyty) do

organizmu układ immunologiczny reaguje w różny sposób, zależnie od

rodzaju patogenu i miejsca infekcji. Zasadniczą rolę w ich rozpoznaniu, bez

względu na to, czy są to antygeny zewnątrzkomórkowe czy wewnątrz-

komórkowe, odgrywają cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej.

Przebieg reakcji immunologicznej jest niezmiernie skomplikowany i, jak

dotychczas, nie do końca został poznany. Obecna wiedza pozwala na

przedstawienie jedynie w zarysie przebiegu reakcji, zwłaszcza w odniesieniu

do zakażenia zewnątrzkomórkowego.

Cząsteczki MHC klasy I biorą udział w odpowiedzi układu immunolo-

gicznego na wirusową infekcję wewnątrzkomórkową. W zakażonej komórce

białka wirusowe ulegają proteolizie (w cytosolu), czyli są degradowane do

peptydów. Peptydy te są następnie przekazywane do siateczki śródplaz-

matycznej. W siateczce śródplazmatycznej są syntetyzowane cząsteczki

klasy I MHC. Tutaj też następuje związanie cząsteczki MHC z peptydem,

po czym powstały kompleks transportowany jest na powierzchnię komórki,

gdzie zostaje rozpoznany przez obecne w pobliżu limfocyty T cytotoksyczne,

245

kompleks jest transportowany na powierzchnię komórki i tutaj roz-
poznawany przez limfocyty T CD4 typu zapalnego (Thl). Limfocyty
te nie mszczą komórek tak jak limfocyty T cytotoksyczne (CD8), ale
uwalniają limfokiny aktywujące komórkę do zwalczenia infekcji (ryć.
10-10b). W określonych przypadkach, gdy jest zbyt mała liczba limfocytów
B zdolnych do rozpoznania antygenu (co może wystąpić przy pierwszym
zetknięciu się organizmu z danym antygenem) bądź gdy fagocytowane
cząsteczki lub bakterie są dużych rozmiarów, makrofagi mogą pełnić
rolę pośrednią, prezentując limfocytom B cząsteczki po fagocytozie i wstę-
pnej fragmentacji. Makrofagi wchłaniają, degradują i prezentują wszystkie
antygeny (ryć. 10-10b).

Jeśli bakterie zostaną pochłonięte przez limfocyty B, w odpowiedzi

immunologicznej biorą udział limfocyty T CD4 pomocnicze, określane jako
Th2. Dojrzały limfocyt B ma na swej powierzchni przeciwciała IgM lub IgM
i IgD, które służą jako receptory antygenów. Obce białko rozpoznane przez
limfocyt B jest przekazywane do wakuoli (endosomów) i tam trawione na
krótkie peptydy. Następnie peptydy te są wiązane przez cząsteczki klasy II,
które dotarły tu z siateczki śródplazmatycznej. Utworzony kompleks, po
przedostaniu się na powierzchnię komórki, jest rozpoznawany przez limfocyt
pomocniczy T. Limfocyt ten daje sygnał limfocytom B do proliferacji
(namnażania) i syntezy przeciwciał. Zaktywowane limfocyty B rozpoczynają
syntezę przeciwciał wtórnych (IgG, IgE lub IgA), które różnią się od
pierwotnych tylko strukturą łańcucha ciężkiego. Tak więc wytwarzanie
przeciwciał przez limfocyty B jest kontrolowane przez cząsteczki MHC
i limfocyty T (ryć. 10-10b).

Zdolność cząsteczek MHC do wiązania peptydów, a raczej ich pojemność

jest różna. Jedna cząsteczka MHC klasy I może w swym rowku związać
około 1000 różnych peptydów, natomiast cząsteczka klasy II może ich
związać dwa razy więcej.

Cząsteczki MHC biorą także udział w usuwaniu własnych białek

pochodzących z komórek, które uległy apoptozie. Apoptoza (gr. apoptosis -
opadanie) jest to programowana śmierć komórki, czyli jej fizjologiczna
śmierć. Podczas tego procesu komórka początkowo kurczy się i oddziela od
sąsiednich komórek, chromatyna ulega kondensacji na obrzeżach jądra,
wkrótce potem jądro, a następnie cała komórka pęka, a jej fragmenty są
trawione przez sąsiadujące komórki.

10.5. Genetyczna oporność na choroby

Zmienność obserwowana u zwierząt dotyczy nie tylko cech użytkowych
(mleczność, nieśność itd.), ale także oporności/podatności na choroby zakaźne
i inwazyjne. Ostatnio coraz więcej uwagi poświęca się genetycznie uwarun-

247

kowanej oporności na choroby. Oporność na choroby jest definiowana jako

właściwość organizmu uniemożliwiająca rozwój choroby pomimo wniknięcia

patogenu. Genetyczna oporność nie obejmuje typowej odpowiedzi im-

munologicznej.

Mechanizm dziedziczenia genetycznej oporności na różne choroby nie

został jeszcze w pełni poznany. Na ogół jest to cecha poligeniczna, chociaż

w przypadku niektórych schorzeń stwierdzono, iż oporność na nie zależy

od pojedynczego genu o dużym efekcie, np. mutacja w genie FUT1

odpowiadająca za oporność prosiąt na chorobę obrzękową. W ośrodkach

naukowych wielu krajów prowadzone są intensywne badania, których

celem jest znalezienie takich genów.

Podstawowe założenia poszukiwania genów odpowiedzialnych za opor-

ność zwierząt na choroby obrazuje schemat (ryć. 10-11). Wybór cechy

będącej wskaźnikiem oporności powinien być przeprowadzony z

uwzględnieniem pewnych kryteriów. Cecha ta powinna:

• charakteryzować się dużą genetyczną zmiennością i odziedziczalnością

• mieć istotną wartość ekonomiczną; może nią być produkt nadający się

do sprzedaży bądź zmniejszający koszty produkcji

• być łatwa do mierzenia bez ponoszenia wysokich kosztów.

Gdy cecha — wskaźnik oporności jest już wybrana, należy oszacować jej

zmienność genetyczną. Umożliwi to poznanie sposobu jej dziedziczenia.

W przypadku gdy oporność na chorobę jest cechą poligeniczna, następnym

krokiem jest oszacowanie parametrów genetycznych: odziedziczalności tej

cechy i jej korelacji genetycznej z innymi cechami istotnymi ekonomicznie.

Informacje te mogą być przydatne w opracowaniu strategii doskonalenia

oporności. Jeśli okaże się, iż cecha oporności jest warunkowana pojedynczym

genem, celowe jest zmapowanie tego genu, czyli określenie jego położenia

w chromosomie, następnie sklonowanie go i poznanie sekwencji nukleo-

tydów.

248

Zasadniczym krokiem w badaniach genetycznej oporności jest po-

szukiwanie sprzężeń między genetyczną opornością, warunkowaną wieloma

lub jednym genem, a markerami genetycznymi, takimi jak antygeny

erytrocytarne czy białka polimorficzne (markery klasy I) lub niekodujące

sekwencje DNA (markery klasy II). Sprzężenia takie są szczególnie korzystne

w selekcji, gdyż umożliwiają określanie oporności/podatności zwierzęcia

bez konieczności zarażania go patogenami.

W opracowaniu strategii doskonalenia oporności genetycznej wykorzys-

tuje się zarówno metody tradycyjne, jak i techniki inżynierii genetycznej.

Tradycyjna praca hodowlana w kierunku zwiększenia oporności zwierząt

może być prowadzona w drodze selekcji pośredniej na podstawie takich

cech, jak:

• cechy eksterierowe (widoczne gołym okiem),

• cechy, które są określane za pomocą testów serologicznych lub

elektroforezy,

• cechy ustalane za pomocą badań molekularnych DNA.

Klasycznymi przykładami cech eksterierowych są: ciemna obwódka

wokół oczu u bydła rasy hereford (bydło z biało umaszczoną głową),

związana z opornością na raka oczu, i barwne upierzenie drobiu, wskazujące

na większą niż u osobników białych oporność na choroby wirusowe.

Znajomość cech określanych metodami serologicznymi, które mogą być

wskaźnikami oporności na choroby, umożliwiałaby prowadzenie selekcji

wśród zwierząt młodych. Wyniki badań prowadzonych na owcach w Au-

stralii i Nowej Zelandii wskazują na zależność między genotypem hemo-

globiny a częstością zarażenia pasożytem Haemonchus contortus. Zwierzęta

z hemoglobiną AA są bardziej oporne niż osobniki z hemoglobiną AB i BB.

Innym markerem biochemicznym mogą być antygeny erytrocytarne grup

krwi. Na przykład, u bydła opornego na białaczkę częściej występują

antygeny erytrocytarne B, Y

D' i P'.

Największe możliwości ograniczania występowania chorób u zwierząt

na drodze hodowlanej stwarzają wyniki badań molekularnych określających

sekwencje nukleotydowe genów, jak również badania genetycznej struktury

głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Ustalenie na tej podstawie

oporności (lub podatności) na choroby jest możliwe już u zarodka, co ma

zasadnicze znaczenie w hodowli bydła wobec coraz szerzej stosowanego ich

transferu.

Na zmienność w podatności na choroby infekcyjne i pasożytniczne

składają się zarówno różnice osobnicze, jak i rasowe. Na przykład, rodzime

rasy bydła w Indii są bardziej wrażliwe na brucelozę niż ich mieszańce

z rasami europejskimi. W Kenii zarażenie bydła motylicą wątrobową jest

o wiele częstsze u ras importowanych z Europy niż u ras miejscowych.

Powszechnie znana jest oporność rodzimego bydła afrykańskiego N'Dama

na infekcję świdrowca Trypanosoma brucei brucei, która prowadzi do śpiączki

afrykańskiej (trypanosomatoza). Choroba ta dziesiątkuje populacje bydła

249

afrykańskiego. Różnice rasowe w oporności/podatności na choroby mogą
być wykorzystywane do krzyżowania w celu uzyskania mieszańców opor-
nych na daną chorobę.

Zmienność podatności zwierząt na choroby najlepiej poznano u kur.

Dzięki wysokiej plenności i szybkiej rotacji pokoleń prowadzona u tego
gatunku intensywna selekcja w kierunku oporności na chorobę Mareka
umożliwiła wytworzenie rodów kur całkowicie niewrażliwych na to scho-
rzenie, z zachowaniem ich wysokiej produkcyjności. Mechanizm oporności
na chorobę Mareka przypuszczalnie polega na ograniczaniu rozwoju guzów
u zainfekowanych ptaków, nie zabezpieczając ich przed infekcją. Zjawisko
oporności u kur obserwowane jest także w odniesieniu do kokcydiozy
i salmonellozy. Kokcydioza powoduje obniżony stopień wzrostu, zmniej-
szone wykorzystanie paszy, a także, zwłaszcza u młodych kurcząt, śmiertel-
ność. Za wskaźnik oporności na kokcydiozę przyjęto liczbę produkowanych
oocyst. Badania genetycznych uwarunkowań oporności na kokcydiozę
wskazują na rolę genów głównego układu zgodności tkankowej (MHC)
i genów zlokalizowanych poza tym układem. Kokcydioza jest równocześnie
przykładem choroby, której częstość występowania jest w dużej mierze
stymulowana działaniem czynników środowiskowych, w tym przypadku
jest to temperatura otoczenia. Zależność ta jest następstwem zróżnicowanej
zdolności termoregulacji u młodych ptaków.

Wyniki badań wrażliwości kur na bakterie Salmonella (S. typhimurium, S.

pullorum, S. gallinarum, S. enteritidis) sugerują, że oporność na nie zależy od
funkcji fagocytarnych komórek przede wszystkim śledziony i wątroby.
Ponadto świadczą one, iż oporność na salmonellozę jest dominująca i może
być warunkowana pojedynczym genem.

Wykorzystanie zjawiska genetycznej oporności w celu poprawy zdro-

wotności zwierząt gospodarskich ma szczególne znaczenie w przypadku
chorób trudnych do zwalczania metodami weterynaryjnymi. Należą do
nich stany zapalne gruczołu mlecznego (mastitis), które są przyczyną
poważnych strat ekonomicznych w hodowli bydła mlecznego. Jedną
z dróg ograniczania występowania mastitis u bydła jest wykorzystanie
w pracy hodowlanej różnic w genetycznych skłonnościach do tego scho-
rzenia. Obserwowane są zarówno różnice rasowe, jak i indywidualne.
Na przykład, krowy rasy nizinnej czarno-białej i czerwonej duńskiej
częściej zapadają na zapalenia gruczołu mlecznego niż holsztyńsko-fry-
zyjskiej, simentalery czy szwyce.

Oprócz różnic rasowych w podatności krów na mastitis stwierdzono

także wyraźne różnice w częstości występowania tego schorzenia między
rodzinami (po matkach) i liniami (po ojcach). Ze względu na stosowaną
sztuczną inseminację problem przekazywania przez ojca oporności na
mastitis jest bardzo istotny. Prowadzone są badania nad możliwością
wprowadzenia do oceny wartości hodowlanej buhajów cechy „choroba"
(mastitis). W Norwegii od 1978 roku mastitis jest już włączone jako cecha

250

selekcyjna w programach hodowlanych. Ocena rozpłodników jest dokony-

wana na podstawie zdrowotności gruczołu mlecznego ich potomstwa

żeńskiego. Inną drogą zwalczania mastitis jest selekcja buhajów w kierunku

zmniejszenia zawartości komórek somatycznych w mleku ich córek. Ta

metoda selekcji jest zalecana na przykład w Szwecji. Jednakże badania

niektórych autorów wykazały istotną rolę poszczególnych rodzajów komórek

somatycznych w zabezpieczaniu wymienia przed drobnoustrojami chorobo-

twórczymi. Można zatem przypuszczać, iż selekcja w kierunku zmniejszenia

zawartości komórek somatycznych w mleku może zmniejszyć zdolność

krów do reakcji na infekcje gruczołu mlecznego. Wydaje się, iż byłoby

celowe prowadzenie selekcji pośredniej, opartej na wskaźnikach fenotypo-

wych oporności. Wielu badaczy wiąże skłonność krów do stanów zapalnych

(mastitis) z budową i wielkością wymienia oraz strzyków, która w znacznym

stopniu jest uwarunkowana genetycznie. Stwierdzono na przykład, że

mastitis najczęściej występuje u krów, których wymiona wykazują morfo-

logiczne i fizjologiczne odchylenia od normy, takie jak: nieproporcjonalny

rozwój przednich i tylnych ćwiartek, zbyt duża wielkość i niskie zawieszenie,

za duże lub za małe strzyki. Obecnie w programach hodowlanych kładzie

się wyraźny nacisk na cechy morfologiczne wymion i zdolność wydojową

krów, w celu ograniczania występowania mastitis poprzez selekcję. Pod-

stawowymi kryteriami tej selekcji są, oprócz wydajności, kształt i wielkość

wymienia oraz strzyków, ustawienie strzyków, wysokość zawieszenia

wymienia i szybkość oddawania mleka. Wybór tych cech jest uzasadniony

ich uwarunkowaniem genetycznym i powiązaniem ze stanem zdrowotnym

wymienia. Celem tych działań jest wyselekcjonowanie krów o prawidłowej

budowie wymienia, charakteryzujących się wysoką produkcją mleka i zwięk-

szoną opornością na mastitis.

Innym schorzeniem u bydła, którego leczenie jest bezskuteczne, jest

białaczka limfatyczna. Jej występowanie stwierdzono na wszystkich kon-

tynentach, ale najczęściej atakuje ona bydło w krajach strefy umiarkowanej.

Ponieważ wszelkie metody zwalczania białaczki (poza eliminacją zwierząt

zarażonych) stosowane przez lekarzy weterynarii nie przynoszą oczekiwa-

nych wyników, coraz więcej uwagi poświęca się zagadnieniom wpływu

założeń genetycznych na skłonność do tego schorzenia, jak również

niekorzystnym warunkom środowiska (np. niedobór niektórych pierwiast-

ków, jak: magnez, wapń, kobalt i mangan). Na podstawie licznych badań

można sądzić, że skłonność do białaczki jest przekazywana przez rodziców,

a zwłaszcza przez chore matki. Wydaje się, że większa zapadalność na

białaczki krów od matek chorych jest następstwem nie tylko dziedziczenia

skłonności do tej choroby, ale także zakażenia przez łożysko, siarę i mleko

oraz, co zostało udowodnione, przez uprzednio zarażoną wirusem białaczki

komórkę jajową. Wpływ buhajów na skłonność ich córek do białaczki nie

jest tak silny jak wpływ matek. Wiadomo, iż wirus białaczki limfatycznej nie

jest przenoszony podczas sztucznej inseminacji przez nasienie. Z drugiej

251

jednak strony wielu badaczy stwierdzało, że krowy po niektórych buhajach

znacznie częściej zapadają na tę chorobę, co może być dowodem na

dziedziczenie podatności na białaczkę.

Badania nad genetyczną opornością świń na choroby dotyczą przede

wszystkim biegunek u prosiąt, ale także innych schorzeń, na przykład

schorzeń kończyn. Genetyczne uwarunkowanie oporności prosiąt na bie-

gunki okresu noworodkowego i poodsadzeniowego wywoływane szczepami

K88 E. coli i F18 E. coli jest opisane w podrozdziale: Mutacje genowe. W tym

miejscu należy podkreślić, że praktycznie nie jest możliwe uzyskanie

zwierząt opornych na kilka chorób jednocześnie. Można jedynie mówić

0 doskonaleniu cechy oporności na określone schorzenie.

U owiec stwierdzono zróżnicowaną oporność na pasożyty wewnętrzne.

Stwarza to możliwość wykorzystywania tej właściwości w ograniczaniu

stopnia inwazji pasożytniczych u tego gatunku zwierząt. Oporność owiec

na pasożyty żołądkowo-jelitowe może przejawiać się jako zdolność żywiciela

do kontrolowania występowania pasożyta, przez zmniejszanie jego ilości

1 ograniczanie przeżywalności (ang. resistance), lub też jako zdolność do

współżycia z pasożytem (ang. resilience) poprzez utrzymywanie produkcyj-

ności na nie zmienionym poziomie nawet podczas inwazji. Genetyczna

zmienność zdolności do współżycia żywiciela z pasożytem, w odróżnieniu

od genetycznej zmienności oporności, cieszy się mniejszym zainteresowniem

wśród badaczy, przede wszystkim z powodu trudności w znalezieniu

odpowiedniego wskaźnika tego stanu. Stwierdzono, iż między opornością

owiec na zarażenie nicieniami żołądkowo-jelitowymi (np. Haemonchus

contortus) a „resilience" istnieje dodatnia korelacja genetyczna, której wartość

waha się w granicach 0,5-0,6. Prowadząc selekcję w kierunku oporności na

pasożyty można oczekiwać poprawy skorelowanej z nią cechy zdolności

współżycia z pasożytem.

Rozdział

W klasycznym ujęciu marker genetyczny to cecha jakościowa, uwarun-

kowana w sposób prosty — tzn. przez jedną parę alleli, przydatna do celów

analizy genetycznej. Przydatność markera zależy od tego, czy jest on

polimorficzny, co zachodzi wówczas, gdy w populacji występują przynaj-

mniej dwa allele w locus tego markera. Polimorfizm markerów bada się

zazwyczaj za pomocą metod analitycznych, wśród których dominują metody

serologiczne oraz biochemiczne — oparte na elektroforezie.

Metody serologiczne wymagają stosowania surowic testowych, zawiera-

jących przeciwciała skierowane przeciw ściśle określonej postaci białka,

a dokładniej — rozpoznające konkretną determinantę antygenową. W ten

sposób badane są antygeny erytrocytarne (grupy krwi), antygenowe deter-

minanty białek surowicy krwi (allotypy), antygeny głównego układu

zgodności tkankowej, umiejscowione na niektórych frakcjach leukocytów

(antygeny klasy II) lub innych komórkach mających jądro (antygeny klasy I).

Technikę elektroforezy wykorzystuje się do rozdziału w polu elektrycz-

nym białek oraz fragmentów DNA. Rozdział elektroforetyczny ujawnia

formy różniące się ruchliwością, która zależy od wielkości i ładunku

elektrycznego cząsteczki białka (lub fragmentu DNA) oraz jej konformacji

przestrzennej, a z drugiej strony od parametrów fizycznych rozdziału

(napięcie, temperatura, stężenie nośnika — żelu itp.). W przypadku DNA

rozdział może być poprzedzony trawieniem wyizolowanego (lub zamplifi-

kowanego metodą PCR) DNA z użyciem enzymów restrykcyjnych. Za-

stosowanie enzymów restrykcyjnych pozwala na ujawnienie polimorfizmu

długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w obrębie genów lub polimor-

fizmu powtarzalnych sekwencji minisatelitarnych, które nie kodują infor-

macji genetycznej. Natomiast bezpośrednia elektroforeza wybranych frag-

mentów DNA, uzyskanych metodą PCR, pozwala na analizę polimorficznych

loci zawierających sekwencje mikrosatełitarne lub też ujawnienie zróż-

nicowanej konformacji pojedynczych łańcuchów zamplifikowanego frag-

253

mentu DNA genu (metoda SSCP — ang. single stranded conformation

polymorphism).

Objęcie badaniami niekodujących sekwencji DNA spowodowało, że

markery zostały podzielone na dwie klasy. Klasa I obejmuje klasyczne

markery, czyli sekwencje kodujące -- geny. Polimorfizm tych markerów

wykrywany jest poprzez analizę produktów genów (metody serologiczne

i technika elektroforezy białek) lub badanie DNA tych genów (metody

RFLP, SSCP). Klasa II markerów to sekwencje niekodujące; wśród nich

najważniejsze miejsce zajmują tandemowo powtarzające się sekwencje

mikrosatelitarne, a w mniejszym stopniu sekwencje minisatelitarne. W tym

przypadku mają zastosowanie tylko badania oparte na elektroforezie DNA.

Oprócz wymienionych wyżej dwóch klas markerów genetycznych można

wyróżnić jeszcze grupę markerów związanych z polimorfizmem chromo-

somowym, który jest wykrywany za pomocą technik prążkowego barwienia

chromosomów. Polimorfizm chromosomowy dotyczy przede wszystkim

wielkości bloków heterochromatyny konstytutywnej (barwienia techniką

CBG) oraz obszarów jąderkotwórczych (technika Ag-I, czyli Ag-NOR).

11.1. Antygeny erytrocytarne (grupy krwi)

Grupy krwi były najwcześniej wykorzystane w analizie genetycznej, np.

dotyczącej kontroli pochodzenia. Do pionierów tych badań należy zaliczyć

m.in. polskiego badacza Ludwika Hirszfelda. Przez grupę krwi należy

rozumieć typ krwi, cechujący się obecnością charakterystycznych białek,

o właściwościach antygenowych, na powierzchni erytrocytów. Identyfikacja

antygenów erytrocytarnych wymaga zastosowania surowic testowych, które

zawierają swoiste przeciwciała skierowane przeciw konkretnemu antygenowi.

Intensywne badania nad polimorfizmem antygenów erytrocytarnych u

zwierząt domowych podjęto na przełomie lat 50. i 60. Ich efektem było

wykrycie wielu układów grupowych. W ich obrębie zidentyfikowano liczne

antygeny i allele je warunkujące. Konkretny układ grupowy krwi jest

warunkowany przez pojedynczy gen (locus), który w populacji jest re-

prezentowany zazwyczaj przez wiele alleli (seria alleli wielokrotnych).

Białka kodowane przez te geny pełnią różnorodne funkcje biologiczne.

Z badań prowadzonych u człowieka wynika, że mogą one być enzymami,

receptorami, cząsteczkami adhezyjnymi czy białkami strukturalnymi. Wspól-

ną ich właściwością jest to, że są związane z błoną plazmatyczną erytrocytów,

a ich obecność można wykryć metodami serologicznymi. Po dodaniu do

surowicy testowej zawiesiny erytrocytów dochodzi do reakcji anty-gen-

przeciwciało. Przeciwciała obecne w surowicy testowej wiążą się z

determinantami antygenowymi. W wyniku reakcji antygen-przeciwciało

dochodzi do aglutynacji lub hemolizy krwinek czerwonych. Jeśli białko

ma tylko jedną determinantę antygenową, wówczas jest rozpoznawane

254

za pomocą jednej surowicy testowej. Jeśli białko ma kilka determinant

antygenowych, to wówczas ta forma białka jest wykrywana po zastosowa-

niu odpowiedniej liczby surowic testowych. Wreszcie może być taka

sytuacja, że białko jest pozbawione determinant wykrywalnych dostępnymi

surowicami testowymi. Występowanie różnych form determinanty antyge-

nowej w danym białku jest skutkiem mutacji punktowych. Mutacja taka

może doprowadzić do zmiany sekwencji aminokwasów, a to z kolei może

wpłynąć na zmianę struktury białka, a w tym jego determinanty anty-

genowej. Struktura białka zależy również od modyfikacji potranslacyjnej

polipeptydu przeprowadzonej przez enzymy kodowane przez inne geny.

Jeśli takie geny mają wiele alleli, może to prowadzić do zróżnicowanej

modyfikacji potranslacyjnej, a przez to do utworzenia (lub zlikwidowania)

255

nowej determinanty w antygenie erytrocytarnym. Gdyby dla uproszczenia

przyjąć, że białko ma tylko jedną determinantę antygenową, to wówczas

każda mutacja genu, prowadząca do zmiany budowy białka — rozpozna-

wanej przez surowice testowe — będzie skutkowała powstaniem nowego

allelu (ryć. 11-1). Sytuacja staje się bardziej złożona, gdy białko ma więcej

determinant antygenowych. Wówczas pojedynczy allel jest opisywany za

pomocą kilku surowic testowych. Mówi się wówczas o fenogrupach, czyli

zespole antygenów, które dziedziczą się jak jednostka, a więc są uwarunko-

wane przez jeden allel. W takiej sytuacji mutacja genu zmienia jedną

Ryć. 11-2. Mechanizm powstawania zróżnicowania antygenów erytrocytarnych; przykład

dla białka mającego kilka determinant antygenowych, które pojawiają się w trzech

fenogrupach: abc, ab oraz a’bc). Schemat opiera się na założeniu, że nowe determinanty

antygenowe są skutkiem mutacji genu kodującego łańcuch polipeptydowy antygenu

erytrocytarnego

256

czenia antygenów krwinkowych. Przykłady takie opisano u bydła, głównie
w odniesieniu do układu grupowego B. Należy pamiętać, że istnieją białka
zbudowane z podjednostek kodowanych przez różne geny. Zatem możliwe
jest, że w niektórych przypadkach obie teorie będą miały zastosowanie do
wyjaśnienia połimorfizmu antygenów erytrocytarnych.

Liczba znanych układów grupowych (loci) u zwierząt gospodarskich

wynosi: 7 w genomie konia (układy: A, C, D, K, P, Q, U) oraz owcy (układy: A,
B, C, D, M, R, X), 11 w genomie bydła (układy: A, B, C, F, J, L, M, S, Z, T', R'), 13
w genomie kury (układy: A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, M, O, P) oraz 15
w genomie świni (układy: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O). Biologiczna
funkcja powyższych białek nie została jeszcze poznana. Natomiast bardzo
bogata jest wiedza na temat połimorfizmu występującego w obrębie poszcze-
gólnych układów (tab. 11-1). W przypadku wielu układów grupowych znane
jest umiejscowienie chromosomowe loci. Wśród poznanych układów są takie,
w których wykryto dotąd tylko dwa allele (np. układ L bydła czy układ
C świni), przy czym jeden z nich jest odpowiedzialny za występowanie białka
mającego determinantę antygenową wykrywaną przez surowicę testową,
a drugi allel (allel „ —") koduje białko, które w reakcji z dostępną surowicą
testową nie daje reakcji serologicznej. Układ grupowy, w którym występuje
allel „ — " określany jest jako otwarty. Na drugim biegunie są układy o olbrzy-
mim polimorfizmie, jak np. układ grupowy B bydła, w którym wykryto 40
antygenów i opisano około 1000 alleli (fenogrup). Można przypuszczać, że
cząsteczka białka kodowana przez ten gen ma bardzo zróżnicowaną strukturę
i przez to ma wiele determinant antygenowych. Ponadto determinanty mogą

258

mieć wiele wariantów, a każdy z nich jest rozpoznawany przez odrębną

surowicę testową. W efekcie wśród alleli będą takie, które warunkują

pojawienie się tylko jednej determinanty (rozpoznawanej przez jedną

surowicę), oraz takie, które odpowiadają za występowanie kilku determinant

(rozpoznawanych przez analogiczną liczbę surowic). Pomiędzy tymi skrajnymi

przykładami są liczne układy grupowe, w których zidentyfikowano kilka

czy kilkanaście alleli. W tabeli 11-11 przedstawione są rozpoznane dotychczas

antygeny i allele u koni.

Na uwagę zasługuje układ grupowy A świni. Jego ekspresja zależna jest

od dodatkowego locus S, który ma działanie epistatyczne w stosunku do

locus układu A. Gen S ma dwa allele: S oraz s. W układzie grupowym

A występują dwa antygeny A oraz O. Pojawienie się antygenu A lub

O uzależnione jest od genotypu w locus S, przy czym działanie epistatyczne

pojawia się przy genotypie homozygoty recesywnej ss.

Jak to już wcześniej wspomniano, badanie grup krwi wymaga stosowania

surowic testowych, które powinny spełniać warunek swoistości. Surowice

takie są produkowane przez laboratoria, które zajmują się badaniami

antygenów erytrocytarnych na potrzeby kontroli pochodzenia zwierząt.

Procedura produkcji oparta jest na immunizacji zwierząt, pozyskaniu od nich

surowicy odpornościowej (na ogół poliwalentnej, czyli zawierającej wiele

różnych przeciwciał), a następnie jej „oczyszczaniu" (absorpcji niespecyficz-

nych przeciwciał) do momentu otrzymania surowicy testowej (monowalent-

nej), to znaczy zawierającej przeciwciała skierowane przeciw konkretnemu

antygenowi erytrocytarnemu. Niezmiernie istotne jest, aby surowice testowe,

wyprodukowane w różnych laboratoriach, charakteryzowały się identyczną

swoistością. Cel ten osiąga się poprzez cykliczne przeprowadzanie, pod

auspicjami Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierząt (ang.

International Society for Animal Genetics — ISAG), międzynarodowych

testów porównawczych (ang. comparison test). Polegają one na tym, że do

laboratoriów uczestniczących w teście przesyłane są zestawy zakodowanych

próbek krwi zwierząt. Za pomocą dostępnych surowic testowych należy

ustalić, jakie antygeny występują na erytrocytach w poszczególnych prób-

kach. Zbiorcze wyniki testu są udostępniane zainteresowanym laboratoriom.

W Polsce produkcją surowic testowych zajmuje się Instytut Zootechniki

(bydło, świnie, konie) oraz Zakład Hodowli Koni AR w Poznaniu (konie).

11.2. Białka surowicy krwi, erytrocytów

i leukocytów

Białka surowicy krwi, erytrocytów i leukocytów są drugą, po grupach krwi,

pod względem liczebności grupą markerów genetycznych klasy I. Poszcze-

gólne warianty tych białek są określane za pomocą technik elektroforetycz-

nych (np. elektroforeza w żelu poliakryloamidowym lub elektroforeza

259

dwuwymiarowa czy rozdział białek w gradiencie pH — tzw. elektrofokusing).

Identyfikacja wariantów tych białek musi być potwierdzona w teście porów-

nawczym (pod kontrolą Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwie-

rząt). Na przykład u koni testy takie wykonywane są dla 16 systemów białek.

Polimorfizm białek leukocytów, nazywanych także cząsteczkami lub

antygenami głównego układu zgodności tkankowej (MHC), i ich znaczenie

są omówione szczegółowo w rozdziale: Genetyczne podstawy odporności

i oporności.

Polimorfizm białek surowicy krwi wynika ze zmienności ich form

strukturalnych, będących skutkiem mutacji punktowych w genie kontrolu-

jącym syntezę danego białka lub genach kodujących enzymy odpowiedzialne

za modyfikację potranslacyjną. Niektóre białka i enzymy surowicy krwi

zestawiono w tabeli ll-III. Spośród ponad 25 białek najbardziej polimorficzne

260

są albumina, inhibitor

α-proteaz i transferyna. Liczba rozpoznanych

wariantów elektroforetycznych białek jest jednak specyficzną cechą

gatunkową.

Albuminy współdziałają z globulinami w regulacji równowagi płynów

ustrojowych. Najwięcej wariantów tego białka zidentyfikowano u

bydła. U owiec synteza albumin jest kontrolowana przez locus ALB

umiejscowiony w chromosomie 6 i będący w sprzężeniu z locus białka

wiążącego witaminę D, przy czym jeden z alleli (ALB

) występuje u

większości ras. U świń locus albuminy jest umiejscowiony w chromosomie

8ql2.

Inhibitory

α-proteaz cechuje największy polimorfizm u takich

gatunków, jak świnia, koń i koza. U świń są one determinowane przez

ściśle sprzężone loci (Pi1, PO1A, PO1B, PIZ, P/3, PJ4) zajmujące łącznie

region długości około 2 centymorganów (chromosom 7q24-q26). Ze

względu na to, że różne rasy świń mają całkowicie odmienne haplotypy

(czyli układy sprzężonych alleli z loci genów dla inhibitorów

α-proteaz),

są one cennymi markerami genetycznymi. Tak więc, w rasie szwedzkiej

yorkshire oraz landrace zidentyfikowano po około 40 różnych haplotypów.

Z drugiej strony, niektóre allele są charakterystyczne dla danych ras, jak

np. PO1A

i PO1B

dla wielkiej białej polskiej.

U koni w jednym poznanym dotychczas locus inhibitora

α-proteaz

wykryto 20 alleli, z kolei u kóz inhibitory

α-proteaz są kontrolowane

przez 4 loci, charakteryzujące się podobnym stopniem polimorfizmu (3-5

alleli).

Transferyna jest

β-globuliną, mającą dwa aktywne centra wiązania

żelaza. Jej podstawową funkcją jest transport żelaza z miejsc

absorpcji w przewodzie pokarmowym do różnych komórek organizmu.

Jest to najbardziej polimorficzne białko zidentyfikowane dotychczas u

podstawowych gatunków zwierząt gospodarskich. U koni jest ono

determinowane przez 13 alleli, przy czym jedynie allele Tf-D i Tf-F

występują prawie u wszystkich ras koni. Natomiast u świń allel Tf

jest

głównym allelem u ras europejskich i azjatyckich, podczas gdy allel Tf

występuje przede wszystkim u yorkshire, hampshire i duroc. Najrzadsze

allele to Tf

(tylko u świń rasy hampshire) oraz Tf

(u dzika

europejskiego). Locus transferyny u świń znajduje się w chromosomie 13

(13q31), u bydła w chromosomie l, u owiec także w chromosomie l (Iq42-

q45).

Spośród białek i enzymów erytrocytarnych (tab. 11-IV) szczególnie

interesujące są deaminaza adenozyny i hemoglobina.

Deaminaza adenozyny została dotychczas wykryta u trzody chlewnej,

owiec (chromosom 15), kur i bydła, przy czym u bydła jest to enzym

leukocytarny. U świń w locus ADA znanych jest sześć alleli. Polimorficzne

warianty są związane z różną aktywnością tego enzymu. U

osobników o genotypie ADA°ADA° brak jest deaminazy adenozyny w

erytrocytach, natomiast jest ona aktywna w leukocytach i innych

tkankach. Allel ten, określany jako zerowy, występuje szczególnie często

u zwierząt podatnych na stres, które mają skłonność do wytwarzania

mięsa typu DFD (ciemne, twarde i suche).

261

chromosom). Ciekawe jest, iż łańcuch

β hemoglobiny C (HBB C) jest

wytwarzany tylko w przypadku anemii i tylko u osobników mających allel
HBA, a wielkość tego wytwarzania zależy od nasilenia anemii. Ponadto
wariant A hemoglobiny

β (HBB A) wykazuje większe powinowactwo do

tlenu niż wariant B (HBB B) i związany jest z większą wartością hematokrytu.

11.3. Allotypy immunoglobulin i lipoprotein

Antygenowe właściwości surowicy krwi, określane terminem allotypy, są
to ugrupowania chemiczne (najczęściej jeden lub kilka aminokwasów) wy-
stępujące na cząsteczkach białek i różnicujące osobniki tego samego
gatunku. U większości gatunków zwierząt gospodarskich poznane allotypy
zlokalizowane są przede wszystkim na

α-, β- i γ-globulinach. Stopień

polimorfizmu allotypowego jest różny zależnie od gatunku. U świń
zidentyfikowano dotychczas 16 allotypów we frakcji

β-globulin, 14

allotypów dla

γ-globulin i 3 dla α-globulin. Natomiast u owiec wykryto 11

antygenowych markerów cząsteczek

α-globulin, 10 determinant

antygenowych we frakcji

β-globulin oraz 7 we frakcji γ-globulin.

W przypadku antygenów immunoglobulin u bydła, dotychczas ziden-

tyfikowano 3 allotypy, kontrolowane przez allele bva

, bva

oraz bvb.

Również lipoproteiny, biorące udział w transporcie cholesterolu, wyka-

zują właściwości antygenowe. W zależności od właściwości fizycznych
wyróżnia się pięć klas tych białek, od lipoprotein o bardzo małej gęstości
(VLDL) do lipoprotein o bardzo dużej gęstości (VHDL). Największe
zróżnicowanie allotypów lipoprotein, oznaczonych symbolem Lp, stwier-
dzono dotychczas u świń, u których najbardziej polimorficzny, bo liczący
ponad 21 allotypów, jest układ Lpb. Większość tych allotypów jest deter-
minowana przez kodominujące allele. W następnych układach (Lpr,
Lpt i Lpu) znane są po dwa allele, a w piątym układzie (Lps) tylko jeden
allel. U pozostałych gatunków zwierząt polimorfizm allotypowy
lipoprotein jest niewielki. U bydła zidentyfikowano 3 allotypy, u owiec 1.

11.4. Białka mleka

Głównymi białkami mleka są kazeiny

β i κ

oraz białko serwatkowe

— P-laktoglobulina. U bydła loci kazein znajdują się obok siebie w 6
chromosomie (6q26-q33) i zajmują razem odcinek DNA długości około
200 kpz (tysięcy par zasad). Ze względu na ścisłe sprzężenie loci kazein,
układ sprzężonych alleli nazywany jest haplotypem.

Genotyp zwierzęcia w loci kontrolujących białka mleka można określać

za pomocą metody elektroforezy stosowanej zarówno w przypadku
rozdziału białek (żel skrobiowy lub poliakryloamidowy), jak i analizy na
poziomie DNA (żel agarozowy lub poliakryloamidowy). Określenie
genotypu na podstawie

263

badania białka jest możliwe tylko u samic będących w okresie laktacji.
Natomiast analiza polimorfizmu genów kodujących białka (z wykorzysta-
niem metody RFLP, opisanej w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji ge-
nomu) może być przeprowadzana u osobników obu płci i w każdym wieku.

U bydła w locus kazeiny

wykryto pięć alleli: A, B, C, D i E, przy czym

największą frekwencją u bydła europejskiego charakteryzuje się allel B,
a u bydła indyjskiego — alleł C.

Białko

-kazeiny różni się długością łańcucha od białka

-kazeiny,

składają się one bowiem odpowiednio z 207 i 199 aminokwasów. Poszczegól-
ne warianty a

-kazeiny są kontrolowane przez 4 allele: A, B, C i D, z których

jedynie A i D są obecne w genotypie bydła ras europejskich.

β-Kazeina wykazuje większy polimorfizm niż kazeiny

, albowiem

w locus kontrolującym syntezę tego białka stwierdzono 7 alleli. U bydła
europejskiego najczęściej występuje wariant

β-kazeiny A, bardzo rzadko

wariant

β-kazeiny B (prawie wyłącznie stwierdzane są genotypy hetero-

zygotyczne AB).

Dotychczas u bydła wykryto 6 typów

κ-kazeiny, determinowanych

allelami: A, B, C, E, F i G. Różnice między poszczególnymi wariantami
polegają na zmianie aminokwasu, będącej konsekwencją mutacji punktowej
(tranzycji jednej zasady na inną). Tak więc allele A i B różnią się
nukleotydami w dwóch miejscach łańcucha DNA, które powodują
zmianę aminokwasu. W pozycji 136 łańcucha polipeptydowego B jest
treonina, a w wariancie A — izoleucyna, natomiast w pozycji 148
wariant B

κ-kazeiny ma kwas asparaginowy, a wariant A — alaninę.

Molekularna identyfikacja alleli A i B metodą PCR-RFLP jest przedstawiona
w rozdziale: Zmienność cech.

Allel E

κ-kazeiny różni się od A i B podstawieniem A→G (seryna->glicyna

w pozycji 155 łańcucha polipeptydowego). Allel F powstał w wyniku
mutacji punktowej w allelu A, polegającej na tranzycji G

→A, której skutkiem

jest zmiana w pozycji 10 łańcucha polipeptydowego aminokwasu argininy
na histydynę. Podobnie allel G powstał wskutek tranzycji C

→T w allelu A,

powodującej zamianę argininy na cysteinę w pozycji 97 sekwencji amino-
kwasowej białka. Mutacje te tworzą miejsca restrykcyjne dla enzymów HhaI
i MaII, co stwarza możliwość molekularnej identyfikacji poszczególnych
alleli za pomocą metody PCR-RFLP.

Białko serwatkowe mleka bydła,

β-laktoglobulina, występuje w dwóch

wariantach A i B.

β-Laktoglobulina odgrywa rolę w odporności organizmu,

pobierana bowiem przez oseski z mlekiem matki chroni je przed infekcjami.
Mleko zawierające

β-laktoglobulinę B różni się od mleka z β-laktoglobulina

A większą zawartością suchej masy, tłuszczu i kazein oraz lepszą przydat-
nością technologiczną do produkcji serów. Podobnie jak w przypadku

κ-

kazeiny, znane są różnice w sekwencji aminokwasowej obu wariantów

β-

laktoglobuliny, wynikające z polimorfizmu genu kodującego to białko.
Białko

β-laktoglobuliny składa się z 162 aminokwasów. Różnica między

264

wariantem A i B polega na tym, że wariant A w pozycji 64 sekwencji
aminokwasowej zawiera kwas asparaginowy (GAT), natomiast wariant
B — glicynę (GGT). Z kolei w pozycji 118 w wariancie A jest walina (GTC),
zaś w B -- alanina (GCC). Zmiana zasady w kodonie 118 genu stwarza
miejsce restrykcyjne dla enzymu HaeIII (GG/CC) w allelu

β-laktoglobuliny

B. Zostało to wykorzystane w opracowanym teście PCR-RFLP, który także
jest już rutynowo stosowany.

W mleku kóz i owiec, podobnie jak bydła, są cztery frakcje białek.

Najbardziej polimorficzny jest gen kazeiny

u kóz (7 alleli — A, B, C, D,

E, F, O). O ile allele A, B, C i E różnią się między sobą kilkoma podstawieniami
aminokwasów, o tyle allele D i F wykazują znacznie większe różnice,
polegające na delecji odpowiednio 11 i 37 aminokwasów. W pozostałych loci
wykryto po 2 allele. Podobnie u owiec, z wyjątkiem locus P-laktoglobuliny
(chromosom 3p28), w którym są 3 allele, w loci kontrolującym główne białka
mleka występują po 2 allele.

11.5. Polimorfizm DNA

W jądrowym DNA zdecydowanie przeważają sekwencje niekodujące,
wśród których dużą przydatność dla potrzeb analizy genetycznej mają
sekwencje powtarzające się tandemowo. W połowie lat 80. opisano po
raz pierwszy sekwencje minisatelitarne. Ich cechą charakterystyczną jest
to, że długość podstawowego motywu powtarzającego się wynosi zazwyczaj
kilkanaście nukleotydów. Do najbardziej znanych sekwencji minisate-
litarnych należą: 33.5 (motyw podstawowy: GGGAGGTGGGCAGGAGG),
33.6 (motyw podstawowy: AGGGCTGGAGG) i 33.15 (motyw podstawowy:
AGAGGTGGGCAGGTGG). Sekwencje te występują w wielu miejscach (loci)
genomu, a w konkretnym locus może być różna liczba powtórzeń motywu
podstawowego. Jeśli strawiony enzymem restrykcyjnym i rozdzielony
elektroforętycznie DNA hybrydyzuje się z wyznakowaną radioaktywnie
sondą zawierającą sekwencję minisatelitarną, to na błonie radiograficznej
pojawia się układ prążków, który reprezentuje fragmenty DNA o różnej
długości. Fragmenty te pochodzą z wielu loci, a ich długość zależy od liczby
powtórzeń motywu podstawowego i także odległości, jaka dzieliła sekwencję
minisatelitarną od miejsca cięcia przez enzym restrykcyjny. Uzyskany układ
prążków, nazywany niekiedy „odciskiem palca" DNA (ang. DNA fingerprint),
przedstawia wysoce charakterystyczny obraz osobniczego DNA, który może
być wykorzystany m.in. do kontroli pochodzenia i identyfikacji śladów
biologicznych. Obok równoczesnej analizy wielu loci możliwe jest także
badanie polimorfizmu sekwencji minisatelitarnej w pojedynczym locus.
Badanie takie wymaga zastosowania sond o dużej specyficzności, to znaczy
zawierających nie tylko sekwencję minisatelitarną, ale także sekwencje ją
otaczające, oraz przeprowadzenia hybrydyzacji zgodnie z zaostrzoną proce-

265

durą (ang. high stringency). Z zebranych do tej pory informacji o wy-

stępowaniu sekwencji minisatelitarnych w różnych genomach wynika, że

ich loci są położone głównie w częściach telomerowych

chromosomów. Z tego względu ich przydatność w budowaniu

markerowych map genomo-wych jest ograniczona.

Wkrótce po odkryciu polimorfizmu sekwencji minisatelitarnych opisano

polimorfizm krótkich sekwencji, bo zawierających motyw podstawowy

długości kilku nukleotydów, także powtarzających się tandemowo. Zostały

one określone terminem sekwencji mikrosatelitarnych. Do tej pory najczęściej

opisywano dwu- (np. CA) lub czteronukleotydowe (np. CATA) motywy

podstawowe. Sekwencje mikrosatelitarne mogą występować jako proste

powtórzenia motywu podstawowego lub mogą mieć układ złożony, pole-

gający na tym, że powtórzenia motywu podstawowego są przedzielone

inną sekwencją — np. (CA)

AT(CA)

lub też sekwencja przedzielająca jest

otoczona różnymi powtarzającymi się motywami podstawowymi — np.

(GT)

GAT(AG)

. Wykrywanie polimorfizmu mikrosatelitarnego może być

prowadzone podobnie jak sekwencji minisatelitarnych, tzn. hybrydyzacji

z sondami i wówczas analiza dotyczy równocześnie wielu loci. Szczególne

jednak znaczenie zyskały sekwencje mikrosatelitarne w chwili, gdy za

pomocą techniki PCR, po rozpoznaniu sekwencji otaczających sekwencję

mikrosatelitarną, możliwe stało się analizowanie pojedynczych loci. Na

podstawie wiedzy o sekwencjach otaczających mikrosatelitę syntetyzowane

są oligonukleotydy pełniące funkcję starterów dla polimerazy DNA. Badanie

polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w pojedynczym locus polega na

amplifikacji techniką PCR specyficznych fragmentów, pochodzących z DNA

wyizolowanego od danego osobnika, a następnie określeniu ich długości za

pomocą klasycznej elektroforezy (np. żel poliakryloamidowy + barwienie

azotanem srebra) lub w automatycznym sekwenatorze DNA. Zależnie od

genotypu osobnika stwierdza się występowanie jednego fragmentu, w przy-

padku homozygoty, lub dwóch fragmentów — u heterozygoty (ryć. 11-3

wkładka kolorowa). Sekwencje mikrosatelitarne stały się najpowszechniej-

szym źródłem markerów genetycznych, dzięki wysokiemu polimorfizmowi

i równomiernemu rozproszeniu w genomie. Szacuje się, że w genomie

ssaków sekwencje takie występują co 6-10 tysięcy par nukleotydów. Warto

zaznaczyć, że sekwencje mikrosatelitarne mogą występować w intronach

(przykładem są geny apolipoproteiny A oraz B świni) lub nawet w eksonach

(gen kodujący huntingtynę u człowieka).

Wykrywanie polimorfizmu (markerów) DNA możliwe jest również

wówczas, gdy nie są znane ani sondy molekularne, ani sekwencje starterowe

umożliwiające amplifikację techniką PCR konkretnego, polimorficznego

fragmentu DNA. Jedną z częściej stosowanych procedur w takiej sytuacji

jest losowa amplifikacja polimorficznego DNA (ang. random amplified

polymorphic DNA — RAPD). Analiza tego typu polega na amplifikacji

nieznanych fragmentów DNA, za pomocą sekwencji starterowej o losowej

266

kombinacji nukleotydów (zazwyczaj składa się z 10 nukleotydów), w której
dominują nukleotydy C i G. Zamplifikowane fragmenty, reprezentujące
zazwyczaj różne  loci  w genomie, są poddawane elektroforezie, w wyniku
której uzyskuje się kilka prążków (fragmentów DNA różnej długości).
Badając grupę osobników można stwierdzić różnice w układzie prążków,
które są wynikiem mutacji punktowych tworzących lub znoszących miejsce
rozpoznawane przez losowy 10-nukleotydowy oligonukleotyd starterowy
dla reakcji PCR. Zidentyfikowanie takiego polimorficznego fragmentu
pozwala na dalszą jego analizę, w tym sekwencjonowanie. Po określeniu
sekwencji tego fragmentu możliwe staje się ograniczenie analizy genetycznej
do tego pojedynczego locus. W ten sposób identyfikuje się markery określane
skrótem SCAR (ang. seauence  characterized  amplified  region). Jeśli amp-
lifikowany fragment jest wystarczająco duży, to możliwe jest jego zlokalizo-
wanie w chromosomie (mapowanie fizyczne). Przykładem takiej procedury
jest identyfikacja polimorficznego markera RAPD, amplifikowanego przez
starter 5'-AGAATAGGC-3', charakterystycznego dla psów obciążonych
chorobą genetyczną — postępującym zanikiem siatkówki (ang. progressive
rod-cone degeneration). Polimorficzny fragment, wykryty za pomocą techniki
RAPD, został następnie molekularnie opisany, co doprowadziło do iden-
tyfikacji markera specyficznego SCAR, który zlokalizowano w chromosomie
9 u psa. Należy zaznaczyć,  że markery RAPD czy SCAR mogą zawierać
sekwencje kodujące lub niekodujące i dlatego ich jednoznaczna klasyfikacja
do kategorii markerów klasy I lub II jest trudna.

Badanie polimorfizmu DNA jest powszechnie stosowane także dla

markerów klasy I. Analiza taka opiera się najczęściej na wykrywaniu
polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), a także polimor-
fizmu konformacji jednoniciowych łańcuchów DNA (SSCP). Istotą obu
metod jest identyfikacja mutacji punktowych w obrębie genów. O metodach
tych napisano w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu.

Dynamiczny rozwój badań, których celem jest sekwencjonowanie geno-

mów różnych gatunków, zaowocował identyfikacją nowej klasy markerów
genetycznych, określanych symbolem SNP (ang. single nucleotide polymor-
phism). Polimorfizm ten związany jest z występowaniem pojedynczych
zmian sekwencji nukleotydów w homologicznych sekwencjach, np. allel
l - AATCGGC oraz allel 2 — AATGGGC. Mutacja punktowa prowadzi do
powstania miejsca polimorficznego typu SNP, jeśli każdy z alleli występuje
w populacji z częstością nie mniejszą niż 1%. Polimorfizm SNP wiąże się
zazwyczaj z obecnością w puli genowej populacji jedynie dwóch alleli.
Niewątpliwą zaletą polimorfizmu SNP jest jego powszechność w genomach
różnych gatunków. Na przykład, prace nad ustaleniem sekwencji DNA
genomu człowieka ujawniło co najmniej 1,4 mln miejsc SNP, spośród
których większość występuje poza strukturą genów. Wynika z tego, że te
proste podstawienie nukleotydów zazwyczaj ma charakter tzw. cichego
podstawienia, czyli nie wpływa na budowę polipetydu, ale może od-

267

działywać na ekspresję genu. Jednakże niektóre z tych podstawień mogą

wywoływać skutki fenotypowe. Ogromne nasycenie genomów markerami

SNP sprawia coraz powszechniejsze ich wykorzystywanie w analizie

genetycznej. Do identyfikacji alleli SNP może być przydatna technika RFLP

(jeśli mutacja zmienia sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny)

lub SSCP. Jednak identyfikacja wielu miejsc SNP wymaga odwołania się do

innych technik, w tym sekwencjonowania DNA. Polimorfizm na poziomie

sekwencji nukleotydów może być również związany z brakiem (delecja) lub

wstawieniem (insercja) jednego lub kilku nukleotydów. Tego typu markery

opisywane są terminem InDel (Insertion Deletion polymorphism) i mogą

mieć np. następujące formy: allel l — TCGAATGAATT (insercja AAT) i allel

2 — TCGGAATT (delecja AAT).

11.6. Wykorzystanie markerów genetycznych w

hodowli zwierząt

Markery genetyczne znajdują zastosowanie w pracy hodowlanej między

innymi w kontroli pochodzenia, ocenie wartości genetycznej zwierząt pod

kątem cech użytkowych i selekcji pośredniej, tzw. MAS (ang. marker

assisted selection), ocenie zmienności genetycznej wewnątrz i między

populacjami (liniami) oraz szacowaniu dystansu genetycznego. Informacje

o umiejscowieniu loci markerów genetycznych znajdują się w markerowych

mapach genomu (rozdział: Mapy genomowe).

Kontrola pochodzenia u zwierząt od wielu lat jest prowadzona na

podstawie układów grupowych krwi i polimorficznych białek, czyli mar-

kerów genetycznych klasy I. Podstawą tej kontroli jest to, że potomek

dziedziczy jeden allel z każdego locus od ojca, drugi od matki. Zatem

w przypadku grup krwi nie może on mieć antygenu erytrocytarnego,

którego nie stwierdzono u jednego z rodziców. Do kontroli pochodzenia

najlepsze są układy grupowe, w których występuje wiele antygenów,

u bydła są to układy B (40 antygenów), C (12 antygenów) oraz S (8 anty-

genów), u świń układy M (12 antygenów), E (17 antygenów) i L (12 anty-

genów), natomiast u koni układy A (7 antygenów), D (17 antygenów),

P (4 antygeny) i Q (3 antygeny). Przykład kontroli pochodzenia na podstawie

polimorfizmu antygenów erytrocytarnych oraz białek surowicy krwi i eryt-

rocytów przedstawiono w tabeli 11-V. Porównanie genotypów i fenotypów

źrebaka i klaczy wskazuje na to, że w fenotypie ojca musiały wystąpić

antygeny erytrocytarne A-a, D-cgm, P-ad i Q-b oraz typy białek TF-O,

ALB-A, ES-I, PHI-I. Warunków tych nie spełnia ogier l, można wykluczyć

jego ojcostwo. Spełnia je ogier 2, on zatem może być ojcem źrebięcia.

Ponieważ kontrola pochodzenia na podstawie polimorfizmu antygenów

erytrocytarnych (grup krwi) i polimorficznych białek surowicy krwi nie

zawsze stwarza możliwość jednoznacznego wskazania pary rodzicielskiej,

268

ostatnio coraz częściej są stosowane do tego celu markery genetyczne

klasy II (niekodujące sekwencje DNA). Daje to możliwość wykorzystania

znacznie bardziej precyzyjnych kryteriów analizy genetycznej. Można

wyróżnić dwie podstawowe metody stosowane do kontroli pochodzenia;

jedna jest oparta na polimorfizmie minisatelitarnym, druga na polimorfizmie

mikrosatelitarnym. Polimorfizm minisatelitarny jest podstawą metody „odcis-

ku palca" DNA. W metodzie tej strawiony (pocięty) enzymem restrykcyjnym

i rozdzielony elektroforetycznie DNA jest hybrydyzowany z sondą, którą jest

np. sekwencja minisatelitarna. Uzyskany obraz prążków jest charakterystycz-

ny dla danego osobnika, ale potomek otrzymuje od każdego z rodziców po

jednym prążku („allelu") danej sekwencji (ryć. 11-4). Prawdopodobieństwo

wystąpienia tego samego obrazu prążków u dwóch niespokrewnionych

osobników jest minimalne. Dokładność kontroli pochodzenia można zwięk-

szyć przez użycie w analizie kilku sond molekularnych.

W celu określenia prawdopodobieństwa wykluczenia pochodzenia

danego osobnika po danym rodzicu (-ach) stosowane są odpowiednie

wzory. W przypadku analizy polimorfizmu w jednym locus minisatelitarnym

u potomka i jednego z rodziców (nie zawsze dysponujemy pełnymi danymi

pochodzenia) prawdopodobieństwo wykluczenia obliczane jest ze wzoru:

Gdy dostępne są informacje dotyczące polimorfizmu minisatelitarnego

w DNA obojga rodziców i potomka, prawdopodobieństwo wykluczenia

obliczane jest ze wzoru:

269

badanych loci. Wzór na obliczanie tego prawdopodobieństwa ma tę sama

postać dla obu przypadków, dostępności informacji zarówno o jednym,

jak i obojgu rodzicach:

Druga metoda stosowana obecnie do kontroli pochodzenia wykorzystuje

polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych. W przypadku każdej sekwencji

mikrosatelitarnej potomek otrzymuje jeden allel od matki, drugi od ojca,

dokładnie tak, jak to jest przy cechach monogenowych — jakościowych.

Istnieje możliwość kontroli pochodzenia za pomocą PCR multipleks, w której

stosuje się kilka markerów równocześnie. Długość alleli (produktu PCR

— zamplifikowanych sekwencji mikrosatelitarnych) może być oznaczana za

pomocą automatycznego sekwenatora. Przykład kontroli pochodzenia na

podstawie sekwencji mikrosatelitarnej 2319 (powtórzenie 4-nukleotydowe)

u lisów, której długość określono metodą elektroforetycznego rozdziału

w żelu poliakryloamidowym barwionym azotanem srebra oraz za pomocą

automatycznego sekwenatora, przedstawiono na rycinie 11-5 (wkładka

kolorowa). Krzywe 1-5 obrazują genotypy szczeniąt (3-5) oraz ich do-

mniemanych rodziców — ojca (1) i matki (2). Ojciec jest homozygotą pod

względem allelu długości 235 pz, matka natomiast heterozygotą (jeden allel

- 243 pz, drugi — 263 pz). Wszystkie szczenięta są heterozygotami, przy

czym allel długości 235 pz odziedziczyły po ojcu. Dwa z nich otrzymały od

matki allel długości 243 pz, natomiast trzeci — allel 263 pz. Widoczny „pik"

przy długości 270 pz jest to marker wielkości fragmentu DNA, dodawany

do każdej próby DNA analizowanej za pomocą sekwenatora.

W ostatnich latach badacze coraz częściej zastanawiają się nad wy-

korzystaniem do kontroli pochodzenia polimorfizmu pojedynczych nu-

kleotydów, określanego symbolem SNPs (ang. single nucleotide poly-

morphisms). Polimorfizm ten jest wynikiem mutacji punktowych (zamiana

określonej zasady w danym nukleotydzie na inną). Przyczyną odchodzenia

od wykorzystywania sekwencji mikrosatelitarnych w kontroli pochodzenia

są głównie zachodzące w nich mutacje, których częstość szacuje się

na 10

-2

-10

-5

na pokolenie. Zaletą SNPs jest bardzo duża gęstość ich

rozmieszczenia w genomie (na przykład w genomie człowieka występują

one co ok. 1300 par zasad). Również to, że do identyfikacji genotypu

w przypadku polimorfizmu pojedynczych nukleotydów można zastosować

zdecydowanie więcej technik molekularnych niż do identyfikacji genotypu

w loci mikrosatelitarnych, sprawia, iż w niedalekiej przyszłości polimorfizm

pojedynczych nukleotydów zastąpi sekwencje mikrosatelitarne nie tylko

w kontroli pochodzenia, ale także w poszukiwaniach genów ważnych

z hodowlanego punktu widzenia, szacowaniu zmienności genetycznej

i dystansu genetycznego.

271

Badacze niemieccy wybrali na razie 60 SNPs do kontroli pochodzenia

u bydła holsztyńsko-fryzyjskiego, brunatnego szwajcarskiego i simentali.

Identyfikacji genotypu w loci tych markerów daje 99,99% prawdopodobień-

stwa wykluczenia.

Sekwencje mikrosatelitarne są bardzo pomocne w analizie genetycznego

tła cech ilościowych. Cechy użytkowe (ilościowe) są determinowane przez

wiele genów o małym efekcie każdego z nich, dlatego identyfikacja ekspresji

tych genów jest znacznie utrudniona. Prowadzone są badania w celu

znalezienia takich genów, które mają znaczący wpływ na kształtowanie się

cech użytkowych. Analiza asocjacji między markerami mikrosatelitarnymi

a cechami ilościowymi jest pierwszym krokiem do identyfikacji genów

„ważnych", czyli istotnych z hodowlanego punktu widzenia. Znając sprzę-

żenie między określonym markerem genetycznym a np. wydajnością białka

w mleku, można dla młodej jałówki określić, jaka będzie wartość tej cechy

w przyszłości. Wykorzystując markery mikrosatelitarne wykryto u bydła

kilka loci znajdujących się w różnych chromosomach, warunkujących cechy

użytkowości mlecznej (tab. 11-VI). U świń określono także regiony chromo-

somów sprzężone z cechami użytkowości mięsnej i rozpłodowej (tab. 11-VII).

Niektóre cechy użytkowe występują tylko u jednej płci lub nie można

ich zmierzyć przyżyciowe. Cechy takie mogą być doskonalone jedynie

poprzez selekcje pośrednią. Rozwój technik molekularnych przyczynił się

do opracowania metody selekcji pośredniej nazwanej MAS (ang. marker

assisted selection). W metodzie tej kryterium wyboru zwierzęcia jest jego

genotyp w locus markera genetycznego wykazującego asocjację z doskona-

loną cechą użytkową. Większość cech użytkowych o znaczeniu ekonomicz-

nym ujawnia się fenotypowo u zwierząt w określonym wieku (np. cechy

użytkowości mlecznej). W takim przypadku selekcja pośrednia (MAS) jest

znacznie bardziej intensywna i dokładna w porównaniu z selekcją tradycyj-

ną, a postęp genetyczny jest uzyskiwany w krótszym czasie. Wynika to

z możliwości określenia genotypu u bardzo młodych zwierząt.

Badania asocjacji markerów genetycznych z cechami ilościowymi zaowo-

cowały już wykryciem u większości gatunków zwierząt gospodarskich sporej

liczby loci genów ważnych, o istotnym wpływie na cechy użytkowe. Okazało

się, że niektóre geny oddziałujące na wartość cechy ilościowej mają ogromne

znaczenie. Geny takie nazwano głównymi lub genami o dużym efekcie.

Należą do nich między innymi geny warunkujące hipertrofię mięśniową

u bydła i owiec, zwiększoną plenność świń, zwiększoną płodność owiec oraz

geny białek mleka —

κ-kazeiny i β-laktoglobuliny (jest o nich mowa

w rozdziale: Zmienność cech). W przypadku tych cech jest już możliwa

selekcja bezpośrednia, której kryteriami są genotypy zwierząt w danych loci.

Markery genetyczne, głównie klasy II, są również pomocne w doskonaleniu

niektórych cech jakościowych. Przykładem tego jest wykorzystanie

markerów mikrosatelitarnych do identyfikacji obecności w genotypie hetero-

zygotycznym recesywnego allelu rogatości u bydła. Jest to cecha dziedzicząca

272

uszkodzenia tusz są przyczyną istotnych strat ekonomicznych w produkcji

żywca). Stosowany w stadach bydła mięsnego zabieg usuwania rogów

powoduje cierpienie zwierząt oraz zmniejszenie ich dziennych przyrostów,

ponadto jest zabiegiem kłopotliwym. Aby tego uniknąć, coraz więcej uwagi

poświęca się genetycznemu uwarunkowaniu bezrożności i możliwości

prowadzenia selekcji w tym kierunku. Dotychczas wiadomo jedynie, że

locus polled, kontrolujący bezrożność/rogatość u bydła, występuje w l chromo-

somie. Identyfikacja nosicieli genu p może być przeprowadzana za pomocą

analizy polimorfizmu sprzężonych z tym genem markerów genetycznych.

Znane są już dwie sekwencje mikrosatelitarne, sprzężone z locus polled,

które mogą być wykorzystane do tego celu.

Polimorfizm markerów genetycznych jest wykorzystywany w badaniach

nad odpornością/podatnością zwierząt na różne choroby i zaburzenia

genetyczne, dzięki czemu nosiciele niekorzystnych alleli mogą być wykrywa-

ni, zanim wystąpią objawy chorobowe. Szczególne znaczenie mają badania

związku między antygenami/genami głównego układu zgodności tkankowej

(MHC) a występowaniem chorób, zwłaszcza infekcyjnych. Zagadnienie to

jest opisane w rozdziale: Genetyczne podstawy odporności i oporności.

W badaniach z zakresu genetyki populacji znajdują zastosowanie zarówno

markery genetyczne klasy I, jak i klasy II. Zastosowanie frekwencji alleli

markerów genetycznych klasy I do szacowania zmienności genetycznej

wewnątrz i między populacjami omówione zostało w rozdziale: Podstawy

genetyki populacji. Znaczenie markerów genetycznych w hodowli zwierząt

podkreśla to, że są one wykorzystywane do analizy zmienności genetycznej

w ramach programów Światowej Strategii Zachowania Zasobów Genetycznych

Zwierząt Gospodarskich FAO (Global Strategy for the Farm Animal Genetic

Resources), w której są uwzględnione zasady międzynarodowego porozumie-

nia — Konwencji o Biologicznej Różnorodności. Zmienność genetyczna

w obrębie ras ginących lub uznanych za zagrożone jest określana na podstawie

polimorfizmu markerów genetycznych, przede wszystkim polimorfizmu

antygenów erytrocytarnych (grup krwi) i polimorfizmu DNA mikrosatelitarnego.

Markery genetyczne są także niezwykle przydatne w szacowaniu stopnia

zinbredowania (homozygotyczności) poszczególnych populacji (linii), w ana-

lizie podobieństw i różnic między populacjami i ustalaniu dystansu genetycz-

nego między nimi. Szacowanie dystansu genetycznego i wybór ras, które

cechuje duża zmienność genetyczna, służy zachowaniu biologicznej różno-

rodności zwierząt gospodarskich. Z kolei ocena zmienności genetycznej

między populacjami (liniami) ułatwia wybór optymalnego wariantu krzyżo-

wania, a w krzyżowaniu towarowym uzyskanie maksymalnego efektu

heterozji, ujawniającego się głównie zwiększeniem wydajności cech użyt-

kowych zwierząt. Charakterystyka wybranych markerów genetycznych

pozwala śledzić wpływ pracy selekcyjnej na strukturę genetyczną danej

populacji, jak określone geny ulegają eliminacji równolegle z eliminacją

cech niekorzystnych z hodowlanego punktu widzenia.

274

Rozdział

Mapy genomowe

Genom jest pojęciem określającym zbiór informacji genetycznej zawartej

w gamecie. Składa się na nią przede wszystkim DNA jądra komórkowego

oraz DNA występujący w mitochondriach (mtDNA). Ponieważ długość

cząsteczki mtDNA jest niezmiernie mała w porównaniu z DNA haploidal-

nego zestawu chromosomów, dlatego pojęcie genomu odnoszone jest do

DNA jądrowego. Genom może być opisany za pomocą kilku parametrów.

Po pierwsze, jest to haploidalna liczba chromosomów charakterystyczna dla

gatunku. Drugim parametrem jest łączna długość DNA występującego

w haploidalnym zestawie chromosomów. Wielkość ta zawiera się u ssaków

w przedziale między 2 a 3 miliardy par zasad. Wreszcie genom może być

opisany za pomocą całkowitej liczby loci genów. Przyjmuje się, że w genomie

ssaków występuje około 35 tysięcy genów. Odległości między sprzężonymi

ze sobą genami można wyrazić za pomocą jednostki względnej — centy-

morgana (cM), która odzwierciedla częstość zachodzenia crossing over

między loci sprzężonych genów. Całkowita długość genomu u ssaków,

wyrażona w cM, mieści się w przedziale od 1600 cM (mysz) do 3200 cM

(człowiek). U zwierząt gospodarskich wielkość ta oscyluje wokół 2500 cM.

Rozmieszczenie loci genów w genomie jest nierównomierne. Miejscami

silnie nasyconymi genami są regiony występujące na końcach ramion

chromosomowych. Tam też znacznie częściej zachodzi crossing over. Miejsca

te można wybarwić metodą barwienia prążkowego typu T.

12.1. Organizacja DNA jądrowego

W obrębie genomu występują zarówno sekwencje kodujące, czyli geny, jak

i sekwencje niekodujące. Zdecydowanie przeważają sekwencje niekodujące,

które stanowią około 97% całego DNA (ryć. 12-1). Sekwencje powtarzalne

275

dzieli się na dwie podstawowe grupy: a) sekwencje powtarzające się

tandemowo i b) elementy nukleotydowe. Cechą charakterystyczną sekwencji

powtarzających się tandemowo jest to, że dana sekwencja nukleotydów (układ

podstawowy) występuje w wielu miejscach genomu, ale w każdym z tych

miejsc (loci) sekwencja ta powtarza się wielokrotnie w układzie tandemowym

(jeden za drugim). Zależnie od długości układu podstawowego sekwencje

powtarzalne dzielone są na mikrosatelitarne (do 10 nukleotydów) i minisateli-

tarne (powyżej 10 nukleotydów). W genomie występują duże skupienia

sekwencji niekodujących w obrębie heterochromatyny konstytutywnej, którą

uwidocznia się metodą barwienia prążkami C. Niezależnie od tego, sekwencje

powtarzalne są rozproszone również w obszarach euchromatynowych.

Sekwencje mikrosatelitarne okazały się bardzo bogatym źródłem wysoce

polimorficznych markerów genetycznych. Szacuje się, że w genomie ludzkim

sekwencje te pojawiają się przeciętnie co kilka tysięcy par zasad. Oznacza

to, że genom jest bardzo silnie nimi nasycony. Szczególnie cenne, z punktu

widzenia przydatności tych sekwencji do analizy genetycznej, jest to, że

liczba powtórzeń danego układu podstawowego wykazuje w obrębie

276

populacji silne zróżnicowanie. Inaczej mówiąc, dla danego locus funkcjonują
niejednokrotnie długie serie alleli wielokrotnych, które różnią się między
sobą liczbą powtórzeń podstawowego układu nukleotydów. Szczególnym
przykładem sekwencji mikrosatelitarnych ze względu na funkcję biologiczną,
jest sekwencja telomerowa (TTAGGG/AATCCC), która stanowi zakończenia
ramion chromosomowych. Funkcją biologiczną tych sekwencji jest ochrona
zakończeń chromosomów przed degradacją podczas kolejnych replikacji.
Skróceniu ulegają właśnie sekwencje telomerowe. Na chromosomach ludz-
kich każdy telomer zawiera od 250 do 1500 powtórzeń tej sekwencji.

W przypadku sekwencji minisatelitarnych stopień równomierności

rozproszenia w genomie jest mniejszy. Zazwyczaj są one zlokalizowane
w częściach dystalnych — tzn. w pobliżu końców ramion chromosomów.

Elementy nukleotydowe to takie sekwencje, które również są rozproszone

w wielu miejscach genomu, ale w danym miejscu występuje tylko jedna
kopia sekwencji. Podobnie jak poprzednio, sekwencje te dzieli się na dwie
grupy zależnie od ich długości: a) SINE (short interspersed nucleotide
element), których długość mieści się poniżej 500 pz oraz b) LINE (long
interspersed nucleotide element), których długość jest powyżej 500 pz i może
dochodzić do kilku tysięcy pz. Przykładem elementu nukleotydowego z gru-
py SINE jest rodzina sekwencji Alu, której nazwa pochodzi od enzymu
restrykcyjnego mającego miejsce cięcia cząsteczki DNA w obrębie tej sekwen-
cji. Sekwencje te bardzo często są zlokalizowane w okolicach centromerów.

Funkcja sekwencji powtarzalnych, z wyjątkiem sekwencji telomerowych,

jest do tej pory słabo rozpoznana. Przy okazji badań molekularnych
kompleksów synaptonemalnych okazało się, że sekwencje te, podobnie jak
elementy nukleotydowe, leżą w pobliżu białkowych struktur kompleksów.
Może to świadczyć o roli tych sekwencji w kotwiczeniu domen pędowych
DNA w strukturze białkowej kompleksu synaptonemalnego.

Organizacja chromatyny w jądrze interfazowym charakteryzuje się pew-

nymi szczególnymi cechami. Wiadomo, że utrzymywana jest w nim nukleo-
somowa organizacja nici chromatynowej. Poszczególne chromosomy zajmują
w jądrze wyodrębnione domeny, przy czym domeny chromosomów homolo-
gicznych zazwyczaj nie kontaktują się ze sobą. Z kolei części chromosomów
zbudowane z heterochromatyny konstytutywnej pozostają mocniej skonden-
sowane i niejednokrotnie wykazują tendencje do tworzenia chromocentrów,
w których asocjuje heterochromatyna z kilku chromosomów.

12.2. Organizacja DNA mitochondrialnego

Badania na zwierzętach i roślinach przyczyniły się do wykrycia obecności
informacji DNA poza jądrem komórkowym — w mitochondriach (u
roślin i zwierząt) i chloroplastach (u roślin).

277

Mitochondria należą do organelli komórkowych przekształcających ener-

gię. W nich odbywa się większość reakcji oddychania komórkowego. Niektóre

białka uczestniczące w oddychaniu nie mogą przechodzić przez błony

organelli, zatem muszą być syntetyzowane wewnątrz mitochondriów. Infor-

macja o składzie aminokwasowym tych białek jest zapisana w mitochondrial-

nym DNA. Wiadomo już, że mitochondrialny DNA (mtDNA) koduje białka

będące składnikami mitochondrialnego łańcucha oddechowego i systemu

fosforylacji oksydacyjnej (ang. oxidative phosphorylation — OXPHOS), poza

tym 2 rodzaje rRNA i 22 rodzaje tRNA. Całkowita liczba genów w ludzkim

mtDNA wynosi 37. Geny kodujące białka i rRNA są od siebie oddzielone

genami kodującymi tRNA. Białka będące podjednostkami enzymów łańcucha

oddechowego (np. ubichinon/koenzym Q, cytochrom c czy oksydoreduktaza)

należą do pięciu kompleksów oznaczonych cyframi rzymskimi I-V, przy czym

kompleks V jest to syntaza ATP. Większość białek wchodzących w skład tych

kompleksów jest kodowana przez DNA jądrowy, a tylko część przez mtDNA.

Porównanie liczby podjednostek białkowych kodowanych przez DNA mito-

chondrialny i jądrowy zawiera poniższe zestawienie.

Struktura mtDNA jest inna niż DNA jądrowego, mtDNA jest bowiem

kolisty. Jego długość wynosi około 16 tysięcy par zasad. Większość komórek

zawiera od tysiąca do 10 tyś. kopii mtDNA. Jedynie w oocytach II rzędu liczba

kopii jest wyraźnie większa i sięga około 100 tyś. Zwielokrotnienie liczby kopii

w oocycie jest częścią przygotowań tej komórki do podołania przez zygotę

wymaganiom energetycznym związanym z wczesnym rozwojem zarodka lub

zapewnieniem wystarczającej liczby kopii mtDNA dla pierwszych blastome-

rów zarodka, w których być może replikacja mtDNA nie zachodzi.

278

DNA występujący w mitochondriach nie jest powiązany z białkami,

w odróżnieniu od DNA jądrowego. Prawie cały mtDNA zawiera sekwen-

cje kodujące, a sekwencje powtarzające się tandemowo są reprezentowane

bardzo nielicznie. Kolejną cechą charakterystyczną mtDNA jest to, że geny

mitochondrialne nie zawierają intronów, co więcej, transkrypcji podlegają

obie nici kolistego DNA, a niektóre geny nawet nakładają się na siebie.

Łańcuchy komplementarne, wchodzące w skład cząsteczki mtDNA, różnią

się udziałem nukleotydów i dlatego wyodrębnia się łańcuch ciężki (H),

który ma większy udział nukleotydów guanylowych — G i tymidylo-

wych - T niż łańcuch lekki (L). Na łańcuchu ciężkim występuje 12

genów kodujących białka oraz 14 genów kodujących cząsteczki tRNA

i 2 geny kodujące rRNA, a na łańcuchu lekkim umiejscowiony jest tylko

jeden gen kodujący białko i 8 genów kodujących cząsteczki tRNA.

W strukturze łańcucha ciężkiego wyróżnia się również pętlę D, w której

obrębie występuje potrójna struktura DNA, uformowana przez krótki

fragment nowego łańcucha H, pozostający w asocjacji z cząsteczką

macierzystą. W mtDNA występuje jedno miejsce inicjujące transkrypcję,

która przebiega równocześnie, ale w przeciwnych kierunkach, na obu

łańcuchach. Rola i zachowanie się mtDNA w dziedziczeniu pozajądrowym

opisane są w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech.

12.3. Markerowa mapa genomu

Wiedza o lokalizacji genów oraz sekwencji niekodujących w DNA jądrowym

jest bardzo słabo rozwinięta w porównaniu z wiedzą o mapie mtDNA.

Dlatego w dalszej części tego rozdziału będą omówione zagadnienia

związane z poznawaniem (mapowaniem) DNA jądrowego, który stanowi

dominującą część genomu.

Markerowa mapa genomu jest zbiorem informacji o:

a) położeniu loci sekwencji kodujących, tzn. genów (markery klasy

I),

i niekodujących, czyli tandemowo powtarzających się sekwencji anonimo

wych (markery klasy II) w chromosomach,

b) stopniu polimorfizmu w obrębie znanych loci (wykaz alleli),

c) odległościach genetycznych, wyrażonych w cM, pomiędzy sprzężo

nymi loci oraz ich uszeregowaniu.

Mapa, która wskazuje położenia loci w chromosomach, nazywa się

cytogenetyczną lub fizyczną mapą genomu. Z kolei mapa opisująca sprzę-

żenia, uszeregowanie i odległości genetyczne pomiędzy takimi loci określana

jest terminem genetycznej lub sprzężeniowej mapy genomu. Ponieważ

mapy genomowe budowane są przede wszystkim na bazie polimorficznych

markerów genetycznych, dlatego niejednokrotnie mówi się o markerowej

mapie genomu.

279

12.3.1. Fizyczna mapa genomu

Podstawową, ale nie jedyną, metodą mapowania fizycznego jest hybrydyzacja

in situ pomiędzy zdenaturowaną i wyznakowaną sondą DNA a zdenaturowa-

nymi chromosomami metafazowymi utrwalonymi na preparacie mikroskopo-

wym. Sonda jest to sklonowana molekularnie sekwencja nukleotydowa,

reprezentująca gen (lub jego część) bądź fragment DNA obejmujący niekodują-

cą sekwencję, na przykład mikrosatelitę — marker klasy II. Często sondę

stanowi tzw. cDNA (komplementarny DNA) genu. Jest to taka sekwencja

nukleotydowa, która powstała na drodze syntezy DNA z udziałem enzymu

odwrotnej transkryptazy na bazie wyizolowanego mRNA. Tak utworzony

cDNA jest wbudowywany do wektorów i klonowany. Różnica między DNA

genu a jego cDNA polega na tym, że w cDNA nie występują introny, ponieważ

w mRNA, na bazie którego syntetyzowano cDNA, sekwencje intronowe

zostały już wcześniej wycięte podczas obróbki potranskrypcyjnej (ang.

280

Ryć. 12-3. Lokalizacja markera mikrosatelitarnego ZuBeCa4 metodą fluorescencyjnej

hybrydyzacji in situ (ang. FISH) na chromosomie 3 psa; (a) chromosomy barwione

metodą prążków Q; (b) ta sama metafaza po hybrydyzacji; jasne punkty wskazują

miejsce, gdzie sonda hybrydyzowała z DNA chromosomu

splicing). Schemat mapowania genów metodą hybrydyzacji in situ jest

przedstawiony na rycinie 12-2. Trzeba podkreślić, że do identyfikacji chromo-

somu, zgodnie z przyjętym wzorcem kariotypu, wykorzystuje się techniki

prążkowego barwienia (G, Q lub R), które stosuje się albo przed hybrydyzacją,

albo po hybrydyzacji. Miejsce, w którym sonda połączy się z DNA chromo-

somu, jest rozpoznawane przez obserwację mikroskopową, dzięki wyzna-

kowaniu sondy pierwiastkiem promieniotwórczym lub analogiem jednego

z nukleotydów, związanego z barwnikiem fluorescencyjnym (ryć. 12-3).

Hybrydyzacją in situ ma wiele odmian, które w ostatnim czasie są szeroko

wykorzystywane do opisu genomu zwierząt. Warto wspomnieć o dwóch:

tzw. malowaniu chromosomów (ang. chromosome painting) i mapowaniu

na chromatynie jąder interfazowych.

Malowanie chromosomów polega na zastosowaniu sondy, która zawiera

unikatowe sekwencje DNA wybranego chromosomu. Pierwszym etapem

prowadzącym do uzyskania takiej sondy jest pozyskanie jednorodnej frakcji

wybranego chromosomu na drodze ich sortowania w cytometrze prze-

pływowym lub mikrodysekcji przeprowadzonej za pomocą mikromanipu-

latora na preparacie mikroskopowym. Kolejnym etapem jest amplifikacja

(metoda PCR) lub klonowanie molekularne fragmentów DNA tego chromo-

somu. W trakcie amplifikacji blokowane są sekwencje powtarzalne i dzięki

temu następuje zwielokrotnienie unikatowych sekwencji nukleotydowych

danego chromosomu. Przeprowadzenie hybrydyzacji in situ z użyciem

takiej sondy daje efekt w postaci sygnału (np. świecenie barwnika flurescen-

cyjnego związanego z sondą) na obszarze całego chromosomu (ryć. 12-4

wkładka kolorowa). Stosowanie techniki malowania chromosomów umoż-

liwia detekcję mutacji genomowych (głównie aneuploidii) i chromosomo-

wych. Podejście takie jest alternatywne w stosunku do klasycznej procedury

opartej na identyfikacji chromosomów za pomocą barwień prążkowych.

Ponadto, technika ta wykorzystywana jest do identyfikacji homologii między

chromosomami różnych gatunków. Analizę taką określa się terminem

porównawczego malowania chromosomów (ang. comparative chromosome

281

zaznaczyć, że metoda malowania chromosomów ma ograniczoną dokładność,

przyjmuje się bowiem, że sonda chromosomowo specyficzna da widoczny

sygnał, jeżeli obejmuje segment długości co najmniej kilku milionów par zasad.

Dużą rolę w postępie mapowania genomów odegrała metoda hyb-

rydyzacji komórek somatycznych. Polega ona na tym, że w warunkach

in vitro doprowadza się do połączenia komórek pochodzących od dwóch

różnych gatunków, np. mysich komórek nowotworowych, utrzymywanych

w hodowli, z fibroblastami pochodzącymi z mięśni czy skóry bydła. Komórki

takie po połączeniu powinny mieć liczbę chromosomów odpowiadającą

sumie liczb diploidalnych u obu gatunków, czyli 40 (mysz) plus 60 (bydło)

daje 100 chromosomów. Okazuje się jednak, że jeżeli takie komórki są

hodowane w warunkach in vitro, to stopniowo „gubione" są chromosomy,

które nie pochodzą z komórek nowotworowych. W tym przypadku są to

chromosomy bydła. W rezultacie można wyprowadzić klony (komórki

będące potomstwem jednej wyjściowej komórki), które będą się między

sobą różniły liczbą zachowanych chromosomów bydła. Liczba zachowanych

chromosomów zazwyczaj jest rzędu kilku, ale czasami może się zdarzyć tak,

że tylko pojedyncze chromosomy bydła zostaną zachowane w danym

klonie komórkowym. Tak wyprowadzone klony poddawane są analizie

elektroforetycznej, której celem jest identyfikacja białek lub markerów DNA

typowych dla komórek gatunku, którego genom jest badany — w tym

przykładzie są to komórki bydlęce. Objęcie badaniami dużej liczby klonów

stwarza możliwość wykrycia w komórkach hybrydowych loci, które zawsze

pojawiają się razem. Sytuacja taka świadczy o tym, że grupa tych loci jest

położona w tym samym chromosomie. Loci takie nazywa się syntenicznymi.

0 ich umiejscowieniu wiadomo jedynie tyle, że są położone w jednym

chromosomie. Nie można natomiast wskazać, który jest to chromosom

1 w jakim regionie mieszczą się badane loci, nieznana pozostaje również

wzajemna odległość między nimi. Lokalizacja chromosomowa grup syn-

tenicznych wymaga przeprowadzenia badań cytogenetycznych, których

celem jest identyfikacja chromosomu (-ów) gatunku mapowanego w danym

klonie hybrydowym.

Do techniki uzyskiwania hybrydowych linii komórek somatycznych

została ostatnio wprowadzona istotna modyfikacja. Polega ona na pod-

dawaniu komórek gatunku mapowanego, przed hybrydyzowaniem z komór-

kami nośnikowymi (np. komórki nowotworowe myszy), naświetlaniu

promieniami jonizującymi. Efektem naświetlania jest powstanie licznych

pęknięć cząsteczek DNA, a zatem fragmentacja chromosomów. Komórki

z pofragmentowanymi chromosomami poddawane są hybrydyzacji, podczas

której dochodzi do fuzji fragmentów chromosomowych z chromosomami

komórek nośnikowych. W ten sposób w komórkach hybrydowych za-

chowane są fragmenty chromosomów gatunku mapowanego. Na przykład,

naświetlanie fibroblastów psa promieniowaniem o dawce 5000 radów dało

fragmenty o średniej wielkości około 16,6 milionów par zasad, a w każdej

283

z uzyskanych linii hybrydowych zachowane fragmenty chromosomowe

stanowiły około 20% genomu psa. Tak zmodyfikowaną technikę hybrydyzacji

komórek somatycznych określa się terminem mapowania radiacyjnego.

Zaletą tej techniki mapowania jest możliwość identyfikacji loci markerowych

położonych bardzo blisko siebie, na tyle blisko, że klasyczne mapowanie

sprzężeniowe nie pozwala na określenie odległości genetycznej, ze względu

na zbyt małe prawdopodobieństwo zajścia crossing over. Dotyczy to

szczególnie loci o niskim stopniu polimorfizmu, w takim przypadku bowiem

analiza segregacji alleli (mapowanie genetyczne) jest nieefektywna. Dawki

promieniowania jonizującego, wykorzystywane w mapowaniu radiacyjnym,

wynoszą zazwyczaj 5 tyś., 7 tyś. lub 12 tyś. radów. Wielkość uzyskiwanych

fragmentów chromosomowych zależy od dawki promieniowania jonizują-

cego — czym większa dawka, tym mniejsze fragmenty. Uzyskiwanie

małych fragmentów chromosomowych zwiększa rozdzielczość mapowania,

przez którą rozumie się najmniejszą odległość między loci sąsiednich

markerów możliwą do wykrycia.

12.3.2. Genetyczna mapa genomu

Analiza segregacji alleli w loci markerowych, u potomstwa osobników

o znanych genotypach, służy tworzeniu genetycznej mapy genomu. Kolej-

ność postępowania jest następująca. Najpierw poszukuje się sprzężeń

pomiędzy loci. Dalej, na podstawie liczby zidentyfikowanych rekombinantów

szacuje się odległości genetyczne (cM) między sprzężonymi loci, które

odzwierciedlają częstość, z jaką zachodziło crossing over między nimi

podczas gametogenezy u rodziców. Poznanie wzajemnych odległości między

sprzężonymi loci stwarza warunki do poznania ich uszeregowania, w czym

pomocne może być przeanalizowanie rodzin z równoczesnym uwzględ-

nieniem trzech loci (tzw. krzyżówka trójpunktowa). Jednostką odległości

genetycznej jest l cM. Odległość taka oznacza, że crossing over między

dwoma sprzężonymi loci zachodzi jeden raz na sto podziałów mejotycznych.

Do wykrywania sprzężeń jest stosowana powszechnie funkcja zwana

logarytmem ilorazu wiarogodności (ang. loci).

L - - funkcja wiarogodności, obliczana jako prawdopodobieństwo wy-

stąpienia określonych genotypów, przy założonym współczynniku

rekombinacji (r), względem hipotezy alternatywnej, przyjmującej

niezależne dziedziczenie (r = 0,5)

r - - współczynnik rekombinacji, zawierający się w przedziale (0; 0,5)

Badanie sprzężenia dokonuje się poprzez analizę segregacji genów

w dwóch loci. W tym celu korzysta się z wiedzy o genotypach osobników

284

należących do rodzin co najmniej dwupokoleniowych. Jednak nie wszystkie
kojarzenia są informatywne. Jeżeli oboje rodzice są homozygotami w obu
loci, to oczywiście identyfikacja segregantów jest niemożliwa. Z kolei, jeżeli
oboje rodzice są heterozygotami o identycznych allelach, to niemożliwe jest
ustalenie fazy (cis lub trans), w jakiej allele analizowanych loci występują
u rodziców. Tego typu kojarzenie też nie jest informatywne. Wynika z tego,
że informatywne są kojarzenia typu podwójna heterozygota z podwójną
homozygotą lub kojarzenie między heterozygotami, u których w badanych
loci  występują różne ałlele. Obliczenie wartości  loci  przeprowadza się
dla z góry założonych wartości współczynnika rekombinacji (r), mniejszych
niż 0,5. Jeżeli wartość  loci,  dla niektórych wielkości współczynnika
rekombinacji, będzie większa niż 3,0, to oznacza, że analizowane loci  są ze
sobą sprzężone. Największą wartość  loci  przewyższającą 3,0 uznaje się za
oszacowanie współczynnika  r,  czyli częstości, z jaką dochodzi do
rekombinacji między analizowanymi loci.  Wartość  loci  mniejsza niż —2
oznacza,  że dla testowanej wartości współczynnika  r  nie stwierdza się
sprzężenia między analizowanymi loci. Natomiast wartości z przedziału ( — 2;
3) nie pozwalają na wyciągnięcie jednoznacznego wniosku dotyczącego
sprzężenia, czyli analizowany materiał rodzinowy był zbyt mały lub loci były
ze sobą na tyle słabo sprzężone, że zachowują się tak jakby się dziedziczyły
niezależnie. Badanie sprzężenia polega na wyliczaniu wartości  loci  dla
kolejnych wielkości współczynnika  r  (np. 0,1; 0,2; 0,3; 0,4). Jeśli dla
wszystkich testowanych wielkości współczynnika r wartość loci jest mniejsza
niż —2,0, to można przyjąć,  że badane geny nie są ze sobą sprzężone.
Pojawienie się wartości  loci  powyżej 3,0 dowodzi, że geny są ze sobą
sprzężone i równocześnie poznajemy współczynnik  r.  Jeśli wartość  loci
mieści się między —2,0 i 3,0, to należy zwiększyć liczbę badanych rodzin, tak
aby dojść do wiążących wniosków. Po ustaleniu, że  loci  są ze sobą
sprzężone, można przystąpić do oszacowania odległości genetycznej między
nimi. W tym celu wykorzystywana jest tzw. funkcja Kosambiego (x),  która
wyraża odległości genetyczne między sprzężonymi loci w centymorganach
(cM).

r - - oszacowana częstość rekombinacji między analizowanymi loci

Funkcja ta uwzględnia dwie okoliczności wpływające na częstość

identyfikowanych zjawisk crossing over. Po pierwsze, bierze pod uwagę to,
że identyfikacja rekombinantów w potomstwie pozwala na wykrycie tylko
nieparzystych przypadków crossing over, parzysta ich liczba bowiem nie
zmienia układu alleli w chromatydzie i tym samym nie pojawiają się
w potomstwie osobniki o zrekombinowanym układzie alleli. Po drugie,
brane jest pod uwagę zjawisko interferencji, polegające na tym, że zajście
crossing over w danym miejscu wpływa ograniczająco na możliwość

285

powtórnego wystąpienia crossing over w pobliżu. Należy podkreślić, że do

obliczania funkcji loci oraz funkcji Kosambiego opracowano programy

komputerowe.

Wyniki badań nad częstością crossing over ujawniły ciekawą zależność

polegającą na tym, że długość genetyczna chromosomu, szacowana na

podstawie rekombinacji zachodzącej w gametogenezie żeńskiej, jest za-

zwyczaj większa, aniżeli w przypadku gdy podstawą takiego oszacowania

były rekombinacje zachodzące podczas spermatogenezy (ryć. 12-5). Można

zatem sądzić, że w oogenezie crossing over zachodzi częściej aniżeli

w spermatogenezie. Brak jest jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, dlaczego

tak jest. Być może prawidłowość ta wynika ze specyfiki spermatogenezy,

podczas której jest wytwarzanych nieporównanie więcej gamet niż podczas

oogenezy i dlatego żeńska rekombinacja wewnątrzchromatydowa (crossing

286

over) zachodzi z większym nasileniem, aby dorównać ogromnej zmienności

genetycznej wśród plemników. Trzeba też pamiętać, że chiazmy utrzymują

strukturę biwalentu w oocycie przez znacznie dłuższy czas niż w sper-

ma tocy cię.

Należy również podkreślić, że odległości genetycznej (cM) między

sprzężonymi loci nie można w bezpośredni sposób przeliczać na odległości

fizyczne, mierzone np. liczbą par zasad, jaka je dzieli. Przyjmuje się

z dużym przybliżeniem, że odległość 1 cM odpowiada długości cząsteczki

DNA, liczącej około jednego miliona par zasad. Brak prostej zależności

między odległością względną i bezwględną wynika z tego, że losowość

zachodzenia crossing over jest ograniczona tym, iż w chromosomie są

obszary, gdzie zachodzi ono znamiennie częściej (prążki T), oraz takie, gdzie

zdarza się bardzo rzadko (heterochromatyna konstytutywna).

12.3.3. Strategia mapowania genomu

Markerowa mapa genomu powinna charakteryzować się kilkoma cechami,

które wyznaczają jej wartość poznawczą i aplikacyjną. Po pierwsze, markery

genetyczne powinny być możliwie wysoce polimorficzne, tzn. w puli

genowej populacji powinna występować możliwie długa seria alleli wielo-

krotnych. Wykrycie w drugiej połowie lat 80. wysoce polimorficznych

sekwencji anonimowych typu mini- i mikrosatelitarnego spowodowało, że

markery zostały podzielone na dwie klasy. Do klasy I zostały zaliczone

klasyczne markery genetyczne (sekwencje kodujące, czyli geny). Polimorfizm

tych markerów identyfikowany jest na poziomie produktu, za pomocą

metod serologicznych — układy grupowe krwi, antygeny głównego układu

zgodności tkankowej itd. lub elektroforezy — polimorficzne białka surowicy

krwi, mleka itd. Możliwe jest również wykrywanie polimorfizmu tych

markerów poprzez badanie polimorfizmu DNA tych genów metodami

opartymi na elektroforezie (RFLP i SSCP). W grupie markerów klasy II

znalazły się wszystkie rodzaje polimorfizmu związane z niekodującymi

sekwencjami nukleotydowymi, a wśród nich główną rolę odgrywają sek-

wencje mikrosatelitarne. Metody analizy ich polimorfizmu opisano w roz-

dziale: Markery genetyczne.

Ważną cechą mapy genomu jest równomierność rozproszenia loci

markerowych. Początkowo zakładano, że stopień równomierności powinien

być taki, aby maksymalna odległość genetyczna między dwoma dowolnymi

sąsiednimi loci nie przekraczała 20 cM. Spełnienie tego warunku stwarza

sytuację, w której dowolny locus genu znajduje się w odległości nie większej

niż 10 cM od jakiegoś markera. Odległość taka pozwala zidentyfikować

położenie dowolnego genu, gdy w badaniach rodzinowych analizowane loci

markerowe byłyby rozproszone równomiernie w całym genomie, a gen

będący obiektem zainteresowania byłby reprezentowany w analizowanej

287

rodzinie przez więcej niż jeden allel. Obecnie stopień nasycenia map

genomowych podstawowych gatunków zwierząt gospodarskich jest znacznie

większy i w przypadku bydła oraz świń kształtuje się poniżej poziomu 3 cM.

Kolejną istotną cechą mapy genomu jest informatywność jej mapy

fizycznej. Zakłada się, że na każdym ramieniu chromosomu powinny być

zlokalizowane co najmniej dwa markery, jeden w pobliżu centromeru

(marker proksymalny), a drugi w końcowej części ramienia (marker

dystalny). Spełnienie tego kryterium dowodzi, że na obszarze całego genomu

zostały zlokalizowane markery genetyczne. Ostatecznym celem programów

budowania map genomowych jest stworzenie zintegrowanej mapy, tzn.

takiej, w której wszystkie grupy genów sprzężonych oraz syntenicznych mają

znaną lokalizację chromosomową. Taka mapa może być przedmiotem

porównania z najbardziej rozwiniętymi mapami, do których zalicza się mapę

genomu człowieka i myszy. Porównanie to odnosi się przede wszystkim do

lokalizacji tzw. loci zakotwiczonych (ang. anchor loci). Należą one do

markerów klasy I, o których wiadomo, że są równomiernie rozproszone

w genomie człowieka, myszy, kota i bydła. Z przeprowadzonych badań

porównawczych wynika, że w genomach tych gatunków odległości między

dwoma dowolnymi loci zakotwiczonymi mieszczą się w granicach od 5 do 10

cM. Przyjmuje się, że ich lokalizacja odzwierciedla obszary konserwatywne

pod względem ewolucyjnym. Konserwatyzm genetyczny jest równie często

wykorzystywany w mapowaniu fizycznym markerów klasy I. Polega to na

tym, że sondy molekularne uzyskane na bazie genomu jednego gatunku są

przydatne do mapowania tegoż genu w genomie innego gatunku.

Spełnienie podstawowych warunków dotyczących nasycenia mapy

fizycznej i genetycznej genomu oznacza, że w przypadku genomu gatunków

ssaków, których wielkość wynosi około 2500 cM, minimalna liczba równo-

miernie rozproszonych (na poziomie 20 cM) polimorficznych markerów

genetycznych wynosi około 120. Oczywiście jest to rozważanie czysto

teoretyczne, ponieważ przystępując do mapowania kolejnych markerów

nie można przewidzieć, w którym miejscu mogą one mieć swoje loci. Może

się zdarzyć tak, że wiele takich markerów zostanie zlokalizowanych

w niewielu tylko chromosomach, lub wręcz w niektórych ich regionach.

Wynika z tego wniosek, że osiągnięcie stanu równomiernego nasycenia

mapy markerami genetycznymi wymaga zmapowania o wiele większej

liczby loci, niżby to wynikało z teoretycznego wyliczenia.

Wysiłkom skierowanym na tworzenie mapy markerowej towarzyszą

prace, których celem jest identyfikacja genów kontrolujących cechy użytkowe

zwierząt lub istotnie na nie wpływających. Osiągnięcie tego celu wymaga

skrupulatnych obserwacji zmienności fenotypowej interesującej cechy w tzw.

rodzinach referencyjnych. Są to zazwyczaj trzypokoleniowe rodziny, w któ-

rych rodzice wywodzą się z odległych genetycznie ras lub nawet blisko

spokrewnionych gatunków (np. świnia domowa i świnia dzika lub bydło

domowe i bydło zebu). Duży dystans genetyczny (patrz rozdział: Podstawy

288

genetyki populacji) wskazuje, że pule genowe tych ras są inne zarówno ze

względu na występowanie w populacjach różnych alleli dla danego locus,

jak i różnic we frekwencji tych samych alleli. Zróżnicowanie to dotyczy tak

loci markerowych, jak i loci genów wpływających na kształtowanie się cech

będących obiektem zinteresowania hodowcy. Skrzyżowanie tak dobranych

rodziców daje wysoce heterozygotyczne pokolenie F

, które jest kojarzone

między sobą w celu uzyskania pokolenia F

. W pokoleniu F

analizuje się

odległości genetyczne między markerami oraz asocjacje między markerami

i cechami użytkowymi, będącymi obiektem zainteresowania hodowców.

Zbudowanie markerowej mapy genomowej, która mogłaby być użytecz-

nym narzędziem służącym do identyfikacji genów kontrolujących ważne

cechy użytkowe, jest zadaniem wymagającym współpracy specjalistów

z wielu dziedzin, takich jak: genetyka molekularna, immunogenetyka,

cytogenetyka czy biometria. Przekracza to zatem możliwości pojedynczych

zespołów badawczych. Na początku lat 90. zostały utworzone między-

narodowe programy badawcze. Jako pierwszy powstał program Mapowania

Genomu Świni - - PiGMaP. W przedsięwzięcie to zostało włączonych

kilkanaście laboratoriów, wywodzących się z państw Wspólnoty Europejskiej.

Rok później, na podobnych zasadach, powołano Program Mapowania

Genomu Bydła — BovMap. W tym programie zarejestrowano udział ponad

dwudziestu laboratoriów. Oprócz tych dwóch wiodących programów

rozwijały się inne międzynarodowe przedsięwzięcia, zmierzające do stwo-

rzenie mapy genomu kury, konia, owcy, kozy czy psa (DogMap). W nie-

których programach biorą udział również polskie laboratoria (mapa genomu

konia i psa, a także świni). Ponadto, powstało wiele przedsięwzięć realizo-

wanych przez laboratoria jednego kraju. Na przykład, w Polsce prowadzono

badania w ramach Polskiego Projektu Mapowania Genomu Świni, który był

realizowany w ramach współpracy między trzema zespołami badawczymi.

Głównym celem tego projektu było poszukiwanie genów głównych, od-

działujących istotnie na kształtowanie cech związanych z tuczem i użyt-

kowością rzeźną.

12.3.4. Aktualny stan map genomowych zwierząt

gospodarskich

Dynamiczny rozwój badań nad mapami genomowymi utrudnia prezentację

aktualnego stanu wiedzy z tego zakresu. Nieomal każdy dzień przynosi

nowe informacje wzbogacające mapy różnych gatunków. Dane pochodzące

z drugiej połowy 1996 roku wykazały, że w genomie bydła opisano już

ponad 1600 loci, a w genomie świni — ponad 1300 loci. Rok później liczba

ta wzrosła do 3300 u bydła i 1600 u świni. Wśród loci markerowych

zdecydowanie przeważają markery klasy II, a bardzo ważne jest to, że są

one równomiernie rozproszone w genomach obu gatunków. Oczywiście są

289

regiony silniej nasycone markerami, gdzie odległość między sąsiednimi loci
wynosi poniżej l cM, ale są również i takie, gdzie odległość ta sięga 20 cM.
Można jednak stwierdzić, że zakładany na początku lat 90. podstawowy cel,
polegający na zbudowaniu mapy, w której odległość między dowolnymi
sąsiednimi loci nie będzie większa niż 20 cM, został w odniesieniu do genomu
bydła i świni już osiągnięty (tab. 12-11). Opracowana w 1997 roku mapa
genetyczna genomu bydła, oparta na analizie segregacji 1240 markerów,
charakteryzuje się znacznym nasyceniem loci markerowych. Średnia odległość
między dwoma dowolnymi sąsiednimi loci wyniosła 2,5 cM. Ogólną długość
genomu, będącą sumą cząstkowych odległości między kolejnymi loci w chro-
mosomach, oszacowano na poziomie 2990 cM. W przypadku świni mapę
skonstruowano na podstawie analizy segregacji 1042 loci. Średnia odległość
między sąsiednimi loci wyniosła 2,2 cM, a ogólna długość genomu — 2286 cM.
Prawie wszystkie badane loci należały do kategorii anonimowych sekwencji
mikrosatelitarnych. Na uwagę zasługuje bardzo rozwinięta mapa genomu
kury (tab. 12-11). Zauważyć trzeba nie tylko dużą liczbę markerów wykorzysta-
nych do budowy mapy sprzężeniowej, ale także i to, że całkowita długość
mapy (3800 cM) jest znacznie większa niż w przypadku ssaków.

Szerokie zastosowanie analizy molekularnej hybrydowych linii komór-

kowych, powstałych na bazie komórek poddanych napromieniowaniu (tzw.
mapowanie radiacyjne) przyczyniło się do gwałtownego zwiększenia nasy-
cenia map genomowycn loci markerowymi. Obecnie coraz częściej pub-
likowane są mapy poszczególnych chromosomów, a nie całych genomów.
Na mapach takich uwzględnione są dane pochodzące z mapowania
fizycznego (informacje pochodzące z zastosowania techniki hybrydyzacji in

290

situ, analizy hybrydowych komórek somatycznych, a w tym także mapowa-

nia radiacyjnego) i sprzężeniowego. Tak opracowane mapy określane są

terminem map zintegrowanych (ang. comprehensive map).

Szczegółowe dane dotyczące map poszczególnych genomów, a w tym

i konkretnych chromosomów, są zamieszczone w internetowych bazach

danych (tab. 12-111). Warto zwrócić uwagę, że również mapy genomów

innych gatunków zwierząt gospodarskich, obok wymienionych w tabeli

12-11, są coraz lepiej poznane. Coraz więcej informacji pojawia się o mapach:

kota, królika, bawoła, a także łososia i pstrąga tęczowego. Do grupy

gatunków objętych mapowaniem dołączyły ostatnio również zwierzęta

futerkowe, takie jak: lis pospolity, lis polarny oraz jenot.

W ślad za programem sekwencjonowania genomu człowieka podjęto

analogiczne przedsięwzięcia dotyczące gatunków zwierząt laboratoryjnych

(sekwencję genomu myszy opublikowano w grudniu 2002 r.) i domowych.

Wśród tych ostatnich pierwszym genomem, dla którego ustalono sekwencję

nukleotydów, jest genom psa. Opublikowano ją we wrześniu 2003 r.

Przewiduje się, że do 2005 r. zostanie ustalona sekwencja genomu bydła,

świni i kury. Powiązanie ze sobą markerowych map genomowych z sek-

wencją DNA genomu danego gatunku umożliwi jeszcze efektywniejsze

poszukiwanie genów o dużym znaczeniu w hodowli zwierząt.

291

12.3.5. Wykorzystanie markerowych map genomowych

w hodowli

Markerowa mapa genomu stała się nieodzownym narzędziem służącym do

identyfikacji loci genów, które z hodowlanego punktu widzenia mają istotne

znaczenie. Dzięki takiej mapie możliwe jest wykrycie sprzężeń między

markerem (-ami) genetycznym (-i) o znanym położeniu na mapie a loci

poszukiwanych genów. Procedura postępowania opiera się na ścisłej

współpracy naukowców z hodowcami. Hodowca wskazuje cechę, która ma

istotne znaczenie gospodarcze, np. wydajność białka w mleku, wydajność

rzeźna, marmurkowatość mięsa, odporność na infekcje specyficznymi

patogenami, bezrożność, choroby genetyczne itp. Mogą to być zatem

zarówno cechy ilościowe, jak i jakościowe. Punktem wyjścia jest precyzyjne

opisanie zmienności cechy, tak aby pojedynczemu osobnikowi można było

przypisać wartość fenotypową w zobiektywizowanej skali. Następnie

podejmowana jest żmudna analiza, polegająca na klasyfikacji fenotypów dla

interesującej cechy, jak i genotypów w jak największej liczbie loci mar-

kerowych, zlokalizowanych w różnych miejscach genomu. Analizę taką

prowadzi się w obrębie rodzin (zazwyczaj trzypokoleniowych), dzięki

czemu śledzi się równocześnie segregację alleli w loci

markerowych i fenotypów badanej cechy. Stwierdzenie, że allele któregoś

z markerów kosegregują z określonymi fenotypami cechy, wskazuje, że z

tym markerem jest sprzężony gen kontrolujący kształtowanie się badanej

cechy lub istotnie na nią wpływający (tzw. gen główny w przypadku cech

ilościowych). Wykrycie sprzężenia jest pierwszym krokiem na drodze do

molekularnego scharakteryzowania poszukiwanego genu, które polega na

opisie struktury genu, a w tym przede wszystkim ustaleniu sekwencji

nukleotydów i wskazaniu miejsc zmutowanych, odpowiedzialnych za

występowanie różnych alleli. Jednocześnie poznawany jest produkt tego

genu oraz jego szczegółowa funkcja biologiczna. Osiągnięcie takiego

poziomu wiedzy o genie zazwyczaj pozwala na opracowanie testu

molekularnego (najczęściej typu PCR-RFLP), który znajduje zastosowanie

w identyfikacji genotypu osobnika na podstawie bezpośredniej analizy

DNA. Ogólny schemat postępowania, którego celem jest identyfikacja

nieznanego genu, jest pokazany na rycinie 12-6.

Klasycznym przykładem wykorzystania badań markerów genetycznych

do identyfikacji genu wpływającego na ważną cechę produkcyjną jest

historia 20-letnich poszukiwań genu odpowiedzialnego za podatność świń

na stres i związanej z tym zmniejszonej wartości technologicznej mięsa

(tzw. mięso blade, miękkie i wodniste, ang. pale, soft, exudative — PSE).

Najpierw ustalono, że cecha ta warunkowana jest monogenowo, a konkretnie

przez allel recesywny. Następnie opracowano test (inhalacja halotanem) do

identyfikacji zwierząt podatnych na stres, tzn. homozygot recesywnych

292

Ryć. 12-6. Ogólny schemat postępowania zmierzającego do identyfikacji nieznanego

genu o dużym znaczeniu hodowlanym, np. genu głównego wpływającego na kształ-

towanie poligenicznych cech produkcyjnych

(nn). Na podstawie tego testu wprowadzono symbol HAL na oznaczenie

genu. Kilka lat później zidentyfikowano pierwsze markery genetyczne

(m.in. locus układu grupowego krwi H oraz loci polimorficznych białek krwi

- GP7, PGD i A1BG), które okazały się ściśle sprzężone z locus HAL. Loci

tych markerów umiejscowiono, za pomocą hybrydyzacji in situ, w chromo-

somie 6 świni (ryć. 12-7a). Wreszcie w 1991 roku zidentyfikowano gen

kandydujący (ang. candidate gene). Był nim gen receptora rianodyny

(RYR1), którego produkt jest zaangażowany w transport jonów wapniowych

w mięśniach szkieletowych. Badania molekularne tego genu u osobników

wrażliwych na stres wykazały, że jedna z kilkunastu zidentyfikowanych

mutacji punktowych prowadzi do zmiany w łańcuchu polipeptydowym,

która polega na zamianie argininy na cysteinę w pozycji 615. Zamiana ta

jest skutkiem tranzycji C

→T w pozycji 1843 cDNA genu RYR1. Odkrycie to

pozwoliło na wskazanie enzymu restrykcyjnego HhaI, który nie rozpoznaje

293

Ryć. 12-7. Lokalizacja niektórych genów głównych o znanej już budowie molekularnej:

(a) KYR1, (b) MSTN, (c) BMPR-IB, (d) PRKAG3 oraz regionów chromosomowych,

w których prawdopodobnie występują geny główne kontrolujące: (e) otłuszczenie tuszy

i tempo wzrostu/ (f) otłuszczenie tuszy i zawartość mięsa w tuszy

sekwencji zawierającej mutację. W ten sposób opracowano test PCR-RFLP

(patrz rozdział: Zmienność cech), który umożliwia wykrycie allelu recesyw-

nego w genotypie homozygot recesywnych i heterozygot.

Od połowy lat 80. wiadomo było, że hipertrofia mięśniowa (tzw.

podwójne umięśnienie) u belgijskiego bydła błękitnego zależy od re-

cesywnego genu mh (ang. muscular hyperthrophy). Poszukiwanie markerów

genetycznych sprzężonych z locus mh pozwoliło ustalić, że gen ten jest

położony w części przycentromerowej ramienia długiego chromosomu

2 bydła. Porównanie tego regionu z homologicznym segmentem chro-

mosomu ludzkiego doprowadziło do wskazania w 1997 roku na gen

miostatyny (MSTN), jako gen kandydujący do miana odpowiedzialnego

za hipertrofię mięśniową (ryć. 12-7b). Analiza molekularna tego genu

u zwierząt z hipertrofią mięśniową, wywodzących się z rasy belgijskiej

294

błękitnej i asturiana, wskazała na obecność w ich genotypie dwóch

zmutowanych allełi (homozygota recesywna). Okazało się, że mutacja

polegała na braku (delecji) 11 nukleotydów. Skutkiem tej mutacji jest

powstanie skróconego łańcucha polipeptydowego (przedwczesne po-

jawienie się kodonu „stop"), który jest biologicznie nieaktywny, co

fenotypowo objawia się hipertrofią mięśniową. Badania molekularne

genu MSTN w innych europejskich rasach mięsnych doprowadziły

do identyfikacji kolejnych czterech, różnych mutacji uszkadzających

funkcję białka miostatyny. Osiągnięcie to pozwala na ustalanie genotypu

zwierząt metodami genetyki molekularnej (patrz rozdział: Zmienność

cech).

Rozwijające się dynamicznie badania nad mapami genomów zwierząt

gospodarskich umożliwiły identyfikację markerów genetycznych sprzężo-

nych z różnymi genami głównymi, które na poziomie molekularnym nie

zostały dotychczas jeszcze rozpoznane. Co więcej, nie udało się jeszcze

wskazać genów kandydujących. Przykładem może być gen Fec

, wpływający

na plenność owiec rasy merynos booroola, a konkretnie kontrolujący liczbę

owulujących oocytów podczas rui. Locus tego genu jest sprzężony z mar-

kerami mikrosatelitarnymi BM1329 i OarAE101, które umiejscowione są

w chromosomie 6 (ryć. 12-7c). W 2001 r. ustalono, że gen Fec

to zmutowana

postać genu BMPR-IB. Substytucja A > G w tym genie odpowiada za

wbudowanie w pozycji 249 łańcucha polipeptydowego argininy zamiast

glutaminy. Powoduje to zmianę siły wiązania ligandów przez receptor

kodowany przez gen BMPR-IB. Innym przykładem jest gen RN, który

odpowiada za zawartość glikogenu w mięśniach. Dominujący gen RN~

powoduje większą, a allel recesywny rn

mniejszą zawartość glikogenu.

Efektem zwiększonej zawartości glikogenu jest uzyskanie po uboju tzw.

kwaśnego mięsa, które ma mniejszą wartość technologiczną. Locus genu RN

umiejscowiono w chromosomie 15, dzięki identyfikacji sprzężonych mar-

kerów mikrosatelitarnych Sw120 i Sw936 (ryć. 12-7d). W 2000 r. zakończyły

się wieloletnie poszukiwania genu RN. Okazało się, że jest nim zmutowany

allel genu PRKAG3, który koduje podjednostkę y kinazy białkowej ak-

tywowanej przez AMP. Mutacja polegała na zmianie sekwencji nukleotydów

G > A w kodonie 200 tego genu.

Badania zmierzające do identyfikacji genów głównych, które w znaczący

sposób wpływają na cechy użytkowe, są prowadzone w licznych ośrodkach

naukowych. W początkowym stadium badań zakłada się, że zmienność

wybranej cechy produkcyjnej może zależeć od jakiegoś genu z dużym

efektem działania, czyli genu głównego. Analiza segregacji licznych mar-

kerów genetycznych, pokrywających w miarę równomiernie większość

genomu, oraz zmienności cechy produkcyjnej w rodzinie referencyjnej

(najczęściej 3-pokoleniowej) może doprowadzić do wskazania regionu

chromosomowego, w którym prawdopodobnie występuje locus genu głów-

nego. W 1994 roku ukazała się praca dowodząca, że w chromosomie 4 świni,

295

między markerami S0001 i S0067, występuje prawdopodobnie locus (loci?)

genu głównego wpływającego na tempo wzrostu oraz otłuszczenie tuszy

(ryć. 12-7e). Sugestia ta została potwierdzona także w innych badaniach. Do

tej pory jednak nie udało się zaproponować genu (-ów?) kandydującego,

który odpowiadałby za kształtowanie tych cech ilościowych. Podobne

badania przeprowadzone w ramach Polskiego Projektu Mapowania Genomu

Świni sugerują, że w chromosomie 12, między markerami mikrosatelitarnymi

S0083 i S0090, występuje locus (loci?) genu głównego wpływającego na

odkładanie tłuszczu brzusznego i zawartość mięsa w tuszy (ryć. 12-7f).

Z kolei w październiku 2003 r. doniesiono, że mutacja w intronie 3 genu

IGF2 (insulinopodobnego czynnika wzrostu 2) wywołuje bardzo duży

wpływ na mięsność świń. Prosta substytucja G > A prawdopodobnie zakłóca

interakcję DNA z nieznanym białkiem represorowym, czego efektem jest

3-krotny wzrost ekspresji genu IGF2. Trzeba zaznaczyć, że gen ten podlega

piętnowaniu gametycznemu. W przypadku genu IGF2 ekspresji podlega

jedynie allel pochodzący od ojca, czyli duży efekt fenotypowy pojawia się

tylko wtedy, gdy zmutowany allel jest odziedziczony od ojca. Odnotowano

też znaczące osiągnięcie dotyczące bydła. Z badań prowadzonych w rodzi-

nach referencyjnych wynikało, że w chromosomie 14 zlokalizowany jest gen

wpływający w znaczący sposób na wydajność i skład mleka. W 2001 r.

wykazano, że mutacja typu podstawienia dwunukleotydowego AA > GC

w genie DGTA1 (acylo-CoA: diacylogliceroloacylotransferaza) wywołuje

zmianę lizyny na alaninę, a to upośledza funkcję kodowanego enzymu.

W efekcie dochodzi do znacznego zwiększenia wydajności tłuszczu w mleku.

Mapy genomowe są powszechnie wykorzystywane do identyfikacji

genów odpowiedzialnych za monogenowe choroby genetyczne lub marke-

rów genetycznych z nimi sprzężonych. Jednym z przykładów może być

letalna wada rozwojowa — achondroplazja, określana symbolem bd (ang.

bulldog disease), ze względu na wywoływane zmiany m.in. w budowie

czaszki. Nosicielstwo genu recesywnego bd stwierdzono w 1999 roku

w genotypie francuskiego buhaja, charakteryzującego się wybitną wartością

hodowlaną. W początkowym okresie jego użytkowania stwierdzono, że około l

% potomków był obarczony letalnymi zniekształceniami czaszki i kończyn.

Oznaczało to, że również wiele krów było nosicielkami zmutowanego genu

bd. Badacze francuscy wytypowali 75 rodzin (buhaj nosiciel, krowa nosicielka,

chore cielę — homozygota recesywna), w których przeprowadzono analizę

dziedziczenia markerów genetycznych rozproszonych równomiernie po

całym genomie. Wkrótce potem udało się zidentyfikować marker genetyczny

silnie sprzężony z genem bd. Osiągnięcie to pozwalało na identyfikację

potomków buhaja nosiciela, którzy również byli nosicielami tego niepożąda-

nego genu. Dzięki temu udało się zapobiec rozprzestrzenianiu niepożądane-

go genu, w wyniku wykorzystywania do inseminacji nasienia buhaja

nosiciela. Można się spodziewać, że wkrótce zostanie również zidentyfikowa-

ny gen odpowiedzialny za powstanie tej wady wrodzonej.

296

W tym samym czasie w populacji duńskiej bydła holsztyńsko-fryzyjskiego

zidentyfikowano inną letalną wadę rozwojową, polegającą na zniekształceniu

kręgów (ang. CVM — central vertebral malformation). Również dla tego

genu udało się zidentyfikować sprzężone markery genetyczne, a ostatnio

scharakteryzowano gen oraz mutację w nim występującą. Niestety badań

tych nie opublikowano, a opracowany test molekularny skomercjalizowano.

Szczególne osiągnięcia dotyczące identyfikacji genów odpowiedzialnych

za rozwój monogenowych chorób dziedzicznych odnotowano u psów.

U gatunku tego znanych jest ponad 300 jednostek chorobowych uwarun-

kowanych przez mutacje pojedynczych genów. Wiele z tych mutacji

występuje w ściśle określonych rasach. Dotychczas opisano na poziomie

molekularnym trzydzieści genów i ich mutacji odpowiedzialnych za rozwój

choroby dziedzicznej. Wśród nich są geny wywołujące takie schorzenia, jak:

dziedziczna dystrofia siatkówki u owczarków francuskich (briardów),

narkolepsja u dobermanów i labradorów, ciężki złożony niedobór odporności

psów rasy welsh corgi czy fukozydoza u angielskich springer spanieli.

W latach 2001-2003 podjęto udane próby terapii genowej niektórych chorób

dziedzicznych psa (np. dziedziczny zanik siatkówki u owczarków fran-

cuskich).

Przedstawione powyżej przykłady wykorzystania markerowych map

genomowych do rozwiązywania konkretnych problemów hodowlanych

pokazują, że genetyka molekularna stała się kluczowym narzędziem służą-

cym postępowi w hodowli zwierząt.

Literatura uzupełniająca

Podręczniki

Biochemia (1997), L. Stryer (tłum. z j. ang. pod red. J. Augustyniaka i J. Michejdy),

Wydawnictwo Naukowe PWN. Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki

klinicznej (2001), pod red. J. Bala,

Wydawnictwo Naukowe PWN. Biotechnologia zwierząt (1997), pod red. L.

Zwierzchowskiego, K. Jaszczaka i J. Modlińskiego,

Wydawnictwo Naukowe PWN.

Cytobiochemia (1995), L. Kłyszejko-Stefanowicz, Wydawnictwo Naukowe PWN. Genetyka
człowieka. Rozwiązywanie problemów medycznych (2003), B.R. Korf (przekład pod

red. A. Pawlaka), Wydawnictwo Naukowe PWN.

Genetyka molekularna (1995), pod red. P. Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN.
Genom człowieka. Największe wyzwanie współczesnej genetyki i medycyny molekularnej (1997),

pod red. W. Krzyżosiaka, Wydawnictwo Naukowe PWN. Genomy (2001), T.A.

Brown (przekład pod red. P. Węgleńskiego), Wydawnictwo

Naukowe PWN. Immunologia (1996), I. Roitt, J. Brostoff, D. Małe (tłum. z j. ang. pod

red. J. Żeromskiego),

Wydawnictwo Medyczne Słotwiński Yerlag, Brema. Jeżyk genów. Poznawanie zasad

dziedziczenia (1997), P. Berg i M. Singer (tłum. z j. ang.

M. Waśniewska-Brzeska i J. Brzeski), Prószyński i S-ka, Warszawa. Karty z Dziejów

Zootechniki Polskiej. Cz. II— lata 1972^-1997 (1997), pod red. A. Filistowicza,

J. Juszczaka i S. Wężyka, Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego,

Warszawa.

Leksykon biologiczny (1992), pod red. Cz. Jury i H. Krzanowskiej, Wiedza Powszechna.
Leksykon rozrodu zwierząt (1996), pod red. K. Rosłanowskiego, Wydawnictwo Akademii

Rolniczej w Poznaniu. Leksykon terminów z zakresu genetyki i hodowli zwierząt

(1994), B. Nowicki i wsp.,

Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, Warszawa. Słownik

terminów genetycznych (2002), R.C. King, W.D. Stansfield (przekład zbiorowy pod

red. W. Prus-Głowackiego), Ośrodek Wydawnictw Naukowych PAN, Poznań. The

Major Histocompatibility Complex Region of Domestic Animal Species (1996), pod red.

L.B. Schook i S.J. Lamont, CRC Press Inc., USA.

298

Artykuły przeglądowe

Barsh G. (1996). The genetics of pigmentation: from fancy genes to complex traits. Trends

in Genetics 12 (8): 299-305. Bartnik E. (1997). Ludzki genom mitochondrialny —

mutacje, polimorfizmy i choroby.

Postępy Biologii Komórki 24 (8): 69-75. Charon K.M. (1998). Wykorzystanie metod

molekularnej analizy genomu zwierząt

w pracy hodowlanej. Postępy Nauk Rolniczych 7 (nr 5): 87-97. Charon K.M. (1998).

Znaczenie głównego układu zgodności tkankowej w hodowli

zwierząt. Medycyna Weterynaryjna 54 (2): 92-96. Cotinot C. i wsp. (2002). Molecular

genetics of sex determination. Seminars in Reproductwe

Medicine 20: 157-167. De Gortari M.J., Freking B.A., Cuthbertson R.P., Kappes S.M.,

Keele J.W., Stone R.T.,

Leymaster K.A., Dodds K.G., Crawford A.M., Beattie C.W. (1998). A second-generation

linkage map of the sheep genome. Mammalian Genome 9: 204-209. Ellis S.A. (1994).

Minireview — MHC studies in domestic animals. European Journal of

Immunogenetics 21: 209-215.

Friend S.H., Stoughton R.B. (2002). Magiczne mikromacierze. Świat Nauki 4 (128): 36-43.
Grzybowski G. (1997). Wybrane praktyczne aspekty technik molekularnych — PCR-RFLP

i automatycznego sekwencjonowania DNA — w badaniach genomu zwierząt gos-
podarskich. Prace i Materiały Zootechniczne 50: 69-78. Grzybowski G., Dymnicki E.
(1997). Metody oraz znaczenie sterowania proporcją płci

u bydła. Biotechnologia 3 (38): 38-50. International Human Genome Seąuencing

Consortium (2001). Initial seąuencing and

analysis of the human genome. Naturę 409: 860-921. Kamiński S. (1996). Bovine

kappa-casein (CASK) gene — molecular naturę and application

in dairy cattle breeding. Journal of Applied Genetics 37: 179-196. Kamiński S. (2002).

DNA microarrays — a methodological breakthrough in genetics.

Journal of Applied Genetics 43: 123-130. Kappes S.M., Keele J.W., Stone R.T.,

McGraw R.A., Sonstegard T.S., Smith T.P.L.,

Lopez-Corrales N.L., Beattie C.W. (1997). A second-generation linkage map of bovine

genome. Genome Research 7: 235-249. Kirkness E.F. i wsp. (2003). The dog

genome: survey seąuencing and comparative

analysis. Science 301: 1898-1903. Krzanowska H. (1999). Długa historia krótkiego

chromosomu — jak poznano geny

płodności sprzężone z chromosomem Y u ssaków. Postępy Biologii Komórki 26 (supl.

12): 53-58. Kurył J. (1998). Geny oddziałujące na jakość tuszy i mięsa świń.

Prace i Materialy

Zootechniczne. Zeszyt specjalny 8: 9-18. Lechniak D. (1996). Anomalie

chromosomowe przyczyną zamierania gamet i zarodków

bydlęcych. Medycyna Weterynaryjna 52 (2): 89-93. Long S.E. (1997). Chromosome

abnormalities in domestic sheep (Ovis aries). Journal of

Applied Genetics 38: 65-76. Pareek Ch.S., Kamiński S. (1996). Bovine leukocyte

adhesion deficiency (BŁĄD) and its

worldwide prevalence. Journal of Applied Genetics 37 (3): 299-312. Parham P., Ohta T.

(1996). Population biology of antigen presentation by MHC class

I molecules. Science 272: 67-74. Pierzchała M. (1996). Mapa genomu świni (Sus

scrofa domestica). Prace i Materialy

Zootechniczne 49: 7-28. Ramikssoon Y., Goodfellow P. (1996). Early steps in

mammalian sex determination.

Current Opinion in Genetics & Development 6: 316-321.

299

Rejduch B., Świtoński M., Słota E., Danielak B., Kozubska-Sobocińska A. (1994). Aberracje

chromosomowe u bydła o użytkowości mięsnej. Medycyna Weterynaryjna 50 (8):

379-382. Rohrer G.A., Alexander L.J., Hu Z., Smith T.P.L., Keele J.W., Beattie

C.W. (1996).

A comprehensive map of the porcine genome. Genome Research 6: 371-391. Ruvinsky

A. (1999). Basics of gametic imprinting. Journal of Dairy Science 82 (suppl.

2):288-237. Słomski R., Napierała D., Kwiatkowska J. (1998). Reakcja łańcuchowa

polimerazy (PCR)

w badaniach naukowych i diagnostyce molekularnej. Postępy Biologii Komórki 25 (supl.

10): 195-217.

Stachurska A. (1997). Inheritance of colours in horses. Journal of Applied Genetics 38:195-204.
Sysa P.S. (1997). Krajowy system kontroli cytogenetycznej buhajów. Medycyna Weterynaryjna
53 (10): 581-584. Szatkowska L, Zych S., Kulig H. (2003). Determinacja płci u ssaków.
Medycyna Weterynaryjna

59: 847-852. Szwaczkowski T. (1993). Identyfication of animal major genes in field

collected data by

use of statystical methods. Journal of Animal and Feed Sciences 2/3: 91-103. Szydłowski

M. (1994). Wybrane aspekty analizy loci markerowych w doskonaleniu

ilościowych cech zwierząt. Prace i Materiały Zootechniczne 46: 29-40. Szymański M.,

Barciszewska M.Z., Żywiecki M., Barciszewski J. (2003). Noncoding RNA

transcripts. Journal of Applied Genetics 44: 1-20. Świtoński M. (1998). Markerowe

mapy genomowe i ich wykorzystanie w hodowli

zwierząt. Postępy Biologii Komórki 25 (supl. 10): 113-122. Świtoński M., Kurył J. (1998).

Poszukiwanie genów kontrolujących cechy tuczne, opasowe

i rzeźne — najnowsze osiągnięcia. Prace i Materiały Zootechniczne 52: 37-42. Świtoński

M., Stranzinger G. (1998). Synaptonemal complexes in domestic mammals —

a review. Journal of Heredity 89 (6): 473-480. Walawski K. (1999). Genetic aspects of

mastitis resistance in cattle. Journal of Applied

Genetics 40 (2): 117-128. Waterston R.H. i wsp. (2002). Initial seąuencing and

comparative analysis of the mouse

genome. Naturę 420: 520-562. Węgrzyn J., Skiba E. (1997). Antigenic markers of

protein genes and their nomenclature

in cattle. Journal of Applied Genetics 38 (3): 319-328. Wierzbicki H. (1998).

Genetyczne uwarunkowania odmian barwnych lisa pospolitego

(Vulpes vulpes) i lisa polarnego (Alopex lagopus). Prace i Materiały Zootechniczne 53: 35-48.

Yenter C. i wsp. — Celera Genomics (2001). The seąuence of the human genome. Science

291: 1304-1351. Zwierzchowski L., Rosochacki S.J. (1998). Transgeneza —

możliwości i perspektywy

zastosowania w produkcji zwierzęcej. Prace i Materiały Zootechniczne 50: 11-39.

Zwierzchowski L. (1998). Biotechnologiczne wykorzystanie gruczołu mlecznego -

perspektywy manipulacji genetycznych białkami mleka. Biotechnologia 2 (41): 33-56.

Document Outline