Ćwiczenie nr 5
Regulacja ekspresji genów na przykładzie rozwoju bakteriofaga T4.
Prowadząca ćwiczenie: mgr Michalina Filipiak office A/236
Bakteriofag T4 należy do grupy fagów zjadliwych. Fagi zjadliwe są zdolne tylko do
cyklu litycznego, kończącego się zawsze lizą komórki gospodarza i uwolnieniem potomstwa
fagowego. Drugą grupę bakteriofagów stanowią fagi łagodne, które w zależności od
warunków wzrostu komórek gospodarza, mogą wybrać pomiędzy cyklem litycznym a cyklem
lizogenicznym, podczas którego dochodzi do integracji genomu faga z chromosomem
bakteryjnym w formie profaga. Profag jest przekazywany do komórek potomnych i w
określonych warunkach może rozpocząć cykl lityczny, prowadzący do lizy komórki
gospodarza.
Typowy cykl infekcyjny bakteriofaga T4 kończy się tzw. lizą od wewnątrz (LI, ang.
lysis from within), która prowadzi do uwolnienia od 100 do 200 fagów potomnych w 25-30
min po infekcji, jeśli bakterie są hodowane w 37°C w bogatej pożywce. W procesie tym biorą
udział dwa główne białka: holina T i endolizyna E o aktywności lizozymu. Endolizyna E
akumuluje się w cytoplazmie, natomiast holina T jest umiejscowiona w błonie wewnętrznej.
W odpowiednim momencie holina T oligomeryzuje, tworząc pory, przez które endolizyna E
przedostaje się do periplazmy i trawi ścianę komórkową. Powoduje to lizę komórki
gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego. Jeśli bakteriofag T4 zakazi bakterie, które
rosną bardzo wolno albo wcale, to hamuje swój cykl rozwojowy do momentu, aż komórki
bakteryjne zaczną się dzielić. Dopiero wtedy kontynuuje swój rozwój i następuje liza
komórek gospodarza. Mechanizm ten nazwano pseudolizogenią. Jest to jeden z procesów
umożliwiających opóźnienie i dostosowanie czasu lizy do warunków wzrostu komórek
gospodarza.
Kolejnym przystosowaniem jest inhibicja lizy (LIN, lysis inhibition). Polega ona na
tym, że jeśli po 3 minutach (lub więcej) od rozpoczęcia cyklu rozwojowego faga T4, dojdzie
do adsorpcji kolejnych fagów T4 do tej samej bakterii, następuje przesunięcie momentu lizy
nawet o kilka godzin. W tym czasie tworzą się potomne cząstki fagowe, co powoduje, oprócz
opóźnienia lizy w czasie również wzrost plonu fagowego z 100-200 wirionów do nawet 1000.
Do indukcji LIN niezbędne jest funkcjonalne białko RI, będące antyholiną, które
oddziaływuje bezpośrednio z holiną T, uniemożliwiając otwarcie porów w błonie
wewnętrznej i przejście endolizyny E z cytoplazmy do periplazmy, dzięki czemu chroni
ś
cianę komórkową przed trawieniem i blokuje lizę. Białko RI zbudowane jest z 97
aminokwasów, a jego masa wynosi 11,1 kDa. Uważa się, ze domena N-końcowa zawiera 16
aminokwasowy peptyd sygnałowy, odpowiadający za transport RI do periplazmy, który
prawdopodobnie ulega odcięciu między 24 a 25 aminokwasem. Domena C-końcowa pełni
funkcję antyholiny. Kolejnym białkiem biorącym udział w LIN jest białko RIII o masie 9,3
kDa, zbudowane z 82 aminokwasów. Występuje w cytoplazmie i prawdopodobnie stabilizuje
oddziaływania białka RI z holiną T przez oddziaływanie z cytoplazmatyczną N-końcową
domeną holiny T. Transkrypcja genów rI (koduje białko RI) oraz rIII (koduje białko RIII)
zachodzi z wczesnych i późnych promotorów, genu t (koduje holinę T) z promotora późnego,
a genu e (koduje endolizynę E)- mimo obecności promotora wczesnego i późnego- efektywna
translacja zachodzi tylko na bazie transkryptu z promotora późnego. Z wczesnego transkryptu
nie dochodzi do translacji, ponieważ jest zablokowana przez strukturę szpilki, powstającą na
końcu 5’ tego transkryptu.
Nadal nieznany jest sygnał powodujący inhibicję lizy, jak i sygnał powodujący
synchroniczny zanik LIN (LIN collapse), co prowadzi do równoczesnej lizy zakażonych
komórek bakteryjnych.
Mechanizm LIN chroni potomstwo fagowe przed zakażeniem bakterii już
zainfekowanych innym fagiem T4. Adsorpcja nowego bakteriofaga T4 do powierzchni
zainfekowanej komórki jest dla niego samobójstwem, ponieważ jego DNA jest uwalniany do
przestrzeni periplazmatycznej i tam degradowany przez nukleazy.
