INNE  ENZYMY  I  BIAŁKA  NIEENZYMATYCZNE  WYKORZYSTYWANE  W 
KLONOWANIU MOLEKULARNYM 
 
Wiele  różnych  enzymów,  nie  tylko  restryktazy,  jest  wykorzystywanych  rutynowo  w  klonowaniu 
molekularnym: 
 
DNA POLIMERAZY (DNA- i RNA-ZALEŻNE) 
Wiele  etapów  klonowania  molekularnego  wymaga  syntezy  DNA  in  vitro  –  reakcje  te  katalizują 
polimerazy  DNA.  Są  to  enzymy,  które  wymagają  matrycy  (w  większości)  i  syntetyzują  produkt, 
którego sekwencja nukleotydów jest komplementarna do matrycy. Większość polimeraz preferuje 
matryce DNA, ale mogą również kopiować RNA (odwrotna transkryptaza). 
 
RNA POLIMERAZY (DNA-ZALEŻNE) 
Enzymy, które katalizują syntezę RNA na matrycy dsDNA. Polimerazy pochodzenia fagowego są 
wykorzystywane  in  vitro  do  generowania  dużych  ilości  RNA  komplementarnego  do  jednej  z  nici 
obcego DNA sklonowanego za fagowym promotorem w wektorze plazmidowym. 
 
LIGAZY 
Enzymy wykorzystywane do łączenia dwóch różnych cząsteczek DNA to ligazy DNA. Najczęściej 
wykorzystywaną  jest  ligaza  kodowana  w  genomie  faga  T4.  RNA  ligaza  to  enzym  zdolny  do 
kowalencyjnego  łączenia  cząsteczek  jednoniciowego  RNA  posiadających  grupy  5’-fosforanową  i 
3’-hydroksylową. 
 
KINAZY 
Enzymy  te  wykorzystywane  są  do  fosforylowania  końców  cząsteczek  DNA  pozbawionych  reszt 
fosforanowych, np.: kinaza polinukleotydowa faga T4. 
 
FOSFATAZY 
Odwrotnie  niż  kinazy  enzymy  te  wykorzystujemy  do  defosforylacji,  czyli  usuwania  grup 
fosforanowych z 5’-końców łańcuchów polinukleotydowych, np.: fosfataza alkaliczna E. coli. 
 
NUKLEAZY 
Enzymy,  które  katalizują  hydrolizę  wiązania  fosfodiestrowego.  Egzonukleazy  usuwają 
mononukleotydy  z  końców  liniowego  DNA.  Endonukleazy  atakują  wiązania  fosfodiestrowe 
wewnątrz cząsteczek dwu- lub jednoniciowych; np.: Dezoksyrybonukleaza I – endonkleaza, która 
hydrolizuje  ds  lub  ssDNA  preferencyjnie  w  miejscach  przylegających  do  nukleotydów 
pirymidynowych;  produkty  takiej  reakcji  trawienia  to  złożona  mieszanina  5’-fosfo  mono-  i 
oligonukleotydów;  w  obecności  jonów  Mg2+  każda  nić  jest  atakowana  niezależnie,  a  miejsca 
trawienia  na  obu  niciach  rozmieszczone  w  sposób  przypadkowy;  Rybonukleaza  A  – 
endorybonukleaza,  przecinająca  wiązanie  3’-fosfodiestrowe  przy  pirymidynach,  niewykazująca 
żadnej aktywności w stosunku do DNA, stosowana do usuwania RNA z preparatów DNA 
 
BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE 
W inżynierii genetycznej wykorzystywane są również nieenzymatyczne białka wiążące DNA, np.: 
białko  SSB  (ang.  single-stranded  DNA-binding  protein),  wiążące  się  w  sposób  kooperatywny  z 
ssDNA (ich użyteczność wynika z faktu, że mogą destabilizować struktury drugorzędowe powstałe 
w obrębie jednej nici i zwiększać tym samym procesywność enzymów, usuwając „bariery” na ich 
drodze).