Kultury Tkankowe Zwierzęce i Roślinne

Hodowle komórkowe w produkcji
szczepionek przeciwwirusowych,

przeciwnowotworowych.

[e-mail]

Układ odpornościowy/immunologiczny:

• Narządy limfatyczne

- centralne:

grasica, szpik

- obwodowe

: węzły chłonne, grudki limfatyczne, migdałki,

wyrostek robaczkowy, śledziona

*

,

• Krążące limfocyty

*

narząd krwiolimfatyczny

• Limfocyty T

(tymocyty) po opuszczeniu centralnych narządów

lokują się w obszarach grasiczozależnych (thymus dependent):

strefa przykorowa węzłów i wokół tętniczek w śledzionie gdzie

namnażają się i dojrzewają

• Limfocyty B

(bone marrow dependent

) lokują się w obszarach

grasiczoniezależnych: rozsiane i skupione grudki limfatyczne

także namnażają się i dojrzewają

• Limfocyty T - odpowiedź immunologiczna typu komórkowego

• Limfocyty B - odpowiedź humoralna (produkcja przeciwciał)

Subpopulacje limfocyt

ów/antygeny różnicowania CD

(cluster of differentiation)

Limfocyty B (CD19)

–

aktywność humoralna

Limfocyty T (CD4), pomocnicze

Limfocyty T (CD8), supresorowe

Komórki NK (CD16) naturalni zabójcy

DP= podwójnie dodatni
(CD4CD8) tymocyt

Aktywność
komórkowa

Limfocyty T pomocnicze (helper T)

Limfocyty T cytotoksyczne/supresorowe

Naturalni zabójcy

(natural killer T lymphocytes)

Limfocyty B

Komórki plazmatyczne powstające z dzielących się
limfocytów B intensywnie uwalniają przeciwciała do
osocza i przestrzeni pozakomórkowej

Antygeny związane
przez przeciwciała
są pożerane przez
makrofagi

Odpowiedź humoralna i komórkowa są powiązane

APC,

antigen

presenting cell

Każdy limfocyt B w stanie spoczynku zawiera na
powierzchni swoiste przeciwciało (receptor).

Rodzaje odporności przeciwzakaźnej

1.

Odporność naturalna:

-

bierna (przejście przeciwciał klasy IgG przez łożysko)

-

czynna (zakażenie, przechorowanie)

2.

Odporność sztucznie wytworzona:

- czynna (szczepionki)

-

adoptywna (podanie swoistych limfocytów Tc)

- bierna (podanie immunoglobin)

- czynno-bierna (szczepienie + podanie IgG)

• Szczepionka

- produkt pochodzenia biologicznego

zawierający substancje (antygeny) zdolne do indukcji
określonych procesów immunologicznych warunkujących
powstanie trwałej odporności bez wywoływania działań
toksycznych

• Odporność

jest wynikiem wytworzenia

przeciwciał

,

immunoglobin mających zdolność wiązania się z antygenem
(obecne w płynach ustrojowych i wydzielinach błon
śluzowych dróg oddechowych, układu pokarmowego)

Cel szczepień

• Wytworzenie indywidualnej odporności adaptacyjnej

wobec określonego drobnoustroju

• Eliminacja drobnoustrojów ze środowiska życiowego

człowieka (także zwierząt)

Szczepionki swoiste

• Indukują trwałą i specyficzną odpowiedź immunologiczną

przeciw danemu drobnoustrojowi

-

Monowalentne

(zawierają jeden typ drobnoustroju/antygenu)

-

Poliwalentne

(kilka typów serologicznych tego samego

drobnoustroju, n.p. szczepionka przeciw grypie, poliomyelitis,
pneumokokom)

-

Swoiste skojarzone (bakteryjne, Di-Per-Te p-

w błonicy,

krztuścowi i tężcowi lub wirusowe p-w różyczce, odrze i śwince)

Szczepionki nieswoiste

• Mieszaniny zabitych drobnoustrojów lub ich lizaty

–

niespecyficzne stymulatory odporności stosowane w

nawracających zakażeniach o różnej etiologii
(zwykle słabo oczyszczone: białka, peptydy, lipopolisacharydy,

kwasy nukleinowe; możliwość efektów niepożądanych)

• Autoszczepionki

(zawiesiny inaktywowanych drobnoustrojów

wyizolowanych z flory bakteryjnej chorego)

• Oba rodzaje nie przeszły żadnych tzw. randomizowanych badań

klinicznych!

Zgodnie z technologią otrzymywania wyróżniamy szczepionki:

•

Zawierające żywe drobnoustroje

(atenuowane/odzjadliwione)

o zmodyfikowanych właściwościach (osłabiona wirulencja, szczepy
niezjadliwe

–na drodze manipulacji genetycznej)

•

Zawierające inaktywowane drobnoustroje

(chemicznie np.

fortmaldehyd, alkohole; fizycznie np. ultrawirowanie, wysokie

ciśnienie, temperatura)

•

Zawierające oczyszczone fragmenty

drobnoustrojów (antygeny

powierzchniowe, inaktywowane toksyny)

•

Zawierające produkty rekombinowanego DNA

Najwyższy poziom bezpieczeństwa !

BCG (Bacillus Calmette-

Guérin)

-

szczepionka przeciw gruźlicy

opracowana we Francji przez Alberta Calmette i Camille'a Guérin

i wprowadzona w 1921.

Stanowi ona atenuowany szczep Mycobacterium bovis

(wywołuje

gruźlicę bydła), uodparnia na Mycobacterium tuberculosis (gruźlica
u człowieka.

Atenuacja zaszła wskutek 231 pasaży na podłożu z żółcią.

BCG jest przydatna w immunoterapii nowotworów (powierzchownych
postaci raka pęcherza moczowego). Mechanizm jest niejasny, wydaje
się, że przeciwko guzowi zostaje uruchomiona lokalna reakcja
immunologiczna, zapobiega nawrotom w ⅔ przypadków.

BCG bywa także do wykorzystywana w immunoterapii raka okrężnicy.

Wirusowe szczepionki atenuowane:

Wirus odry, różyczki, świnki, polio

Szczególny typ szepionki p-ospie

Edward Jenner -

1796 dokonał szczepienia wirusem krowianki 8-letniego

chłopca

Jedyną szczepionkę

z żywych wirusów

stosowano do roku 1980

przeciwko ospie prawdziwej. Były to wirusy krowianki, mało wirulentne
dla człowieka, ale dawały odporność przeciw ospie prawdziwej (Variola
vera);

Obecnie ospa została opanowana i na całym świecie nie stwierdza

się choroby

Wirus ospy prawdziwej; Orthopoxvirus; duży –
widoczny w mikroskopie świetlnym (230x400nm);

dwuniciowe, linearne DNA; glikolipidowa otoczka

- bardzo odporny na wysychanie

– średnio kilka lat

ale izolowany z mumii Ramzesa V (1100r.p.n.e.) !

Obecnie, zgodnie z zaleceniami WHO

przechowuje się 200

mln dawek szczepionki liofilizowanej (Genewa, Lozanna, New
Dehli);

każdy kraj posiada swoje zapasy

istnieje obowiązek zgłaszania niejasnych przypadków
gorączki z wysypką i wykluczenia zakażenia na podstawie
badań laboratoryjnych

wirus przechowywany jest w USA (Atlanta, CDC) i w Rosji
(Moskwa, Instytut Preparatów Wirusowych), gdzie
prowadzone są badania nad tzw. białymi pokswirusami, tj.
ortopokswirusami podobnymi do ospy prawdziwej.

Szczepionki atenuowane:

• Poliomyelitis , choroba Heinego-Medina (zapalenie rogów

przednich rdzenia).

• Komórki pierwotne z nerek małp, linie komórek nerki małp,

komórki diploidalne ludzkie, fibroblasty MRC5)

Szczepionka Sabina (OPV

– Oral Poliovirus Vaccine), w

zależności od ilości typów wirusa (I, II lub III) rozróżnia się:
mOPV

– monovalent OPV lub tOPV – trivalent OPV)- zawiera

żywe, atenuowane wirusy. Jest podawana doustnie.
(Możliwość rewersji zjadliwości wirusa)

• Hilary Koprowski

(ur.1916)

– twórca pierwszej atenuowanej

szczepionki przeciw polio

Następstwo choroby poliomyelitis

Nagminne wirusowe zapalenie przyusznic

– świnka (mumps),

Niebezpieczna dla chłopców w okresie dojrzewania !

Do produkcji szczepionki używa się komórki diploidalne
ludzkie, fibroblasty MRC5

Odra, różyczka*, żółta febra, opryszczka-varicella zoster

(diploidalne komórki ludzkie lub fibroblasty zarodków kurzych)

*

Niebezpieczna dla płodu: wady serca, opóźnienie w rozwoju,

głuchota, zaćma, niekiedy obumarcie płodu.

2. Szczepionki przeciwwirusowe inaktywowane:

• Poliomyelitis

(komórki pierwotne z nerek małp, linie komórek

nerki małp, komórki diploidalne ludzkie, fibroblasty MRC5)
Szczepionka Salka (IPV

– Inactivated Poliovirus Vaccine) –

zawiera zabite wirusy podawane pozajelitowo (iniekcja).
Wywołuje tylko odpowiedź ogólnoustrojową, wirusy nie
kolonizują nabłonka jelit i nie pobudzają produkcji
odpowiedniej Ig A.

• Wścieklizna

• (ludzkie komórki diploidalne lub fibroblasty zarodków kurzych)

• Odkleszczowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych

(fibroblasty zarodków kurzych)

Szczepionki, które nie pochodzą z hodowli

komórek ludzkich:

• Szczepionka przeciw grypie

(wirus namnażany jest w

zarodkach kurzych jaj)

•

Szczepionka przeciw WZW B

(wirusowemu zapaleniu

wątroby, hepatitis B). Antygen wytwarzany jest na drodze

inżynierii genetycznej w komórkach drożdży, szczepionka
podjednostkowa

• Infekcja wirusem HBV o przebiegu chronicznym może

prowadzić do powstania raka wątroby

Wirus HBV

– szczepionka podjednostkowa

• Genom zawiera 3182 nukleotydy

• Kapsyd zbudowany jest z glikoproteiny HBsAg (antygen Australia)

• Hepatocyty chorych wydzielają do krwi antygen HBsAg związany z

lipidami w postaci 22 nm-

sferycznych cząstek i większe 42 nm-

cząstki DNA-zakaźne, cząstki Dana;

• Do ~1980 r cząstki te, z surowicy ozdrowieńców (inaktywowane

formaliną) były stosowane jako szczepionka

• Produkt inżynierii genetycznej uzyskano przez rekombinację

genomu drożdży z sekwencją kodującą HBsAg (835 par zasad)
genomu wirusa HBV

• Produkowany przez drożdże antygen prezentuje dobrą

immunogenność, a pacjenci szczepieni taką szczepionką wykazują

dobrą tolerancję.
(Szczepienia trzeba powtarzać po 1/2, 3 i 5 latach)

Szczepionki trzeciej generacji (szczepionki DNA)

(profilaktyka genowa/wprowadzenie do organizmu czystego

genu)

Szczepionki te często określa się mianem "nagich”

Celem-

dostarczenie organizmowi DNA kodującego białka

antygenów wirusowych
(S

ynteza endogennego białka naśladuje infekcję wirusową,

produkowany antygen jest prezentowany LyT

przez cząsteczki MHC kl.I)

Komórki wykazujące ekspresję antygenu wirusowego są niszczone,
antygen jest uwalniany i dalej prezentowany przez komórki MHC kl.II
komórkom produkującym przeciwciała

Wprowadzanie szczepionek DNA

Bezpośrednio do komórek mięśniowych lub śródskórnie

(śródskórne 200-300 razy bardziej wydajne), lub w postaci aerozolu

do górnych dróg oddechowych

Na przykład :
Wstrzyknięcie do komórek mięśni szkieletowych cząsteczek kwasu

nukleinowego wirusa grypy w postaci plazmidu stymuluje
powstanie wyspecjalizowanych populacji cytotoksycznych

limfocytów (Tc), (

na etapie prób klinicznych

).

Zaletą szczepionek uzyskiwanych z zastosowaniem technik

rekombinacji DNA jest:

-

stabilność,

-

bezpieczeństwo procesu produkcji

-

brak efektów ubocznych.

-

możliwość relatywnie szybkiej modyfikacji (wprowadzanie

zmian odzwierciedlających mutacje zachodzące w patogenach).

Szczepionki przeciwgrypowe

• Grypa – ostra choroba zakaźna powodowana przez wirus

grypy atakujący górne drogi oddechowe

• Wirus grypy (Influenzavirus A, B, C)

• Objawy: wysoka gorączka, kaszel, ból głowy, ogólne rozbicie

• Groźne dla zdrowia i życia są powikłania pogrypowe:

zapalenie oskrzeli, płuc, ucha środkowego oraz zapalenie
mięśnia sercowego i osierdzia

• Według WHO, co roku na świecie choruje na grypę od

330 mln do 1,5 mld ( z czego umiera 0,5-1 mln)

• Zachorowania mają charakter epidemii

• Co kilkanaście/kilkadziesiąt lat mają charakter pandemii

(zasięg ogólnoświatowy):

• 1918-1919 „hiszpanka” (100 mln zgonów, a w I wojnie

św. 9 mln)

• 1957-1958 pandemia grypy azjatyckiej
• 1968-1970 pandemia grypy Hongkong

• Pandemie

wywoływane przez nowo pojawiający się typ

wirusa, na który większość ludzi nie jest uodporniona
(np. wirus ptasi)

• Szczepionki p-grypie są szczepionkami inaktywowanymi

(zawierają fragmenty wirusa niezdolnego do namnażania się

w komórce, „zabity”-pozbawiony jakiegoś genu

odpowiadającego za proliferację)

• Szczepienia na dany sezon chronią jedynie przed typem

wirusa, który wchodzi w skład szczepionki lub przed blisko
spokrewnionymi

• Szczepienia nie chronią przed ptasią grypą i przed pandemią

(nigdy nie wiadomo jaki typ wirusa, jaki mutant wywoła

pandemię).

• Zmniejszają jednak ryzyko podwójnego zakażenia wirusem

grypy ludzkiej i ptasiej (co mogłoby doprowadzić do
powstania mutanta, nowego typu wirusa zdolnego do

wywołania pandemii)

W ostatnim roku rzekomą pandemię grypy wiązano

głównie z wirusem grypy ptasiej podtypu A/H5N1/

Zanamivir - do leczenia i profilaktyki

Oseltamivir

– do leczenia, okazał się skuteczny

przeciwko ptasiej grypie

Czy szczepionki przeciw chorobom wirusowym

(a także bakteryjnym) są bezpieczne ?

• Bardziej bezpieczne są szczepionki zawierające drobnoustroje

inaktywowane (są jednak mniej immunogenne od atenuowanych)

• W rzadkich przypadkach obserwowano rewersję zjadliwości

atenuowanego wirusa poliomyelitis (rok 1970, Dominikana),

świnki szczepu Urabe Am9 i innych – wynik upośledzonej

odporności tych osób (?)

• Działania niepożądane mogą wywoływać adiuwanty* i substancje

konserwujące

*

adiuwanty

-

nieswoiste modulatory zwiększające naturalne

zdolności antygenu do wywołania odpowiedzi immunologicznej

(spowalniają uwalnianie antygenu, aktywują limfocyty:
wodorotlenek/ fosforan glinu, LPS, liposomy i polimery, emulsje
olejowe, cytokiny)

Szczepionka

Podejrzewany związek

ze szczepieniem

Wyniki badań

Czterowalentna
szczepionka rotawirusowa
(RRV-TV)

Wgłobienie jelit

Potwierdzono związek, wycofana

Szczepionka doustna Polio

Rewersja zjadliwości, poszczepienne
poliomyelitis

Potwierdzono dla typu 2 i 3 wirusa w
pierwszych szczepionkach; obecnie
nie stosowana

Skojarzona p-odrze,
różyczce i śwince

Przewlekłe zapal. jelita grubego;
autyzm

Wykluczono związek przyczynowy

Rekombinowana szcz. p-
wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B

Zespoły demielinizacyjne i
autoimunizacyjne

SM, toczeń

rumieniowaty, reumatoidalne
zapalenie stawów

Brak danych potwierdzających
związek; szerokie badania w toku

Szczepionki produkowane
w zarodkach kurzych (p-w
odrze, różyczce i żółtej
febrze)

Zanieczyszczenie wirusem ptasim

Wykazano małą aktywność odwrotnej
transkryptazy

wirusowej, bez wpływu

na bezpieczeństwo szczepionek

Szczepionka p-grypie, typ
A/New Jersey

Zespół Giullaina Barrego

1 przypadek/mln szczepionych;
obecnie nie stosuje się tego serotypu

Pełnokomórkowa szcz. p-
krztuścowi; p-grypie

Astma, zaostrzenie choroby
oskrzelowo-

płucnej

Niektóre szcz. aktywują odpowiedź
typu Th2, jednak w bad. epidemiol. nie
wykazano związku z alergią

Szczepionki BCG, DTP,
ospa wietrzna, hemofilus
influenzae typ b
(niemowlęce)

Cukrzyca typu pierwszego

Wykluczono związek przyczynowy w
badaniach epidemiologicznych

Obecny stan wiedzy na temat powikłań poszczepiennych

• Większość obecnie stosowanych szczepionek uzyskuje

się z hodowli ludzkich diploidalnych linii komórkowych:

-

Fibroblastów

-

Niektóre są produkowane w hodowlach fibroblastów

zarodków kurzych

-

Komórek nerek małp

-

Zarodkach kurzych

-

W drożdżach

Systemy komórkowe do produkcji szczepionek

wirusowych

• Wyjściowe kultury (klonowane z jednej komórki, namnożone w

większych ilościach i bankowane) stanowią

zasób komórek

matecznych

• Z odbankowanych komórek zakłada się hodowlę na większą

skalę uzyskując

bank komórek produkcyjnych

(część

ponownie zamraża się dla zachowania zapasu komórek
produkcyjnych)

System banków komórkowych można stworzyć tylko dla komórek,

które są zdolne dzielić się w nieskończoność, albo przynajmniej w
ograniczonym zakresie (human diploid cells, HDC, np. fibroblasty
ludzkie MRC-5, WI-38)

Charakterystyka systemów komórkowych

Próbki z obu banków (mateczne i produkcyjne) poddaje

się wszechstronnej kontroli:



Za pomocą testów serologicznych i cytogenetycznych

wykonuje się identyfikację komórek



Bada się mutagenność i genotoksyczność– testy in vitro i
in vivo



Bada się ewentualną kontaminację bakteryjną – testy
bakteriologiczne



Wykonuje się testy na obecność wirusów – złożone

Testy na obecność wirusów:



Inokulacje komórkami zarodków kurzych dla wykazania
zakaźności



Iniekcje zwierzętom doświadczalnym w celu wykazania
zakaźności lub wywoływania przeciwciał przez ewentualne
wirusy



Testy na obecność specyficznych polimeraz wirusowych



Bezpośrednie sprawdzanie obecności wirusów z użyciem
mikroskopii elektronowej, metody HIS/FISH

Systemy komórkowe do produkcji

szczepionek i procedury postępowania

Linie komórkowe

Zasób komórek
matecznych

(master cell bank)

Kwarantanna
dostawców komórek
pierwotnych

Testowanie w kierunku:
potwierdzenia linii, mutagenności,
nieobecności mykoplazmy, bakterii,
wirusów

Testowanie w kierunku:
potwierdzenia nieobecności
i nosicielstwa bakterii
chorobotwórczych i wirusów

Zasób komórek
produkcyjnych

(working cell bank)

Pobieranie materiału i
zakładanie hodowli
pierwotnych

(primary

cultures)

Komórki pierwotne

Drobnoustroje

(wirusy)

Zasób wirusów matecznych

(master seed)

Kontrola identyczności, wykazanie
nieobecności mykoplazmy, bakterii,
wirusów zanieczyszczających

Zasób wirusów
produkcyjnych

(working seed)

Podłoża i inne niezbędne substancje

oraz materiały

Sprawdzanie jałowości

(kwarantanna)

Analiza identyczności,
sterylności, specyfikacje
(opis szarż),

testy „zwalniające”

Wyniki testów:

materiał zwolniony

• kilkustopniowy system kolekcji komórek

i drobnoustrojów oraz kwarantanna

są niezbędne dla zapewnienia właściwej

jakości zarówno materiałów wyjściowych,
jak i ostatecznego produktu tj. szczepionek

Proces produkcyjny

Założenie hodowli komórkowej

Zaszczepienie i namnożenie wirusów

Zbiór oraz oddzielenie komórek

Oczyszczanie wstępne oraz zatężanie

Oczyszczanie główne

Oczyszczanie ostateczne

Formułowanie

Stabilizowane

Porcjowanie

Pakowanie

inaktywacja

liofilizacja

Wymagania wobec szczepionek (idealnych)

• Wysoka immunogenność (indukowanie odporności

najlepiej w 100% po jednorazowym podaniu)

• Odporność utrzymująca się przez całe życie

• Brak efektów toksycznych (samej szczepionki i adiuwantu)

• Łatwość podania (najlepiej doustna, donosowa)

• Akceptowalna cena wytworzenia

IMMUNOTERAPIA NIESWOISTA obejmuje:

preparaty immunostymulujące i cytokiny, komórki LAK
(lymphokine activated killer),

monocyty, komórki

dendrytyczne (DC).

IMMUNOTERAPIA SWOISTA obejmuje:

„szczepionki” antynowotworowe (cancer vaccines)

przeciwciała monoklonalne

limfocyty (głównie limfocyty T)

Szczepionki przeciwnowotworowe/Immunoterapia

nowotworów

Immunoterapia nieswoista

Komórki LAK

-

duże dawki IL-2 stymulują prekursory komórek LAK

(limfocyty) do proliferacji.

Odzyskiwane z krwi, namnaża się i ponownie aplikuje chorym.

Skuteczność tej terapii badano w stosunku do czerniaka, raka nerki
i wątroby jednak nie okazała się ona specjalnie efektywna.

Monocyty

-

źródło komórek fagocytujących - makrofagów, które po

stymulacji in vitro (rekombinowanymi cytokinami, głównie INF-γ
i podaniu miejscowym wykazują lokalny efekt terapeutyczny.

Preparaty immunostymulujące i cytokiny

Celem jest wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej chorego.

Levamisol

– lek immunostymulujący, którego skojarzenie z chemioterapią

5-FU (5-

fluorouracyl) wybitnie obniżyło remisje nowotworów u pacjentów

po resekcji guza okrężnicy

BCG

(bacille Calmette Guerin)

– preparat atenuowanych prątków

gruźlicy; stosowany w nowotworach pęcherza

IFN-

α

– wykorzystywany w leczeniu od 1986 r.; skuteczny w schorzeniach

tj. białaczka włochatokomórkowa, przewlekła białaczka szpikowa, mięsak
Kaposiego, czerniak, nowotwory nerki

IL-2

– zarejestrowana w 1992 r. przez US. FDA; stosowana w leczeniu raka

nerki i czerniaka złośliwego

Inne zastosowanie cytokin w immunoterapii nowotworów- działanie
ochronne ograniczające niepożądane efekty wywoływane chemio- i
radioterapią (głównie ich destrukcyjny wpływ na czynność szpiku
kostnego pacjenta) :

G-CSF

(granulocyte colony-stimulating factor)

– pobudzający

proliferację granulocytów w szpiku

GM-CSF

(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

–

pobudzający proliferację granulocytów i makrofagów w szpiku

IL-11

– pobudzająca powstawanie płytek krwi

Erytropoetyna

– pobudzająca regenerację erytrocytów

Immunoterapia nowotworów

• Immunoterapia swoista

-

indukcja swoistych mechanizmów

odporności (przy trwającej już chorobie)

• Polega na podawaniu autologicznych lub allogenicznych,

odpowiednio spreparowanych (np. napromieniowanych)

komórek nowotworowych lub ich ekstraktów (często +BCG)

• Mogą być najbardziej skuteczne w przypadku nowotworów o

dobrze zdefiniowanych antygenach (czerniak); w Kanadzie

dopuszczono szczepionkę „Melacin” – z 2 linii czerniaka,
testowana jest inna CancerVax

Komórki dendrytyczne - cztery etapy różnicowania

1. Prekursorowe komórki dendrytyczne – obecne w szpiku,

2. Niedojrzałe komórki dendrytyczne – obecne w narządach
nielimfatycznych, gotowe do kontaktu z obcym antygenem
i przeniesienia go do narządów limfatycznych,

3. Migrujące komórki dendrytyczne – obecne w limfie i krwi,

4. Dojrzałe komórki dendrytyczne – obecne w narządach limfatycznych,
przygotowane do prezentacji antygenu związanego w trakcie pobytu
w narządach nielimfatycznych.

W różnicowaniu i proliferacji DC biorą udział m.in. GM-CSF, TNF-α, oraz
IL-

4, natomiast hamuje ich aktywację IL-10. DC fuzjowane z komórkami

nowotworowymi, transfekowane genami antygenów nowotworowych
mogą wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną.

PREKURSORY

SZPIKOWE

NIEDOJRZAŁE

(mielolimfoidalne

FcγRI, FcγRII

CD68, CCR1

CCR4, CCR5

CXCR4

WELONOWATE

CD80



CD83



CD86



CCR7



DOJRZAŁE DCs

CD54, CD58

CD80, CD86

CD83, CD40L

DC-LAMP

CCR7

ZMIANA FENOTYPU KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W TRAKCIE DOJRZEWANIA

Krew

NIEDOJRZAŁE DCs
„wartownicy spokoju
immunologicznego”

Tkanki

Narządy

limfatyczne

Naczynia

limfatyczne

Dojrzewające po
kontakcie z
antygenem

Do kontaktu komórek dendrytycznych z antygenami dochodzi w nabłonkach i tkance
łącznej większości narządów, skąd antygeny są transportowane naczyniami
limfatycznymi doprowadzającymi do węzłów chłonnych, tam są prezentowane
limfocytom T.

Tylko dojrzałe DC indukują odpowiedź immunologiczną.

Ze względu na funkcje, miejsce występowania, zestaw antygenów,
produkcję cytokin wyróżnia się:

1.

mieloidalne komórki dendrytyczne (MDC)

: CD11c+, CD123

dim

, CD1c+

(BDCA-1+), CD141+ (BDCA-

3+), z silną ekspresją antygenów HLA-DR;

zdolne do rozpoznawania, przetwarzania i prezentacji antygenów;
znajdowane są w różnych tkankach organizmu

2.

plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (PDC)

, CD11c-, CD123

bright

,

CD303+ (BDCA-2+), CD304+ (BDCA-

4+); ze słabą zdolnością

przetwarzania i prezentacji antygenu, będące głównym producentem
interferonu α (IFNα) w organizmie; mogą aktywować odpowiedź
antywirusową i antynowotworową

3.

grudkowe komórki dendrytyczne (FDC)

,

w grudkach chłonnych,

węzłach chłonnych, śledzionie; nie mają zdolności do migracji
i przetwarzania antygenów, zapobiegają apoptozie limfocytów B,
pobudzają interakcje między komórkami i ich stymulują ich proliferację

Komórki nowotworowe

, przeciwko którym przygotowywana jest

szczepionka, powinny prezentować określone antygeny:

1. specyficzny antygen nowotworowy TSA (Tumor Specific Antigen),
np. białko chimeryczne bcr-abl występujące w przewlekłej białaczce
szpikowej, PSA (prostate specific antigen) w raku stercza;

2. antygen związany z nowotworem TAA (Tumor Associated
Antigen), np. związane z różnymi nowotworami geny Ras, p53
występujący w guzach litych (np. raku piersi), gen MAGE-1 związany
z czerniakiem.

Komórki DC jako szczepionka powinny zawierać antygen TSA lub
TAA konkretnego pacjenta.

Metody uzyskania komórek dendrytycznych jako „szczepionek”
dla celów immunoterapii

Trzy podstawowe źródła DC stosowane obecnie to:

1. Monocyty uzyskane drogą leukaferezy (separacji komórek
jednojądrzastych z krwi obwodowej), różnicowane do mieloidalnych
komórek dendrytycznych (MDC) przy pomocy GM-CSF i IL-4 (lub IL-13)

2. Hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+ uzyskane drogą
leukaferezy, różnicowane do komórek dendrytycznych in vitro przy
pomocy GM-CSF I TNF-

α (uzyskuje się mieszaninę śródmiąższowych

komórek dendrytycznych i komórek Langerhansa)

3. Bezpośrednia izolacja komórek dendrytycznych z krwi (wirowanie
w gradiencie gęstości, izolacja na kolumnach immunomagnetycznych);
w efekcie - mieszanina plazmocytoidalnych i mieloidalnych (PDC+ MDC).

DC uzyskane każdą z metod mogą stymulować antygenowo specyficzną
odpowiedź limfocytów T (mechanizm nie jest do końca poznany).

Dojrzewanie DC

(uzyskanie komórek zdolnych do prezentacji antygenu,

przebiega w hodowlach

wzbogaconych w mediatory prozapalne:

interleukiny (IL-

1β, IL-6), interferony (IFNα/β, IFNγ), MCM (Monocyte

Conditioned Medium), TNFα, PGE2 (Prostaglandin E2); chemokiny;
kompleksy immunologiczne

Komórka DC staje się aktywną (prezentująca antygen) po ekspozycji
cząsteczek MHC na antygen i wprowadzeniu go do wnętrza komórki (tzw.
pulsowanie DC). Ważnym etapem jest wybór antygenu nowotworowego,
przy czym powinien to być antygen krytyczny dla wzrostu i przeżycia
nowotworu.

W preparatyce szczepionek z komórek dendrytycznych wykorzystywane
są zarówno określone epitopy, antygeny związane z guzem lub całe
komórki nowotworowe

Antygeny wprowadzanego do komórki dendrytycznej:

1. peptydy, proteiny/rekombinowane białka;

2. zabite komórki nowotworowe, lizaty komórek nowotworowych;

3. kompleksy antygen-

przeciwciało;

4. RNA, DNA (z nowotworu

– pojedynczy gen lub cały genom guza);

5. białka idiotypowe (monoklonalne immunoglobuliny zawierające
specyficzne sekwencje białkowe w regionach zmiennych, w miejscach
wiążących antygen, produkowane przez komórki nowotworowe);

6. fuzje DC-

komórka nowotworowa;

7. ciałka apoptotyczne komórek guza;

8. wektory wirusowe;

9. Antygeny nienowotworowe (VEGF, VEGFR).

Szczególny rodzaj szczepionek przeciwnowotworowych
stanowią szczepionki uzyskane z komórek nowotworowych
zmienionych genetycznie

– temat kolejnego wykładu

„Terapii Genowej”