SELEKCJA MIKROORGANIZMÓW

Najczęściej izolujemy mikroorganizmy z gleby, która jest bardzo bogata w mikroby. Selekcja

często jest powiązana z ulepszeniami:

• mutacje genetyczne

• zmiany w środowisku (manipulacje warunkami hodowli) – doprowadza sie do

optymalizacji hodowli, to jest już pułap możliwości, dalej trzeba już wprowadzić zmiany

genetyczne w organizmach

Mutagenizacje można przeprowadzić przez:

- Promieniowanie UV – śmiertelność organizmów wynosi ok. 90%

- Mutagen chemiczny – etylenoimina

Stosuje sie na przemian czynnik chemiczny i promieniowanie

Po mutagenizacji prowadzi sie hodowle, otrzymujemy organizmy o zmienionym genotypie.

Często otrzymujemy organizmy zdolne do nadprodukcji (auksotrofy), ale są „upośledzone” w

innym miejscu szlaku metabolicznego. Aby oddzielić auksotrofy od prototrofów musimy

przeprowadzić selekcje.

Wysiewamy mieszankę po mutagenizacji na podłoże minimalne z antybiotykiem, tylko

prototrofy sie rozwijają, ale antybiotyk powoduje śmierć tych komórek, auksotrofy nie rosną,

antybiotyk nie działa na te komórki. Hodowla jest przenoszona na podłoża pełne, auksotrofy,

które ostały sie działaniu antybiotyków, mogą sie rozwijać, jako antybiotyku najczęściej

używa sie penicyline – czynnik zabijający rosnące komórki. Po hodowli można wysiac

auksotrofy na podłoże minimalne, one oczywiście nie wyrosną, ale pozwala to upewnić sie,

że w hodowli nie ma już prototrofów

Jak ustalamy wymagania żywieniowe auksotrofów?

Wysianie na podłoże minimalne z hydrolizatem kazeiny (źródło aminokwasów), jeśli

nasze auksotrofy rośna, to wiemy, że wymagają aminokwasów, sprawdzamy jakich

Podłoże minimalne z witaminami – tak samo

Podłoża z hydrolizatami RNA (mogą być drożdżowe), jeśli auksotrofy rosną, to znaczy,

że należy im dostarczyć zasady, lub całe nukleotydy

Selekcja mutantów indukcyjnych z nadprodukcja enzymów o znaczeniu przemysłowym.

Podział enzymów:

• anaboliczne (biosyntezy)

• kataboliczne (rozkładu)

enzymy biosyntezy:

regulowane za pomocą sprzężenia zwrotnego

mutanty zdolne do ich nadprodukcji nie produkują represora lub nie jest on przez nie

rozpoznawany

enzymy kataboliczne:

ich produkcja może być kontrolowana przez trzy mechanizmy:

1.indukcje – polega na tym, że mikroorganizm produkuje enzym tylko w obecności induktora, najczęściej substratu

2. sprzężenie zwrotne – synteza enzymu jest kontrolowana przez produkty reakcji

rozkładu albo przez analogi tych związków

3. represje kataboliczna – synteza enzymu jest hamowana, gdy w środowisku jest

dostępne łatwo przyswajalne źródło węgla

Aby kontrolować produkcje enzymu można manipulowac składem podłoża:

- enzym indukcyjny – w podłożu powinien być induktor

- nie może być represora ani łatwo przyswajalnego źródła węgla, jednak efektywniejsze jest

izolowanie mutantów z nadprodukcja enzymu

- poszukuje sie mutantów, które zamieniają enzym indukcyjny na konstytutywny

hodowla w chemostacie w warunkach, w których induktor jest czynnikiem

ograniczającym o stężeniu poniżej indukcji

np. izolacja Escherichia coli z B-galaktozydaza jako enzymem konstytutywnym,

induktorem była laktoza o niskim stężeniu, które nie gwarantowało indukcji, przeżyć

mogły tylko te organizmy, które produkowały enzym konstytutywny

przenoszenie populacji mikroorganizmów z podłoża bez induktora na podłoże z

induktorem, lag-faza organizmów z enzymem indukowanym

wykorzystanie podłoża z zasadniczym źródłem węgla jako substratem, który jest złym

induktorem, przeżywają organizmy, dla których to źródło węgla nie jest induktorem

stosowanie substratów chromogenowych (substrat, który w wyniku reakcji zmienia

barwe) na podłożu stałym, w wyniku reakcji enzym powoduje zmianę koloru substratu,

substrat chromogenowy nie może być induktorem np. E. Coli na podłożu z glicerolem, wyrosły kolonie spryskiwano nitrofenylogalaktozydem, kolonie, które produkowały B-galaktozydaze barwiły sie na żółto (nitrofenylogalaktozyd jest substratem dla galaktozydazy, odczepia sie nitrofenol)

- izolacja mutantów produkujących enzym w obecności represora (niewrażliwych na

sprzężenie zwrotne)

głównie Bacillusy produkujące proteazy

aminokwasy są represorami, ale także hamują sporulacje

izoluje sie szczepy zdolne do sporulacji w obecności aminokwasów

- izolacja mutantów odpornych na represje kataboliczna:

poszukiwanie rewertantów wśród mutantów, które utraciły zdolność syntezy danego

enzymu

hodowla w chmostacie mieszaniny po mutagenizacji w obecności substratu dla danego

enzymu i represora katabolicznego (np. laktoza jako substrat, glukoza jako represor),

nastąpi dominacja organizmów, które mogą wykorzystywać oba źródła węgla

Selekcja mikroorganizmów z nadprodukcja metabolitów wtórnych

- trudna, bo nie do końca są poznane mechanizmy produkcji tych metabolitów

- metody izolacji bazują na eksperymentach

- wykorzystuje sie izolacje mutantów auksotroficznych, wśród których poszukuje sie

organizmów z nadprodukcja metabolitów wtórnych np. antybiotyków

Ulepszanie szczepów

- hybrydyzacja (krzyżowanie szczepów) – wykorzystywana po mutagenizacji, manipulując na

zmianę mutagenizacja i składem podłoża można otrzymać organizmy o maksymalnej

wydajności, krzyżując szczepy z różnych linii otrzymujemy nowe kombinacje genów

- konstruowanie sztucznych kombinacji genów metodami inżynierii genetycznej

- można uzyskać organizmy, które efektywniej przekształcaja substrat w produkt, organizmy

o zmienionych wymaganiach żywieniowych lub zmienionej morfologii wzrostu

- w wyniku manipulacji genetycznych mogą powstawać słabe szczepy, które będą wypierane

przez szczepy dzikie, natomiast po hybrydyzacji powstają szczepy silniejsze

- hybrydyzacja występuje naturalnie w środowisku np. w komórkach somatycznych grzybów

- fuzja protoplastów (osobniki pozbawione ściany komórkowej, która jest bariera dla

hybrydyzacji), w wyniku hapliodyzacji dochodzi do podziału cech i wytworzenia naturalnych

szczepów o korzystnych cechach (wymagania żywieniowe, morfologia wzrostu, efektywność

przekształcania substratu.