Analiza żywności mikrobiologicznej

Cele analizy

• Ustalenie poziomu ogólnej liczby drobnoustrojów saprofitycznych

• Określenie stanu sanitarnego żywności za pomocą wskaźników bakterii

• Badania obecności bakterii chorobotwórczych w celu oznaczenia, czy badana żywność nie zagraża zdrowiu konsumenta

Analiza:

• Pobieranie próby i opis cech zewnętrznych oraz organoleptycznych

• Przygotowanie próby do analizy

• Preparat mikroskopowy

Pobieranie próby:

• Pobrana próba powinna być reprezentatywna dla całej partii badanego materiału

• Próba średnia – np.: różne opakowania jednostkowe

• Pobrana w warunkach aseptycznych do jałowego naczynia

• Materiał sypki 100g, płynny 10cm³ (małe opakowania), 500g/500 cm³ (duże opakowania)

• Cechy sensoryczne – wygląd, zapach, konsystencja

• Sprawdzenie stanu i szczelności opakowania danego produktu (w chłodniach mogą być przechowywane do 4h, konserwy, produkty suche mogą być przez trochę przechowywane w temperaturze pokojowej.)

• Właściwe pobranie próby warunkuje brak zakażenia

Przygotowanie

• Rozcieńczenie (przygotowanie do posiewu (10 bądź 50g w 10-krotnie większej ilości rozpuszczalnika))

• Rozdrabnianie

• Płyn fizjologiczny, 0.1% wodą pektonową, 2% roztwór cytrynianu sodu (pierwsze rozcieńczenie – służy do dalszych rozcieńczeń)

• Warunki aseptyczne

Ocena w preparatyce mikroskopowej

- preparaty odciskowe, barwne (ryby, wędliny)

- ilość mikroorganizmów żywych i martwych

Oznaczanie ogólnej liczby mikroorganizmów saprofitycznych

• Metoda płytkowa (wykorzystanie szalek Petriego z odpowiednim podłożem)

• Badania przetrwalników (10 min ogrzewanie w 80 ) – unieszkodliwienie wegetatywnych mikroorganizmów

• Oznaczanie drożdży i pleśni – odżywki selekcyjnie

• Po 2 powtórzenia z każdego rozcieńczenia

Oznaczenie konkretnych grup coli:

- pożywki selektywne i różnicujące zawierające laktozę:

• Podłożą BLB – żółć i zieleń brylantowa lub siarczan sodowo-laurynowy

• Podłoże Eijkmanta – indykatory pH (purpura bromokrezolowa)

- potwierdzenie obecności bakterii pochodzenia kałowego:

• Posiew do pożywki BLB (żółć i zieleń brylantowa + laktoza), inkubacja 24/48h, temperatura 44 (metoda fermentacyjno-probówkowa)

• Posiew do wody peptonowej, inkubacja 24-48h w 44 dla stwierdzenia zdolności bakterii do wytwarzania indolu z tryptofanu.

Oznaczanie gronkowców chorobotwórczych

• Selektywne pożywki stałe Baird-Barkera (telluryn potasu redukuje się do telluru – czarny metaliczny połysk + lecytyna ( z żółtka jajka) hydrolizowana przez lipazy z wytworzeniem kwasów tłuszczowych, które dają strefę zmienionego podłoża)

• Aktywność katalazy – hodowla na agarze odżywczym 37 18-24h, hodowle zalewa się H2O2 i wydzielają się pęcherzyki gazu

• Aktywność koagulaty – inkubacja hodowli z udziałem liofilizowanej krwi królika. Pod jej wpływem powstają skrzepy – wynik pozytywny.

Szybszy test

Cząsteczki lateksu powleczone przeciwciałami otrzymanymi z surowicy krwi królika immobilizowanego.

Enterotoksyna – antygen

Test ten nie wymaga izolacji czystych kultur

Wykrywanie beztlenowych laseczek przetrwalnikujących redukujących siarczany IV

• Szok termiczny – 10 min - 80

• Hodowla w warunkach beztlenowych namnażającej, nieselektywnej pożywce wrzoska (zmętnienie, pęcherzyki gazu – wynik pozytywny, który świadczy o obecności względnych beztlenowców

• Barwienie gram – laseczkami +

• Wykluczenie względnych beztlenowców – hodowla na podłożu stałym w warunkach tlenowych

• Podłoże selekcyjne Wilsona-Bloura – siarczan IV sodu, związki żelaza FE3+ (jeśli wzrost mikroorganizmów występuje – wytrąca się siarczan żelaza – czarne zabarwienie)

Clostridium perfingens

- TSC-agar (podłoże tryptozo-siarczanowe z cykloseryną)

- Fluorocult TSC (C-cykloseryna (inhibitor wzrostu mikroflory towarzyszącej), związek fluorogenny – MIF – fosforan 4-metyloumbeliferylu)

- Clostridium botulinum – badania na zwierzętach

Wykrywanie bakterii z rodzaju Salmonella

- Salmonella bardzo inwazyjna

a. przed namnażaniem

- warunki selekcyjne

- próbka (25g lub 25cm³) + 225cm³ zbuforowanej wody peptonowej, inkubacja 16-20h w 37

b. namnażanie selektywne ( równolegle w 2 pożywkach)

1. pożywka Rappaport VAsilia dis – 1cm³ hodowli + podłoże, inkubacja w 42 stopniach, 18-24h

2. pożywka z kwaśnym selenianem sodowym, 16cm³ hodowli + pożywka, inkubacja w 37 stopniach, 18-24h

c. posiew na pożywkach różnicujących

• Składniki selektywne (zieleń brylantowa, sole kwasów żółciowych) + laktoza, barwniki (czerwień fenylowa, błękit tymidylanowy) – pozwalają zobaczyć produkty fermentacji laktozowej

• Inkubacja w 37 stopniach 24-48h

• Salmonella nie fermentuje laktozy

d. identyfikacja

• Selekcyjna : 5 charakterystycznych kolonii z każdej płytki

• Przesiew na agar odżywczy

• Inkubacja 37 stopni 24-48h

e. badania biochemiczne i serologiczne

gotowe testy

• System salmosys

- podłoże nieselektywne

- 7-8h inkubacji w buforze

- następnie wrzuca się tabletki, które przez 30 min zmieniają warunki na selektywne (mikroorganizmy powoli adoptują się do nowych warunków)

• System API

- deaminaza fenyloalaninowa

- beta-galaktozydazy

- beta-ksylozydazy

- specyficzna ligaza

- po 2h mamy odpowiedź

Salmonella Rapid Test – w 2 probówkach z podziałkami, z 2 podłożami: górnej, selekcyjnej i dolnej różnicującej. Salmonella „idzie” do góry, bo poczebuje tlenu – zmiana zabarwienia na seledynowy wykazuje obecność bakterii

Pożywka MSRVM (pożywka stała, zmodyfikowany agar, wykorzystuje salmonellę. Łatwość izolacji czystej hodowli.)

Mikrobiologiczna kontrola wody

• Drobnoustroje chorobotwórcze rozmnażają się w H2O

• Wraz z upływem czasu maleje ich liczba

• Trudne jest badanie H2O w kierunku wszystkich organizmów chorobotwórczych

• Najczęstsze zanieczyszczenia – fekalne

• Mikroflora jelita człowieka i zwierząt – E. coli (10⁷-10⁸) paciorkowce kałowe, Enterococcus faecalis, beztlenowe przetrwalnikujące Clostridium perfingens

Wskaźnikami zanieczyszczeń feralnych powinny być bakterie spełniające następujące kryteria:

• Muszą stale występować w kale ludzi i zwierząt w liczbie znacznie przewyższającej liczbę organizmów chorobotwórczych

• Ich liczba powinna być proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody

• Nie mogą występować w czystej wodzie

• Nie mogą się namnażać w środowisku wodnym

• W wodzie powinny przeżywać dłużej niż patogeny chorobotwórcze

• Nie powinny zmieniać sowich cech fizjologicznych pod wpływem środowiska zewnętrznego

• Ich wrażliwość na środki stosowane do dezynfekcji wody powinna być obliczona do wrażliwości patogenów

• Metody ich wykrywania powinny być proste i szybkie

Badanie E. coli jako wskaźnika sanitarnego wody:

• Przetrwalność E. coli zależy od temperatury 4 stopnie – 48 dni, 20 stopni – 20 dni

• Gr. Coli, E. klebsiella, Enterobacter, Citrobacter

• Ocean stanu sanitarnego wody : bakterie grupy coli, bakterie grupy coli typu fekalnego, coli termotolerancyjne

• Problem zróżnicowania E. coli pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego – różne techniki – elektroforeza, pulsacyjna analiza DNA, analiza wrażliwości na antybiotyki

• Duże skupiska ludzi – stąd zanieczyszczenia

Miano coli – najmniejsza ilość wody wyrażona w cm³, w której stwierdza się obecność pałeczek z grupy coli.

1 pałeczka w 100cm³ = miano 100

1 pałeczka w 10cm³ = miano 10

Im woda jest bardziej zanieczyszczona, tym miano jest mniejsze

Inne organizmy wskaźnikowe:

1. Paciorkowce kołowe – Enterococcus fekalia, E. feacium

• W wodzie giną szybciej niż E. coli, ale później niż patogeny (świeże zanieczyszczenia)

• Większa odporność na zanieczyszczenia, wysoka temperatura, środki dezynfekcyjne

• Nie mają zdolności do wytwarzania katalazy

• Zdolność wzrostu w temperaturze 45 stopni w obecności soli, żółci oraz azydku sodu

• Zanieczyszczenia rolnicze

2. Clostridium perfingens

• Obecność w wodzie tych mikroorganizmów świadczy o starym zanieczyszczeniu (mogą przetrwać w wodzie długi czas)

• Odporne przetrwalniki

• Dobry wskaźnik skuteczności procesów uzdatniania wody (sedymentacja, filtracja)

• Badania wód studziennych

• Zdolność redukcji siarczanów do siarczków

• Odporne na środki dezynfekcyjne

3. Pseudomonas aeruginosa

• Duża odporność na czynniki dezynfekcyjne i antybiotyki

• Wytwarzają barwnik pyocygamine (zielona)

• Ostatnio ich liczba wzrosła, bo używamy zbyt dużo antybiotyków

4. Alternatywne mikroorganizmy – określają jednoznaczne pochodzenia zanieczyszczeń

• Rinodococcus copraphilus

• Streptococcus

• Bifadobacter

• Fagi

Ocena wody

1. Woda użytkowa (każda powinna podlegać kontroli)

• Woda produkcyjna

• Woda do mycia (zmiękczenie)

• Woda do użytku technicznego

2. Wymagania

• Woda w instalacjach zakładów spożywczych (klimatyzacja) – potencjalne zagrożenie bakteriologiczne

Legionella pneumofila – wdychanie aerozoli

Badanie wody na 2 razy w roku (ISO 11731)

- myjnie samochodowe, szpital

- taru, gdzie tworzy się aerozol

- zapobieganie: zmiękczanie wody, niedoprowadzenie do korozji

c. pobieranie wody

• Sterylnie zamknięte naczynie z szeroką szyjką

• Próba wody nie więcej niż ¾ objętości naczynia

• Woda chlorowana +0.1cm³ , 10% tiosiarczanu sodowego na 100cm³ wody – wiąże resztki chloru które mogłyby przereagować

• Dezynfekcja wylotu kranu, rury

• Opis próby (miejsce, godzina, źródło

• Przechowywanie: do 2h w temperaturze otoczenia, do 6h w zamrażarce

d. ogólna liczba drobnoustrojów

• Metoda płytkowa

• Podłoża – agar odżywczy, agar z glukozą, z ekstraktem drożdżowym, bulionem z żelatyną

• Inkubacja równoległa w 20 (organizmy wodne) i 37

• Jej wzrost może świadczyć o dopływie substancji odżywczych

5. Oznaczanie bakterii z grupy coli

• Metoda filtrów membranowych (przesączanie pod ciśnieniem wodnym prze filtry) – badanie wody o małej zawartości mikroorganizmów

• Fermentacyjna metoda próbkowa – podłoże LPB (laktoza, pepton, purpura bromokrezolowa, NaCl, fiolet zmienia się na żółty – duża zawartość mikroorganizmów

Identyfikacja grupy coli

1. Badania wstępne

• Pożywka LPB, inkubacja w 37 stopniach przez 24-48h, fermentacja laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu

• Wynik pozytywny

2. Badania potwierdzające

• Endoagar, inkubacja w 37 stopniach przez 24h, wykorzystanie aldehydu octowego (wynik pozytywny) e. coli rosną różowo lub metalicznie

3. Badania uzupełniające

• Pożywka laktozowa lub EPB, inkubacja w 37 stopniach przez 24-48h, wtórna fermentacja laktozy, barwienie grama, oksydaza cytochromu

Identyfikacja E. coli typu fekalnego

1. Badania wstępne (tak jak wyżej)

2. Badania potwierdzające: 2 podłoża BLB i endoagar, inkubacja w 44 stopniach przez 18-48h, fermentacja laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu

3. Badanie uzupełniające: sprawdzenie obecności acetylometylokarbinolu, wytwarzanie indolu, asymilacja podłoża Claria, inkubacja w 37 stopniach przez 24h

W nowoczesnych laboratoriach biochemicznych badanie wody jest uproszczone i składa się z następujących etapów:

1. Hodowla selektywna na podłożu z laktozy

2. Wysiew materiału biologicznego zakwalifikowanego jako próba dodatnia lub wątpliwie dodatnia na agar

3. Identyfikacja diagnostyczna API

Testy API (20E)

20 oznaczeń biochemicznych

- oksydaza cytochromowa

- redukcja azotanów do azotynów

- uwalnianie azotu z azotanów

W badaniach rutynowych wody w kierunku pałeczki E. coli można zwiększyć wiarygodność identyfikacji wykorzystując zdolność do wytwarzania enzymu beta-d-glukoronidazy

Nowa definicja bakterii gr. Coli:

- gr. Coli to bakterie fermentujące laktozę z wytworzeniem gazu

- bakteria E. coli wytwarza enzym beta-D-glukoronidaze oraz wytwarza indol z tryptofanu w temperaturze 44 stopniach.