35. Doskonalenie szczepów przemysłowych stosowanych w biotechnologii

Procesy biotechnologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów wyizolowanych bezpośrednio ze środowiska naturalnego na ogół przebiegają z wydajnością niewystarczającą, aby ich użycie na skalę przemysłową było opłacalne ekonomicznie Drobnoustroje pozyskane ze środowiska naturalnego prowadzą procesy biosyntezy lub biotransformacji z wydajnością nie wystarczającą zazwyczaj do opracowania ekonomicznego procesu technologicznego.

Aby wykorzystać potencjał biotechnologiczny tych mikroorganizmów, przeprowadza się modyfikację ich genotypu prowadzącą do uzyskania szczepów produkcyjnych mogących znaleźć zastosowanie w przemyśle

Pomimo kilkudziesięciu lat owocnego stosowania mutagenizacji do ulepszania szczepów przemysłowych nadal opiera się ona na pracochłonnej metodzie prób i błędów, wymagającej stosowania bardzo dużej liczby pojedynczych kultur. Nie można bowiem ustalić jednoznacznej korelacji między miejscem i rodzajem wywołanej mutacji a typem otrzymanego mutanta i ostatecznym efektem fizjologicznym. Można jednak, dzięki doświadczeniu, zoptymalizować procedurę poprzez dobór odpowiednich mutagenów optymalnych dawek, czasu działania, miejsca oddziaływania w cyklu komórkowych, a przede wszystkim poprzez dopracowanie kryteriów efektywnej selekcji pożądanych mutantów

• Modyfikację genotypu szczepu macierzystego, wyizolowanego z próbki środowiskowej i scharakteryzowanego taksonomicznie, prowadzi się na drodze:

• mutagenezy indukowanej in vivo

• Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej

• fuzji protoplastów komórek szczepów pochodzących od genetycznie różniących się przodków

1. Mutagenezy indukowane in vivo

Podział mutacji występujących w procesach biotechnologicznych.

• Spontaniczne- częstość mniejsza niż 10^-5. W przypadku nie korzystnych zmian mogą stanowić poważny problem technologiczny, zwłaszcza w hodowlach ciągłych. Możliwość ich wystąpienia zmusza do ciągłej preselekcji szczepów.

• Indukowane-wywołane czynnikami zewnętrznymi - mutagennymi (zwiększając ich częstotliwość od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy). Powstałe mutanty to mutanty indukowane.

Ulepszania szczepów - mutagenizacja

• Właściwości mutageniczne posiadają różnorodne związki chemiczne, np:

• iperyt azotowy wywołuje mutacje u Drosophila melanogaster

• kwas azotowy HNO2 powoduje mutacje w DNA

• barwniki akrydynowe

• analogi zasad azotowych

• nadtlenek wodoru i amoniak

• benzopiren - występuje na przykład w dymie papierosowym

• kolchicyna - alkaloid roślinny

Mutagenizacja prowadzi do modyfikacja genotypu drobnoustrojów

Czynniki mutagenne dzieli się na fizyczne i chemiczne. Czynniki te zwiększają częstotliwość powstawania mutacji od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy

Czyniki chemiczne i fizyczne wykorzystywane w doskonaleniu mikroorganizmów na drodze mutagenezy

Czynnik mutagenny	Sposób działania
Promieniowanie UV	powstanie dimerów pirymidynowych
Promieniowanie X	pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA
5-bromouracyl	analog tyminy, tworzy pary z adeniną i guaniną
2-aminopuryna	analog adeniny, tworzy pary z tyminą i cytozyną
Hydroksyloamina	hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeniną
N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna	synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i inne typy mutacji
Metanosulfonian metylowy Metanosulfonian etylowy	alkilacja puryn i pirymidyn
Oranż akrydyny	interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje błędy replikacji i mutacje typu insercja lub delecja
Kwas azotowy (III)	deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeniną

Etapy mutagenizacji:

• Penetracja mutagenu do komórki

• Oddziaływanie na DNA wywołujące niestabilne zmiany pierwotne

• Naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian wtórnych w DNA

• Stabilizacja mutacji powodująca utrzymanie się zmian w kolejnych pokoleniach

• Zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie się mutacji

Etapy selekcji mutantów:

• Wstępne testy- eliminacja szczepów mało przydatnych

• Dokładniejsza charakteryzacja szczepów wyselekcjonowanych

• Dobór optymalnych warunków hodowli i procesów dla najlepszych szczepów uzyskanych w etapach poprzednich.

2. Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej

• Hybrydyzacja naturalna - przekazanie informacji genetycznej z komórek dawcy do komórek biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek

• polega na wymianie homologicznych fragmentów DNA między chromosomami dawcy i biorcy

• w wyniku rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych otrzymuje się hybrydy o zmienionym genotypie

• Naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko !!!

• Podstawowe przeszkody utrudniające zajście hybrydyzacji naturalnej

• ściana komórkowa

• ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej

3. Fuzja protoplastów

Hybrydyzacja na drodze fuzji protoplastów (1972 r.)

• Rekombinacja zachodzi pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym

• Rekombinacja może mieć charakter międzygatunkowy

• Możliwość wymiany dużych fragmentów DNA

• Każda z hybrydyzujących komórek może pełnić rolę dawcy i biorcy

• Możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi obcy materiał genetyczny

Fuzja protoplastów jest najczęściej stosowaną metodą do dalszego ulepszania szczepów pochodzących z różnych linii mutacyjnych za względu na:

• zwiększenie wydajności produkcji

• ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych

• zwiększenie szybkości wzrostu

• zmiana przyswajalności różnych substratów

• zwiększenie oporności na substancje toksyczne

• zwiększenie oporności na bakteriofagi