OZNACZANIE BIAŁKA

Metoda biuretowa

Zasada:

Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych występujących
w cząsteczkach białek i peptydów (zbudowanych co najmniej z trzech reszt
α - aminokwasów).

W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja (przegrupowanie atomów) wiązań peptydowych -CO-NH- z wytworzeniem formy enolowej:

Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi Cu²⁺ tworzą dwa wiązania kowalencyjne
z atomami tlenu grup enolowych i cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje połączenie kompleksowe o zabarwieniu fiołkowoniebieskim.

Intensywność zabarwienia zależy od liczby wiązań peptydowych zawartych
w cząsteczce badanej substancji. Peptydy dają raczej zabarwienie czerwone, natomiast białka - intensywnie fioletowe. Powyższa zależność wykorzystywana jest do ilościowego oznaczania zawartości białka w roztworach metodą kolorymetryczną.

Odczynniki:

• roztwór albuminy o stężeniu 10 mg/cm³ ,

• odczynnik biuretowy (1,5 g CuSO₄ ·5H₂O, 6,9 g winianu sodowo-potasowego, 300 cm³ 10% NaOH-uzupełnić wodą dest. Do 1000 cm³).

Wykonanie:

Przygotować sześć czystych, suchych probówek i oznaczyć je kolejno od 0-5. W probówkach sporządzić po 1 cm³ roztworu wzorcowego albuminy wg tabelki . Następnie do wszystkich probówek wprowadzić po 4 cm³ odczynnika biuretowego, wytrząsnąć i pozostawić na 30 minut. Po tym czasie odczytać absorbancję przy 540 nm wobec próbki kontrolnej.

Nr probówki	0	1	2	3	4	5
wzorzec albuminy w cm3
woda w cm3
stężenie albuminy w mg/cm3	0	2,5	5	7,5	10	?
absorbancja

Wykreślić krzywą wzorcową metoda najmniejszych kwadratów i odczytać z niej stężenie albuminy w badanej próbce.