Małgorzata Ligęza

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA

POLIMERYZACJI- PCR

PCR (Polymerase Chain 

Reaction)

• Metoda amplifikacji-powielania 

łańcuchów DNA w warunkach 
laboratoryjnych, polegająca na 
sekwencji wielokrotnego 
podgrzewania i oziębiania próbki.

• Technika została wynaleziona w 1983 

roku przez Kary'ego Mullisa, za co 
otrzymał w roku 1993 Nagrodę 
Nobla.

Składniki mieszaniny 

reakcyjnej

• matrycowy DNA
• trifosforany deoksyrybonukleozydów
• startery (primery)
krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty 

DNA

komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących
się na obu końcach interesującego nas genu
• Termostabilna polimeraza DNA
polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus 

aquaticus 

polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis

• Reakcję PCR przeprowadza się w bloku grzejnym, 

który jest kontrolowany przez termocykler. Produkt 
reakcji ocenia się przez elektroforezę i barwienie 
bromkiem etydyny.

3 etapy reakcji PCR:

• Denaturacja dwuniciowego DNA
15-30s, 90-95

○

C

• Przyłączenie starterów 
30-60s, 50-60

○

C

• Elongacja 
różny czas trwania, 72

○

C

Wymienione etapy tworzą 1 cykl.

Etap I- 

Denaturacja dwuniciowego DNA

• W wysokiej temperaturze pękają 

wiązania wodorowe i podwójna 
helisa DNA rozdziela się na dwa 
pojedyncze łańcuchy. 

• W celu uzyskania tego efektu 

podnosi się temperaturę mieszaniny 
reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 
sekund.

Etap II-

Przyłaczanie starterów

• Tworzą się odcinki dwuniciowe, składających 

się z przygotowanych starterów 
(oligonukleotydów hybrydyzujących z końcem 
3` każdej nici,komplementarnych do sekwencji 
DNA oskrzydlających gen mający ulec 
namnożeniu) z matrycową cząsteczką DNA.

•  Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, 

ściśle określonej dla danej pary starterów 
(pomiędzy 45-60 °C).

Etap III-

Elongacja

• Właściwa synteza DNA i tym samym 

amplifikacja pożądanego genu.

•  Podwyższenie temperatury do około 72 °C 

powoduje rozpoczęcie się syntezy nici 
komplementarnej do matrycy. 

• Pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy 

dwie kopie DNA zawierające region, który 
chcieliśmy zwielokrotnić.

• Proces powtarza się, zwykle 

przeprowadza się od 20 do 40 cykli

• Ilość kopii DNA wzrasta wykładniczo
• Wydajność reakcji nie jest 100%-owa 

(niespecyficzne produkty)

• Niespecyficzne produkty są związane 

z powstawaniem lokalnych struktur 
drugorzędowych lub niespecyficznym 
łączeniu się starterów z matrycą

Eliminacja niespecyficznych 

produktów

• Optymalizacja warunków
• Dodanie DMSO (dimetylosulfotlenek) 

lub glicerolu

• Zastosowanie polimerazy TopoTaq
• Zastosowanie polimerazy typu hot 

start

Odmiany reakcji PCR-

RT PCR Reverse Transcriptase PCR

• Synteza DNA na 

matrycy 
dojrzałego mRNA 
przy pomocy 
odwrotnej 
transkryptazy. 

• Dzięki temu 

kopiowane są 
tylko egzony.

Odwrotna transkryptaza – struktura 
III-rzędowa

Odmiany reakcji PCR-

Real Time PCR

• Wprowadzenie do 

środowiska reakcji 
znakowanych 
fluorescencyjnie 
sond w celu 
określenia ilości 
matrycy użytej w 
reakcji oraz 
śledzenia ilości 
powstającego 
produktu.

Odmiany reakcji PCR-

Multiplex PCR

• Zastosowanie starterów dla różnych 

genów lub odmiennych fragmentów 
tego samego genu. Pozwala na 
jednoczesne wykrywanie DNA kilku 
patogenów. Szczególnie przydatny w 
genetyce sądowej i kryminalistyce.

Zalety metody PCR

• Sekwencja badanego genu nie musi być 

znana – wystarczy znajomość sekwencji 
oskrzydlających

• Startery nie muszą być komplementarne do 

matrycy w 100%

• Specyficzność – dobór odpowiednich 

starterów pozwala na amplifikację 
odpowiedniego odcinka

• Czułość – możliwe wykrycie nawet 

pojedynczej cząsteczki DNA

Cechy badania:
• Analiza liczby kopii 

wirusa/bakterii

• Możliwość śledzenia 

postępów leczenia

Co można wykryć:
Wirus opryszczki
Entero- i parvowirusy
Cytomegalia
HIV

Badania PCR w medycynie

Badanie ilościowe          Badanie 

jakościowe

Cechy badania:

•Identyfikacja materiału       
genetycznego wirusa/bakterii 
a nie przeciwciał

•Identyfikacja możliwa na 
wczesnym etapie zakażenia

Co można wykryć: 

Wirus różyczki

 Wirus hepatitis B i C

 Bakteria Salmonella

 Bakteria Ureaplasma

Inne zastosowania PCR

• Ustalanie ojcostwa
• Kryminalistyka 
• Ustalanie nosicielstwa zmutowanego 

genu

• Antropologia
• Diagnostyka preimplantacyjna

Bibliografia:

• Podstawy genetyki dla studentów i 

lekarzy, Gerard Drewa, Tomasz 
Ferenc, Elsevier Urban & Partner, 
Wrocław 2003, wyd. 2

• PCR wczoraj i dziś, czyli "stara 

śpiewka" w nowej aranżacji, Wojciech 
Bobela 

• Źródła internetowe