Metody wykrywania mutacji



Pozwalają na wykrycie osób z
wysokim ryzykiem zachorowania
na nowotwory czyli



bezobjawowych nosicieli mutacji.
Umożliwia to skuteczną i tańszą
profilaktykę.

Analizy Molekularne

Metody wykrywania

mutacji

Bezpośrednie
wykrywanie mutacji jest
najbardziej

swoistą

metodą
wykrywania zaburzeń w
obrębie  genu.  Umożliwia
rozpoznanie  nosicielstwa
mutacji  niemal  ze  100%
pewnością

Pośrednie

wykrywanie

mutacji jest metodą o nieco
mniejszej swoistości pozwala
natomiast
na

potwierdzenie

lub

wykluczenie

nosicielstwa

mutacji

wielu

przypadkach, w których nie
można
wykryć zmian bezpośrednio
w genach.



Krew obwodowa



Nasienie



Wymazy komórkowe



Mocz



Mleko



Plwocina



Kał



Wycinki tkanek



Płyn mózgowo-rdzeniowy



Hodowle bakteryjne i tkankowe

Materiały biologiczne:

Polega na powielaniu fragmentu genomowego

DNA.

Składa się z 3 etapów:
-Denaturacja

92-94

-Przyłączanie starterów

~ 60

-Elongacja

Pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy 2

kopie DNA zawierające region który chcieliśmy
zwielokrotnić.  Ponieważ  w  każdym  kolejnym
cyklu  każda  z  nici  DNA  stosowana  jest  jako
matryca,  liczba  kopii  powielanych  fragmentów
rośnie wykładniczo.

Metoda PCR



matryca DNA



polimeraza termostabilna



para specyficznych starterów
(primers)



trójfosforany
deoksyrybonukleotydów (dNTP)



bufor (zawierający Mg

)



woda

Skład mieszaniny reakcyjnej
PCR

G.K.

Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )

5’

3’

separation of strands

and primer attachment

5’

3’

5’

3’

’

5’

primer elongation

separation of strands

and primer attachment

. cycle)

(2.

cycle etc.)

Primer 1

Primer 2

complementary to primer 2

complementary to primer 1

amplification of target sequence



Badanie polimorfizmu fragmentów DNA
powstających

wyniku

działania

endonukleaz  restrykcyjnych  na  nić  DNA,
polimorfizm  powstały  w  wyniku  delecji,
insercji  lub  tranzycji  prowadzi  do  zmiany
lub  zaniku  miejsca  rozpoznawanego  przez
enzymy restrykcyjne. RFLP jest kluczowym
narzędziem

rozpoznawaniu

DNA,

określaniu

obecności

różnych alleli u

osobników.

RFLP- polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych



Technika ta opiera się na tym, że
jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje
określoną

strukturę

drugorzędową.

Struktura  ta  zależy  od  rodzaju  i  sekwencji
zasad  tworzących  nić  DNA.  Mutacje
punktowe,  delecje  i  insercje  powodują
zmiany  struktury  drugorzędowej,  co  jest
wykrywane za pomocą elektroforezy w żelu
poliakrylamidowym.

SSCP - badanie zmian

konformacji jednoniciowego DNA



Podobnie  jak  SSCP  jest  techniką  względnie  prostą.
Jeżeli  sekwencje  niezmienione  (typu  dzikiego)  oraz
sekwencje  z  mutacją  są  obecne  w  reakcji  PCR  to
produktami  tej  reakcji  są  cztery  różne  dwuniciowe
fragmenty DNA. Dwa z nich to homodupleksy , czyli
struktury  dwuniciowe  w  pełni  komplementarne.
Dwa  inne  to  heterodupleksy  zawierające  miejsca
niesparowane.  Heterodupleksy  ze  zmianą  co
najmniej  jednej  zasady  mogą  wykazywać  inną  w
porównaniu do homodupleksów ruchliwość podczas
elektroforezy na zwykłym poliakrylamidowym żelu

HET- analiza

heterodupleksów



W tej metodzie wykorzystuje się dwa różne
oligonukleotydy, jeden komplementarny do
sekwencji

prawidłowego

genu,

drugi

komplementarny do znanej mutacji w tym
genie.

Sondy

ASO

hybrydyzują

komplementarną sekwencją DNA. Wyniki
odczytuje się bezpośrednio z filtrów, na
podstawie intensywności barwy powstałego
krążka.

ASO- metoda analizy genu za pomocą

oligonukleotydów specyficznych dla allela.



Podstawą

działania

mikromacierzy

jest

komplementarność kwasów

nukleinowych.

Mikromacierz

zawiera

sekwencje

komplementarne do badanych sekwencji. Próbkę
kwasu

nukleinowego

wyznakowuje

się

znacznikami fluorescencyjnymi i hybrydyzuje z
mikromacierzą.

Cząsteczki

wyznakowanego

kwasu

nukleinowego

wiążą

się

komplementarnych  sekwencji.  Obraz  odczytuje
się  ilościowo  za  pomocą  lasera  lub  mikroskopu.
Intensywność  sygnału  dla  poszczególnych  sond
mikromacierzy  jest  proporcjonalna  do  ilości
kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.

Mikromacierze



W tej metodzie genomowe DNA poddaje się
trawieniu enzymami restrykcyjnymi, by następnie
powstałe

fragmenty,

rozdzielić

elektroforetycznie.  W  celu  uzyskania  formy
jednoniciowej  poddaje  się  je  denaturacji  i
przenosi  na  filtr  nitrocelulozowy  bądź  nylonowy.
Związany

filtrem

jednoniciowy

DNA

hybrydyzuje z sondą (DNA wyznakowany i
komplementarny do badanego fragmentu).

W sytuacji gdy występuje duża mutacja układ

prążków jest odmienny niż w próbkach bez
mutacji.

Metoda Southerna

genomowe DNA

trawienie enzymami restrykcyjnymi

rozdział elektroforetyczny

denaturacja dwuniciowego DNA

transfer na filtr nitrocelulozowy bądź nylonowy

hybrydyzacja jednoniciowego DNA z sondą

analiza autoradiogramu (duża mutacja - układ

prążków

jest odmienny niż w próbkach bez mutacji)



Gerard Drewa, Tomasz Ferenc; Podstawy
genetyki dla studentów i lekarzy.



Kurzawski Grzegorz; Analizy molekularne
DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych
predyspozycji do nowotworów.

Bibliografia:

Document Outline