Ciałko Barra. Barwienie komórek nabłonka jamy ustnej na obecność ciałek Barra. Teoria Lyon.

Ciałko Barra. Barwienie komórek nabłonka

jamy ustnej na obecność ciałek Barra.

Teoria Lyon.

Aleksandra Włoskiewicz

gr.5

Pielęgniarstwo rok I

CIAŁKO BARRA

• Ciałka Barra są to płasko wypukłe grudki

chromatyny położone przy błonie jądrowej
komórki, występujące np. w komórkach nabłonka
jamy ustnej, w krwinkach białych („pałeczki
dobosza”) i w innych. W warunkach prawidłowych
stwierdza się je jedynie u kobiet. Okazało się,
bowiem, że ciałko Barra to nieczynny, odłożony
chromosom X. Jak pamiętamy, geny leżące na
chromosomie X są niezbędne do życia, dlatego
też każda komórka, która ma utrzymać się przy
życiu musi posiadać ten chromosom.

• Jeżeli jednak w komórce są dwa chromosomy

X, jeden z nich może pozostać nieczynny,
odłożony w postaci heterochromatyny,
albowiem geny odczytywane są na drugim,
czynnym chromosomie X. A zatem w
organizmie kobiety (XX) występują ciałka
Barra, a w organizmie mężczyzny (XY) ich nie
ma. Poszukując chromatyny płciowej
możemy określić płeć chromatynową. Jeśli
występują ciałka Barra, płeć chromatynowa
jest żeńska, gdy jest ich brak – męska.

Hipoteza inaktywacji chromosomu X

• Hipotezy inaktywacji chromosomu X

Badania były prowadzone w Anglii na myszach
przez Mary Lyon w 1961roku. Zaproponowała
ona, że:

• 1.Skondensowany chromosom X w

somatycznych kom. żeńskich ssaków jest
genetycznie nieaktywny.

• 2.Inaktywacja zachodzi we wczesnych

etapach rozwoju(w stadium 32 lub 64
komórek), chromosom pochodzenia
matczynego lub ojcowskiego ulega inaktywacji z
jednakowym prawdopodobieństwem.

• 3.Inaktywacja zachodzi w sposób niezależny,

losowy i nieodwracalny w każdej komórce
embrionu. Wzór inaktywacji zostaje zachowany w
komórkach potomnych tzn., że gdy inaktywacji
ulega pierwotnie X matczyny, to we wszystkich
komórkach potomnych inaktywowany pozostanie
chromosomom pochodzenia matczynego.

• Proces inaktywacji chromosomu X- lyonizacaja,

prowadzi do zrównoważenia fenotypu męskiego
i żeńskiego przez kompensację dawki(kobiety
posiadające 2 X mają taką samą liczbę
aktywnych kopii genów sprzężonych z X jak
mężczyźni.

• Lyonizacji towarzyszy metylacja

cytozyny w kontrolujących obszarach DNA,
w wyniku kondensacji chromosom X zostaje
wyłączony ( nie zachodzi transkrypcja
genów)

• Inaktywacja obejmuje większość genów

chromosomu X z wyjątkiem genów w
obszarze psedoautosomalnym oraz
położonych w proksymalnej części ramienia
krótkiego i długiego.

Etapy inaktywacji:

• -inicjacja- wymaga obecności dwóch

chromosomów XX

• -zliczenie całkowitej ilości chromosomów X w

jądrze

• -wybór chromosomu który ulegnie inaktywacji
• -zablokowanie centrum inaktywacji chromosomu,

który pozostanie czynny

• -rozprzestrzenienie się inaktywacji na drugim

chromosomie

• -utrzymanie stanu inaktywacji podczas podziałów

komórkowych

Dowody na losową inaktywację chromosomu X - badania

nad żeńskimi osobnikami będącymi heterozygotami pod

względem cech sprzężonych z płcią

• badania Lyona na myszach. Jednolicie zabarwieni

rodzice -XX ciemna, XY -jasny, łaciate potomstwo tylko
samiczki, komórki z nieaktywnym Xmat wytwarzały
barwnik jasny, Xpat wytwarzały barwnik ciemny.

• -Efekt wariegacji (fenotypowej mozaikowatości)

obserwowany u kotek. Tylko u heterozygotycznych samic
pojawia się futro łaciate czarno- żółto- białe. Kotka
otrzymuje od rodziców jeden gen- barwa czarna, a drugi-
barwa żółta) na skutek losowej inaktywacji jednego z X
w pewnych klonach komórek dochodzi do ekspresji
genów barwy czarnej, w innych glonach- genów barwy
żółtej. Barwę sierści warunkują tez inne geny dlatego
zwykle na futerku pojawiają się białe plamy

• Anhydrotyczna ektodermalna dysplazja- choroba

recesywna u ludzi. Chorzy mężczyźni nie mają gruczołów
potowych, zębów i owłosienia na ciele. Heterozygotyczne
kobiety cechuje brak gruczołów potowych na skórze oraz
utrata lub uszkodzenie pojedynczych zębów. Miejsca
pozbawione gruczołów są rozmieszczone nieregularnie na
skórze w zależności od tego, który z chromosomów X
został wyłączony.

• Objawy dysplazji manifestują się zmianami w zakresie

skóry, błon śluzowych, włosów, paznokci i zębów. Chorzy
mają bladą, cienką skórę, często z pigmentacjami powiek,
łokci i kolan, skąpą podściółkę tłuszczową, szeroki,
siodełkowaty nos, odstające, nisko osadzone małżowiny
uszne, skąpe i jasne owłosienie głowy, często brak rzęs i
brwi, grube wywinięte wargi, zniekształcone płytki
paznokci, niekiedy zaburzenia neurologiczne i niedorozwój
soczewki oka.

• Rozróżnia się: postać hydrotyczną – dziedziczoną

na drodze autosomalnej dominującej oraz postać
anhydrotyczną – dziedziczoną na drodze
autosomalnej recesywnej, sprzężoną z płcią
męską kobiety są nosicielkami.

• Badanie poziomu enzymu dehydrogenazy

glukozo-6-fosforanowej (metabolizm glukozy)
kodowanej przez gen G6PD znajdujący się na
chromosomie X, wykazały że poziom tego
enzymu jest inny u kobiet i mężczyzn. U kobiet
46, XX i mężczyzn 46, XY oraz 47, XXY, poziom
enzymu jest jednakowy, co może świadczyć o
aktywności tylko jednego allelu u kobiet,
mężczyzn i mężczyzn z zespołem Kinefeltera.

BADANIA CHROMATYNY PŁCIOWEJ

(Test CHX)

• Uwagi ogólne:

Testy chromatynowe są proste w wykonaniu,
nie są obciążające dla badanego dziecka lub
pacjenta dorosłego, pozwalają na szybkie
wykluczenie aberracji liczbowych
chromosomów płciowych X i Y oraz
niektórych typów ich aberracji strukturalnych.
Ocenie podlegają jądra komórek w okresie
między podziałowym (interfazy), dzięki
czemu nie jest potrzebna hodowla materiału
pobranego do badań.

• Testy chromatyny płciowej X (test CHX) oraz

chromatyny płciowej Y (CHY) umożliwiają
określenie płci chromatynowej pacjenta. Są
szczególnie przydatne w przypadkach
stwierdzenia wad rozwojowych narządów
płciowych, zwłaszcza u noworodków, u
których konieczne jest szybkie podjęcie
decyzji dotyczących ustalenia płci
fenotypowej, a w ślad za tym płci
metrykalnej dziecka. Wszystkie
nieprawidłowe wyniki testów CHX i CHY
muszą być zweryfikowane w pełnym
badaniu kariotypu.

• Chromatyna X jest efektem inaktywacji jednego z

dwóch chromosomów X u zdrowej kobiety (kariotyp
46,XX) celem zapobieżenia efektowi "dawki genów"
w stosunku do jednego chromosomu X u mężczyzny
(kariotyp 46,XY). W jądrach wielu typów komórek
widoczna jest jako grudka chromatyny X lub jako
"pałeczka dobosza" w granulocytach
obojętnochłonnych krwi obwodowej. Liczba grudek
(pałeczek) jest zawsze o jeden mniejsza niż liczba
chromosomów X w kariotypie. Test jest zatem ujemny
przykładowo u mężczyzny z kariotypem 46,XY ale i u
pacjentki z kariotypem 45,X (zespół Turnera). Będzie
natomiast dodatni zarówno u kobiety (46,XX) jak i u
mężczyzny z zespołem Klinefeltera (47,XXY),
u którego jeden X ulega inaktywacji.

Badania na CHX

• Badanie na CHX wykonuje się na nabłonku

jamy ustnej, który pobiera się plastikową
szpatułką w postaci tzw. wyskrobiny.
Natomiast test CHY przeprowadza się na
jądrach limfocytów krwi obwodowej - kropla
pobrana z opuszka palca. Wynik zwykle jest
nastęnego dnia.

WYBARWIANIE

• Wybarwianie ciałek Barra to jedna z metod

rozróżniania płci. Liczba ciałek Barra = liczba X – 1.
Najłatwiej ciałka Barra uzyskać z nabłonka błony
śluzowej jamy ustnej lub z płynu owodniowego
zrobić rozmaz na szkiełku i wybarwić.

• pałeczka dobosza X – są to grudki chromatyny

chromosomu X wyrzucone poza obręb jądra, ale
pozostające z nim w łączności. Występują w
granulocytach obojętnochłonnych, które mają
segmentowane jądra. U kobiety pałeczka dobosza
tworzy tą część chromatyny jądrowej, z której
powstałby chromosom (nieczynny).

• u mężczyzn:

• pałeczka dobosza Y – u mężczyzn pałeczka dobosza

tworzona jest przez tą część chromatyny jądrowej, z
której powstałby chromosom Y – u mężczyzn fluoryzuje.

• Dystalna część ramion dolnych chromosomu Y ma

zdolność silnej fluorescencji. Aby odróżnić pałeczkę
dobosza X od Y wystarczy wybarwić preparat barwnikiem
fluorescencyjnym i jeżeli pałeczka dobosza zaświeci, jest
to Y.

• ciałko Y (chromatyna Y) – występuje w jądrze

komórkowym komórek męskich wybarwionych
barwnikami fluorescencyjnymi – stanowi je dystalna
hetero chromatynowa część ramion długich chromosomu
Y, która ma dolność silnej fluorescencji. Liczba ciałek Y =
liczba chromosomów Y. Jest to ta część, z której
powstałby chromosom Y.

Barwienie ciałek Barra

• Fuksyna zasadowa:

• roztwór podstawowy

-fuksyna zasadowa 3 g
-70% alkohol etylowy – 100 ml

• roztwór fuksyny

-roztwór podstawowy – 10 ml
-5% wodny kwas karbolowy (FENOL) – 30 ml
-kwas octowy lodowaty – 10 ml
-37% formaldehyd (cz.d.a.) – 10 ml

• (roztwór nadaje się do użycia po 24 godzinach)

Wykonanie

• 1.      Alkohol absolutny - 3 min
• 2.      Alkohol 70% - 3 min
• 3.      H

O destylowana – 5 min

• 4. H

O destylowana – 5 min

• 5.      Fuksyna – 5 – 10 – 20 min
• 6.      Alkohol 95% - 1 min
• 7.      Alkohol absolutny – 3 min
• 8.      Alkohol absolutny – 3 min
• 9.      Ksylen
• 10.  Ksylen

Przygotowanie kwasu karbolowego: wstawić fenol do
cieplarki, odważyć 5 g i uzupełnić do 100 ml wodą.

Barwienie pałeczek dobosza

• Wykonanie rozmazu:

• 1. Kroplę krwi umieścić na jednym końcu szkiełka przedmiotowego.
• 2. Oprzeć brzeg szkiełka szlifowanego kroplę krwi tak, aby rozpłynęła

się wzdłuż jego krawędzi. Szkiełko ustawić pod kątem 20-30⁰ w stosunku
do szkiełka przedmiotowego.

• 3. Trzymając szkiełko szlifowane w prawej ręce a przedmiotowe w lewej

podpierając je palcem środkowym, jednym ruchem rozmazać kroplę krwi.

• 4.      Po wykonaniu rozmazu szkiełko wysuszyć na powietrzu.
• Barwienie:
• 1.      Utrwalić w alkoholu metylowym absolutnym – 10 min.
• 2.      Zalać barwnikiem May – Grunwalda, zbuforowanym do pH 6,8 na 5

min.

• 3.      Płukać w wodzie destylowanej.
• 4.      Barwić 3% roztworem Giemsy przez 10-20 min.
• 5.      Płukać w wodzie destylowanej.
• 6.      Wysuszyć i przechowywać na sucho.
• Analizować należy ok. 500 leukocytów. U osobników żeńskich stwierdza się

co najmniej 12% granulocytów z typowymi pałeczkami dobosza X.

Barwienie ciałek Y w rozmazach nabłonka jamy

ustnej

• 1.Rozmazy z komórek nabłonka jamy ustnej utrwalać

w metanolu lub w mieszaninie etanolu z eterem (1:1).

• 2.Barwić przez 5 minut w 0,5% roztworze wodnym

atebryny (Q).

• 3.Płukać 3 min w bieżącej wodzie.
• 4.Opłukać w buforze McIlvane’a o pH 5,5 lub 4,2,

zamknąć preparat w nim lub w mieszaninie glicerolu z
buforem 1:1.

• 5. Oceniać w mikroskopie fluorescencyjnym.

• Wynik: ciałko Y ma średnicę 0,25 µm, występuje w

25-50% komórek.

Document Outline