FENOTYPOWE I 

GENOTYPOWE METODY 

IDENTYFIKACJI I 

RÓŻNICOWANIA 

DROBNOUSTROJÓW

FENOTYP



Fenotyp  zespół  cech organizmu  

włączając w to nie  tylko morfologię  
także  właściwości fizjologiczne , cykl 
życiowy , wpływ środowiska na 
organizm.



Fenotyp  jest ściśle związany z 

genotypem.

RÓŻNICOWANIE 
FENOTYPOWE



Cechy fenotypowe:

     -morfologiczne: kształt(np. kulisty, 

pałeczkowaty), rozmiary, 
barwienie(G+,G-),rzęski, otoczki

     -fizjologiczne: enzymy łańcucha  

oddechowego, metabolizmu białkowego 
,aminokwasów, końcowe produkty 
metabolizmu 

     -chemiczne: struktura ściany komórkowej, 

struktura antygenowa

RÓŻNICOWANIE 
FENOTYPOWE



W rutynowej diagnostyce 

mikrobiologicznej różnicowanie 
drobnoustrojów przeprowadza się 
najpierw na podstawie cech 
fenotypowych .



Ocenia się morfologię i wzrost 

drobnoustrojów na odpowiednich 
podłożach mikrobiologicznych czyli 
zewnętrzne  efekty ekspresji 
informacji genetycznej.

RÓŻNICOWANIE 
FENOTYPOWE



Obserwuje się zmienność fenotypową 

szczepów związaną z warunkami 
środowiskowymi takimi jak stosowane 
środki dezynfekcyjne , antybiotyki, 
specyfika oddziału. Zmienność 
związaną z odpornością chorych , 
miejscem zakażenia , obecnością flory 
fizjologicznej.

METODY 
FENOTYPOWANIA



BIOTYPOWANIE



SEROTYPOWANIE



TYPOWANIE BAKTERIOFAGOWE



ANTYBIOGRAM



ELEKTROFOREZA BIAŁEK

    -PROFIL BIAŁEK KOMÓRKOWYCH
    -IMMUNOBLOTTING
    -METODA  MLEE
    -ZYMOTYPOWANIE

BIOTYPOWANIE



W badaniach epidemiologicznych lub  

ekologicznych w celu określenia źródła 
szczepu lub drogi jego rozprzestrzeniania  
może zaistnieć dokładniejszej charakterystyki 
analizowanych szczepów ludzkich i 
zwierzęcych.



Na przykład Staphylococcus aureus :

    -wytwarzanie staphylokinazy
    -β-hemolizy
    -koagulacja osocza bydlęcego
    -typ wzrostu pojedynczych kolonii na  agarze 

z   fioletem krystalicznym

SEROTYPOWANIE



Immunologiczna analiza antygenów 

powierzchniowych czyli serotypowanie  jest 
najpowszechniej wykorzystywana do 
określania typu serologicznego otoczki oraz 
typu koagulazy może być metodą 
uzupełniającą do innych metod serologicznych 
.

TYPOWANIE 
BAKTERIOFAGOWE



Do typowania ludzkich szczepów  

Staphylococcus aureus, Pseudomonas  
aeruginosa stosuje się międzynarodowy 
zestaw fagów ,polega to na wysokiej 
specyficzności  fagów  bakterie mają 
specyficzny wzór fagowy –lizowane są przez 
określone fagi.



Dzięki tej metodzie zidentyfikowano  wiele  

epidemii .

ANTYBIOGRAM



Lekooporność/ lekowrażliwość



Podstawowa  metoda  różnicowania  szczepów 

 zyskała szerokie  zastosowanie w placówkach 
diagnostycznych jako nieliczna  jest metodą  
wystandaryzowaną  co umożliwia  
porównywanie wyników między  różnymi 
ośrodkami  diagnostycznymi.



W badaniach rutynowych  stosuje się metodę 

dyfuzyjno-krążkową  oznacza się wrażliwość 
na antybiotyki. 

ELEKTROFOREZA-
ANALIZA PROFILU BIAŁEK 
KOMÓRKOWYCH



Techniki elektroforetyczne  pozwalają na porównanie 
cech w oparciu o różnice białek komórkowych  
powierzchniowych i wydzielniczych lub po lizie 
komórek.



Analiza wszystkich białek otrzymanych po  degradacji 
komórek poddanych działaniu lizostatyny może być 
wykonana  na żelu poliakryloamidowym (PAGE).



Mała powtarzalność  rozdziałów elektroforetycznych  
stawia metodę o niewielkiej przydatności  do 
typowania  S.aureus.

ELEKTROFOREZA 
BIAŁEK 
IMMUNOBLOTTING



Metoda polegająca na wykonaniu reakcji 

Western-blot znakowanymi przeciwciałami z 
rozdzielonymi  w trakcie elektroforezy 
antygenami danego szczepu.



Immunoblotting  jest łatwiejsza i prostsza  w 

interpretacji od metody elektroforezy profilu 
białek komórkowych.

ELEKTROFOREZA 
BIAŁEK MLEE



Typowanie metodą  MLEE oparte jest na 

polimorfizmie badanych enzymów 
komórkowych .

   



Zmienność enzymatyczna jest 

odzwierciedleniem rożnic  genetycznych 
powstałych w loci tych enzymow.  Szczepy 
bakteryjne mogą zostać  zaklasyfikowane  do 
poszczególnych typów elektroforetycznych  na 
podstawie otrzymanych wzorów 
elektroforetycznych.

ELEKTROFOREZA 
BIAŁEK 
ZYMOTYPOWANIE



Zymotypowanie jest jedną z odmian metody 

elektroforezy typu MLEE. Opiera się na 
polimorfizmie enzymów gronkowcowych 
należących do grupy lipaz, esteraz.



Polimorfizm enzymów jest określany na 

podstawie różnic w ruchliwości elektroforetycznej 
w żelu poliakryloamidowo-agarozowym 
spowodowanych różnym zakresem aktywności 
wobec pięciu syntetycznych substratów.

GENOTYP



Zespół genów danego osobnika 

warunkujących jego właściwości 
dziedziczne.



Materiał genetyczny jest unikalny i 

stały dla każdego organizmu (w 
porównaniu do cech fenotypowych).

GENOTYPOWANIE



Obecnie główną rolę w typowaniu bakterii, a 

w tym także gatunku S. aureus przejęły 
metody molekularne oparte na analizie 
genomu bakteryjnego, zwłaszcza w 
przypadkach zakażeń powodowanych przez 
atypowe szczepy niemające typowych cech 
biochemicznych . 



Metody genotypowe stosuje się przede 

wszystkim do wykrywania  szczepów które są 
bardzo trudne w hodowli albo namnażają się 
bardzo powoli.

SONDY DNA



DNA zbudowane jest z dwóch 

komplementarnych nici kwasów nukleinowych 
możliwe jest wykrycie jednoniciowych  
sekwencji metodą hybrydyzacji przy użyciu 
znakowanych pojedynczych nici.



Sondy mogą być znakowane radioaktywnie 

lub nieradioaktywnymi cząstkami 
znacznikowymi (biotyna ,dioksygenina).



Sondy molekularne z uzyciem techniki PCR są 

często używane w diagnostyce 
mikrobiologicznej.

ZALETY SOND 
MOLEKULARNYCH



Drobnoustroje za pomocą sond są wykrywane 

nawet gdy są martwe



Są szczególnie przydatne przy masowych 

badaniach  przesiewowych i epidemiologicznych



Dotyczy to występowania w materiale bardzo 

małych ilości drobnoustrojów np.

   -Mycobacterium sp., Chlamydia sp.
   -wirusy HIV,HCV,
   -pierwotniaki 

HYBRYDYZACJA



W fazie stałej-poszukiwana cząsteczka lub 

sonda są przytwierdzone do błony nylonowej, 
nitrocelulozowej(technika colony blot i dot 
blot)



W fazie płynnej-wykrywana cząsteczka i 

sonda są w fazie płynnej



In situ –do wykrywania DNA bakteryjnego w 

zakażonej tkance

AMPLIFIKACJA I 
SEKWENCJONOWANIE

 



Sekwencją docelową do identyfikacji bakterii 

bardzo trudnych w hodowli jest często swoisty 
region w obrębie 16 S rRNA , w którym pewne 
segmenty są identyczne dla wszystkich 
bakteri.Pomiędzy tymi  regionami występują 
również swoiste fragmenty dla gatunku lub 
rodzaju.



Uzyskane sekwencje zasad porównuje się z 

danymi w bibliotece referencyjnej.

 

AMPLIFIKACJA I CHIPY 

GENOWE



Wykorzystuje się tysiące nukleotydów 

swoistych dla bekteri chorobotwórczych 
przytwierdzonych do  chipa o powierzchni 
ok.2cm² .Chip pokrywany jest  
zamplifikowanym i oznakowanym 
jednoniciowym DNA (zawierającym 
np.gatunkowo swoiste sekwencje) 
pochodzącym z badanego materiału. 
Mierzymy stopień wiązania się z 
komplementarnymi sekwencjami metoda 
fluorescencji, specjalnym czytnikiem.

ANALIZA PROFILI 
PLAZMIDOWYCH



Metoda genotypowania oparta na izolacji DNA 

plazmidowego z komórek bakteryjnych i 
rozdziale elektroforetycznym w żelu 
agarozowym.



W zależności od wielkości i ilości plazmidów w 

komórce otrzymuje się charakterystyczne 
wzory plazmidowe



Metoda ma zastosowanie tylko do szczepów 

posiadających plazmidy np. Salmonella,E.coli.

TESTY AMPLIFIKACJI 
DNA TECHNIKĄ PCR



Amplifikacja znanych regionów genomu połączona z 
analizą restrykcyjną (PCR-RFLP) lub równoczesnej 
amplifikacji dwóch lub więcej różnych fragmentów 
DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej.



Produkty PCR poddaje się trawieniu enzymami 
restrykcyjnymi, dobiera się je znając sekwencję 
powielonego DNA. Wykrywa się charakterystyczny 
dla danego drobnoustroju polimorfizm długości 
fragmentów restrykcyjnych wykrywany metodą 
elektroforezy żelowej na poziomie gatunku 
np.Listeria,Borrelia.

REAL-TIME PCR



Technika detekcji kwasów nukleinowych, w 

szczególności w wykrywaniu mutacji, analiza 
ilościowa.



Podczas reakcji ilość amplifikowanego DNA 

monitoruje się używając technik 
fluorescencyjnych. Pozwala to na wykrycie na 
początku reakcji pojedynczych cząsteczek 
matrycy.



Metoda bardzo czuła, wymaga niewielkich 

ilości DNA.



Można przeprowadzić różnicowanie na 

poziomie szczepu.

HYBRYDYZACJA DNA-
DNA



Określanie przynależności do badanego 

genotypu oparta na ilościowym podobieństwie 
w chromosomalnym DNA .



Zastosowanie w badaniach naukowych.

GENOTYPOWANIE



W mikrobiologii zidentyfikowano i dokładnie 

scharakteryzowano geny drobnoustrojów 
pełniące takie funkcje, jak: odpowiedzialność 
za cechy inwazyjności, toksyczności i 
oporności na leki.
Znajduje to szerokie i trudne do przecenienia 
zastosowanie w diagnostyce zakażeń, w 
genotypowaniu drobnoustrojów dla celów 
epidemiologicznych, a więc określaniu 
podobieństwa i wspólnego pochodzenia, 
ustalaniu źródeł i dróg szerzenia się 
patogenów. 

DZIĘKUJEMY 

ZA UWAGĘ

KONIEC