Enzymy restrykcyjne i
reakcja łańcuchowa
polimerazy (PCR)
-zastosowanie w
biotechnologii
Enzymy restrykcyjne i
reakcja łańcuchowa
polimerazy (PCR)
-zastosowanie w
biotechnologii
Enzymy restrykcyjne i
reakcja łańcuchowa
polimerazy (PCR)
-zastosowanie w
biotechnologii
Enzymy restrykcyjne i
reakcja łańcuchowa
polimerazy (PCR)
-zastosowanie w
biotechnologii
• rozcinają DNA na krótkie kawałki w miejscu
określonych sekwencji, w odróżnieniu od większości
metod enzymatycznych, fizycznych, chemicznych, w
wyniku których DNA jest przecinane w miejscach
dowolnych;
• naturalnie występują u bakterii i sinic, stanowiąc
element tzw. systemu "restrykcji-modyfikacji". System
ten chroni komórkę przed wnikaniem obcego DNA (np.
DNA bakteriofagów);
• występują tylko w tych komórkach, które mają enzym
towarzyszący, zdolny do metylowania DNA
gospodarza. Dzięki temu DNA gospodarza nie jest
rozkładany przez własne enzymy restrykcyjne,
natomiast trawiony jest obcy, niezmodyfikowany DNA.
Enzymy
restrykcyjne:
Enzymy
restrykcyjne:
Każdy enzym
restrykcyjny
rozpoznaje i
przecina w
dwuniciowym
DNA sekwencję o
długości 4-7 par
zasad. Takie
przecięcie DNA
dają w wyniku
tępe końce lub
końce
nakładające się,
czyli końce
lepkie, zależnie
od mechanizmu
cięcia, jakim
posługuje się
enzym.
Nazwy enzymów restrykcyjnych pochodzą od
nazwy bakterii, z której zostały wyizolowane.
Lepkie końce - krótkie odcinki
jednoniciowego DNA
komplementarne do siebie. Dzięki
komplementarności mogą się one
bardzo łatwo rozpoznać i ponownie
utworzyć fragment dwuniciowy, co
umożliwia ligowanie DNA
pochodzących nawet od bardzo
różniących się gatunków
Tępe końce - obie nici rozcięte są
naprzeciwko siebie, nukleotydy na
końcach są sparowane z
komplementarnymi nukleotydami
na przeciwnej nici
• Fragmenty restrykcyjne, które powstają po
przecięciu DNA enzymem restrykcyjnym,
rozdziela się za pomocą elektroforezy
żelowej. Do rozdziału większych fragmentów
DNA stosuje się żel agarozowy, a do małych
żel poliakrylamidowy.
• Wielkość fragmentów restrykcyjnych określa
się przez porównanie drogi migracji tych
fragmentów z drogą migracji fragmentów
wzorcowych. DNA po elektroforezie wykrywa
się w żelu przez wybarwienie go bromkiem
etydyny.
• Następnie, aby sprawdzić miejsce rozcięcia
cząsteczki DNA przedstawia się ją na mapie
restrykcyjnej. Polega to na określeniu miejsc
rozpoznawanych przez różne enzymy
restrykcyjne, a także odległości między nimi.
• Restryktazy przecinają najczęściej DNA w
obrębie sekwencji palindromowych, czyli
takich w których sekwencja jednej nici jest
taka sama jak sekwencja nici
komplementarnej, czytana w przeciwnym
kierunku.
Zastosowa
nie
Zastosowa
nie
1. Tworzenie
map
restrykcyjnych
1. Tworzenie
map
restrykcyjnych
2. Klonowanie
i obróbka DNA
2. Klonowanie
i obróbka DNA
3.Badanie polimor
fizmu miejsc
restrykcyjnych
(RFLP
)
3.Badanie polimor
fizmu miejsc
restrykcyjnych
(RFLP
)
• (PCR) (ang. Polymerase Chain Reaction) –
to enzymatyczna metoda wielokrotnego
kopiowania dwupasmowego DNA, które
może stanowić np. sekwencję określonego
genu.
• Technika ta została wynaleziona w 1983
roku przez Kary’ego Mullisa, za którą w
1993 roku otrzymał nagrodę Nobla.
Reakcja łańcuchowa
polimerazy:
Reakcja łańcuchowa
polimerazy:
• 1. Etap denaturacji
– próbka DNA zostaje podgrzana
w temperaturze 95°C przez 15 sekund w celu rozplecenia
podwójnej helisy. Pękają wiązania wodorowe tworząc dwa
pojedyncze łańcuchy.
• 2. Etap annealingu
– następuje asocjacja primerów z
matrycą przebiegająca w obniżonej temperaturze (54°C)
• 3. Etap elongacji
– polimeraza DNA wydłuża primery
(w temperaturze 72°C) w obu kierunkach i syntezuje dwa
pasma komplementarne do dwóch pasm oryginalnych.
• Każdy cykl podgrzania i replikacji powoduje podwojenie
liczby cząsteczek DNA i jest powtarzany wielokrotnie. Po 20
cyklach otrzymujemy ponad milion cząsteczek
identycznych.
Przebieg reakcji:
Przebieg reakcji:
Początkowo w reakcji
PCR używano
polimerazy z E. coli.
Polimeraza ta była
jednak niszczona
przez każdy cykl
denaturacji cieplnej.
Zastąpienie jej
termostabilną
polimerazą DNA z
Thermus aquaticus
pozwoliło ominąć
problem z
wrażliwością enzymu
na temperaturę i
zautomatyzować
metodę PCR.
1. wykrywanie
czynników
zakaźnych,
zwłaszcza letalnych
wirusów
1. wykrywanie
czynników
zakaźnych,
zwłaszcza letalnych
wirusów
2. prenatalna
diagnostyka
genetyczna
2. prenatalna
diagnostyka
genetyczna
3. wykrywanie
polimorfizmu alleli
3. wykrywanie
polimorfizmu alleli
4. precyzyjne
typowanie tkanek do
transplantacji
4. precyzyjne
typowanie tkanek do
transplantacji
5. badania nad
ewolucją, z
wykorzystaniem
archeologicznych
próbek DNA
5. badania nad
ewolucją, z
wykorzystaniem
archeologicznych
próbek DNA
6. analizy RNA po
skopiowaniu RNA i
ilościowy pomiar
mRNA metodą tzw.
RT-PCR
6. analizy RNA po
skopiowaniu RNA i
ilościowy pomiar
mRNA metodą tzw.
RT-PCR
Zastosow
anie
Zastosow
anie