Hodowle komórek roślinnych i zwierzęcych
Inżynieria tkankowa
Tkanki in vitro jako modele do badań
Kultury komórkowe i
tkankowe
Hodowle komórek roślinnych i zwierzęcych
Inżynieria tkankowa
Tkanki in vitro jako modele do badań
Kultury komórkowe i
tkankowe
Specyficzne działy biotechnologii
Polegają na kultywowaniu w war. sztucznych
wyodrębnionych komórek z tkanek roślin lub zwierząt
(komórki hodowane są nie wewnątrz tkanki a in vitro)
Wymagają specjalistycznych, bardziej zaawansowanych
technik niż hodowle mikroorganizmów (kom. są bardziej
wrażliwe niż drobnoustroje)
HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH
I ZWIERZĘCYCH
Totipotencjalny charakter komórek
Łatwiejsza hodowla in vitro niż kom. zwierzęcych
Materiałem zapoczątkowującym hodowlę jest eksplant przenoszony
na odpowiednie podłoże hodowlane (agar)
Po ok. 2-óch tygodniach otrzymuje się narośl niezróżnicowanych
komórek (tzw. kalus)
Zmieniając skład pożywki można uzyskać zróżnicowanie tkanki
kalusowej i odtworzenie całej rośliny
Istnieje możliwość osobnego hodowania wyodrębnionych komórek i
tkanek roślinnych (np. samych korzeni lub zarodków)
W tkankach wyhodowanych in vitro występują na ogół takie same
związki biologicznie czynne jak w roślinie macierzystej, co
umożliwia ich pozyskanie z pominięciem hodowli całej rośliny.
HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH
HODOWLA KOMÓREK ROŚLINNYCH IN
VITRO
roślina
eksplant
eksplant
kalus
hodowla
inkubacja
Zastosowanie w :
Badaniach fizjologii wzrostu i różnicowania komórek
Doskonaleniu odmian roślin hodowlanych (w połączeniu z fuzją
protoplastów)
W produkcji alkaloidów, olejków aromatycznych, fitohormonów,
składników leków (np. nasercowych), sterydów i ich pochodnych.
HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH
1.
Pojedyncze komórki uzyskuje się w
wyniku enzymatycznego, chemicznego
lub mechanicznego rozdrobnienia
odpowiedniej tkanki.
2.
Komórki hoduje się w odpowiednich
butelkach z pożywką (medium
hodowlanym) w inkubatorze tak
uzyskane komórki to kultura pierwotna
3.
Następnie komórki przenosi się do
świeżej pożywki (pasażuje) i uzyskuje
się kulturę wtórną
4.
Operację pasażowania można powtarzać
wielokrotnie, uzyskując linię komórkową,
jednak w związku z ograniczoną
możliwością wzrostu komórki po
pewnym czasie ulegają apoptozie.
HODOWLE KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH
Ciągłe linie komórkowe
W specyficznych przypadkach uzyskuje się ciągłą linię
komórkową tzn. komórki zdolne do nieograniczonej replikacji
in vitro. Wiele ciągłych linii komórkowych uzyskuje się z
komórek rakowych.
Linie komórkowe są przechowywane w ciekłym azocie (-196 C)
w bankach komórek i tkanek i sa dostępne komercyjnie
(zwykle €100)
ATCC- American Tissue Culture Collection
ETCC- European Tissue Culture Collection
HODOWLE KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Hep2(human liver cells)
EBL (embrio bovine lung cells)
Vero (monkey kidney cells)
V-79 (Chinese hamster kidney cells)
MG63 (osteoblast-like human cells)
Saos2 (human osteoblast-loke cells)
Baron (human fibroblasts)
U-937 (human monocyte-like line)
PRZYKŁADY LINII KOMÓRKOWYCH:
Media hodowlane (pożywki)
Zawierają: aminokwasy, witaminy,
sole Na, K, Ca, MG, Cl, PO, HCO,
glukozę 0.9g/l, osocze z krwi cielęcej 5-10%,
antybiotyki, hormony, czynniki wzrostu, pierwiastki śladowe
HODOWLE KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH
WARUNKI HODOWLI
pH: optymalne dla komórek 7,4
utrzymywane jest poprzez zachowanie
odpowiedniego stężenia CO2 (5%) w
inkubatorze
Temperatura: 37 C
Sterylne warunki pracy z
komórkami
W hodowli komórek zwierzęcych stosuje się dwie techniki:
Na stałym nośniku
W zawiesinie
Niektóre komórki (tzw. powierzchniowo zależne) mogą rosnąć
tylko na powierzchni stałej. Inne , wywodzące się z krwi lub
limfy (np. limfocyty T i B) mogą być hodowane tak jak
drobnoustroje- w zawiesinie w bioreaktorach do hodowli
wgłębnej.
TECHNIKI HODOWLI KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH
HODOWLA NA STAŁYM NOŚNIKU
Butelki płaskie
Komórki rosną na
dnie butelki
Szalki Petriego
Komórki rosną na dnie szalek
Mikrokuleczki
Zawieszone w pożywce
w bioreaktorze do
hodowli wgłębnej.
Komórki rosną na
powierzchni kuleczek
Kapilary
Z materiałów półprzezroczystych
w bioreaktorze
do hodowli wgłębnej
Komórki rosną na
powierzchni kapilar
Ten typ hodowli przypomina klasyczna hodowlę
mikroorganizmów, jednakże z uwagi na wrażliwość komórek
stosuje się bardzo umiarkowane mieszanie i napowietrzanie.
W celu uniknięcia osadzania komórek,
ściany pokrywa się substancjami
antyadhezyjnymi oraz dodaje
składniki przeciwdziałające
agregacji komórek (np. proteazy)
HODOWLA W ZAWIESINIE
Wytwarzanie szczepionek wirusowych
Namnożone komórki zaraża się wirusem, następnie komórki poddaje
się lizie a z płynu pohodowlanego wydziela się wirusy lub antygeny
Wytwarzanie interferonów
Związki hamujące rozwój wirusów w komórce( interferon α
wytwarzany przez leukocyty, interferon β przez fibroblasty,
interferon γ- przez limfocyty T obecnie mogą być otrzymywane w
wyniku hodowli in vitro
Wytwarzania przeciwciał monoklonalnych
Przeciwciała specyficzne przeciwko jednemu, ściśle określonemu
antygenowi
Oceny cytotoksyczności substancji
Oceny skuteczności leków
Odtwarzania tkanek i narządów- inżynieria tkankowa
ZASTOSOWANIE HODOWLI
KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Nowa ,interdyscyplinarna dziedzina wiedzy, której celem jest zastąpienie,
przywrócenie, udoskonalenie lub podtrzymanie funkcji tkanek i narządów,
uszkodzonych w wyniku urazu, choroby przewlekłej lub schorzeń
wrodzonych.
Przy pomocy implantów zawierających komórki własne pacjenta, osadzone
na specjalnych trójwymiarowych podłożach.
Komórki hodowane na płaskich podłożach, zachowują się jak
„indywidualne ” komórki, natomiast na podłożach 3D wytwarzają
przestrzenną tkankę.
INŻYNIERIA TKANKOWA
Robotyk
a
Genetyk
a
Inżynieria
materiałow
a
Praktyka
kliniczna
Biologia
molekularn
a
Biochemi
a
Fizjologi
a
INŻYNIERIA TKANKOWA -
ETAPY
Pobranie tkanki od pacjenta
Wyizolowanie i założenie
hodowli komórek in vitro
Osadzenie komórek na
trójwymiarowym rusztowaniu
(3D), stymulacja czynnikami
wzrostu
Dalsza hodowla w bioreaktorze
w warunkach in vitro
Implantacja w ciele pacjenta
Biozgodne brak cytotoksyczności
brak wł. kancerogennych
brak wł. mutagennych
brak wł. alergizujących
Łatwe (możliwe) przetwórstwo
Podatne na sterylizację
Ulegające biodegradacji / bioresorpcji
O odpowiedniej mikrostrukturze i właściwościach
powierzchniowych
WŁAŚCIWOŚCI MATERIAŁÓW NA
PODŁOŻA KOMÓRKOWE -
WYMAGANIA
PODŁOŻA TRÓJWYMIAROWE -
RODZAJE
włóknina
litografia
Kryształki soli (porogen)
INŻYNIERIA TKANKOWA-
REKONSTRUKCJA
CHRZĄSTKI
Z WYKORZYSTANIEM
AUTOGENICZNYCH
CHONDROCYTÓW
Pobranie chrząstki pacjenta
Laboratoryjna hodowla komórek
W trakcje operacji chora chrząstka
zostaje zastąpiona wyhodowanymi
chondrocytami
Zastosowanie: badania in vitro toksyczności, drażnienia, mutagenności,
fototoksycznośc
Wykorzystywane przez: firmy farmakologiczne, kosmetyczne, chemiczne,
do oceny nowych biomateriałów
MODELE TKANEK DO BADAŃ WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNYCH MATERIAŁÓW
MODELE TKANEK LUDZKICH DOSTĘPNE KOMERCYJNIE
Nabłonek oddechowy
Nabłonek jamy ustnej
Skóra ludzka
(keratynocyty i melanocyty)
Rogówka