PCR i jej modyfikacje

Reakcja łańcuchowa polimerazy,

PCR (ang. Polymerase Chain Reaction)



To łańcuchowa reakcja polimeryzacyjna

używana do amplifikacji (namnażania)
sekwencji DNA z użyciem pary
oligonukleotydowych starterów, z których
każdy jest komplementarny do jednego końca
docelowej sekwencji DNA.



Jest prostą techniką, dzięki której matrycowy

DNA jest szybko i precyzyjnie powielony in
vitro.

Komponenty PCR



Matryca



Startery



Enzymy



Bufor/Mg



dNTP

matryca

Wykazano, że podczas reakcji PCR uzyskuje się ogromne

zwielokrotnienie wyjściowej ilości DNA; można czasami
amplifikować nawet pojedynczą cząsteczkę wyjściowej
matrycy.

Dlatego też każde źródło, które dostarcza jednej lub więcej

docelowych cząsteczek DNA, może być w zasadzie
wykorzystywane jako źródło matryc dla PCR.

Dotyczy to matryc wyizolowanych z krwi, plemników, lub

każdej innej tkanki, a także z archiwalnych materiałów
stanowiących dowód w sądownictwie, z dawnych prób
biologicznych, lub w laboratoriach- z koloni bakteryjnych
albo łysinek fagowych, jak również z oczyszczonego DNA.

enzymy

Stosuje się termostabilne polimerazy DNA, które

zostały wyizolowane z wielu termofilnych
bakterii, a ich geny sklonowane.

Najbardziej popularną jest Taq polimeraza z

Thermus aquaticus.

Wytrzymuje ona etap denaturacji 95°C przez 1-

2 min i w tej temperaturze ma okres
półtrwania wynoszący ponad 2 h.

Bufor i dNTP



Do reakcji dodawany jest roztwór zawierający jednakowe stężenia dATP,

dCTP, dGTP i dTTP (dNTPs).



Stężenie dNTPs należy zoptymalizować w zakresie w zakresie 20-200 µM

(każdy). Wpływa ono na równowagę między wydajnością, specyficznością i

wiernością PCR.



Jony magnezu wpływają na



Specyficzność powstającego produktu



Tworzenie się dimerów starterów



Aktywność i wierność polimerazy



Temperaturę dysocjacji nici zarówno matrycy jak i produktu PCR



Przyłączanie się starterów do matrycy

Mieszanina reakcyjna powinna zawierać o 0.5 -2.5 mM większe stężenie

niż całkowite stężenie dNTPs

1993 r. Nagroda Nobla w dziedzinie chemii:

Kary B. Mullis za odkrycie PCR



Kary Banks Mullis (ur. 28 grudnia 1944 w

Lenoir, Karolina Północna, Stany Zjednoczone) –
amerykański biochemik uważany za wynalazcę
PCR, fundamentalnej dla biologii molekularnej
techniki, pozwalającej na kopiowanie
specyficznych sekwencji DNA. Za pracę w tej
dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993
Nagrodę Nobla.

Zalety PCR

PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu

badaniach genetycznych ponieważ:



Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu - wystarczy
znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach
oskrzydlających gen.



Stosowane startery nie muszą być komplementarne do
matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego
samego genu, które różnią się od siebie niewielkimi zmianami
w sekwencji.



Jednocześnie jest to metoda specyficzna - przy doborze
odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek
DNA



jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet
pojedynczej cząsteczki DNA.

MODYFIKACJE PCR



RT-PCR



Real time PCR



RACE PCR



RAPD-PCR



REP-PCR



RFLP-PCR



nested-PCR



inverse PCR (ITCR)



SFRA/AFLP

RT-PCR



modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako

matrycy. Na mRNA działamy odwrotną
transkryptazą (RT), która syntetyzuje DNA.
Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie
sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc
tylko egzonów. Powstałe DNA określamy jako
cDNA – komplementarne DNA.

Real Time PCR



wykorzystując techniki fluorescencyjne, pozwala na
monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym cyklu
prowadzonej reakcji PCR.



cała procedura analizy jest stosunkowo szybka i pozwala
wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu
reakcji.



możliwość wglądu w kinetykę reakcji, a co za tym idzie
możliwość oszacowania ilości produktu na początku
reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej metodzie
PCR.



amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja produktu
odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu, ryzyko
zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne.

RACE PCR



(ang.) Rapid Amplification of cDNA Ends PCR – szybka
amplifikacja końców cDNA)



celem jest poznanie dokładnej sekwencji jednego z końców RNA. W
zależności od analizowanego końca stosowana jest metoda 3'RACE
lub 5'RACE.



3'RACE



w technice 3'RACE wykorzystywany jest naturalnie występujący wśród
wielu mRNA łańcuch poliA, do którego komplementarnie łączy się DNA
posiadające na swoim końcu 3' sekwencję poliT. Przyłączony fragment
DNA jest następnie starterem dla reakcji odwrotnej transkrypcji.
Następnym etapem jest dwukrotne przeprowadzenie reakcji PCR typu
nested-PCR (pierwsza ze starterami zewnętrznymi, druga - z
wewnętrznymi). Dwukrotna reakcja ma na celu dokładniejszą eliminację
niepożądanych sekwencji (jeden z końców występuje powszechnie w
wielu różnych mRNA, a celem eksperymentu jest amplifikacja tylko
jednego). Tak otrzymany produkt możemy poddać sekwencjonowaniu.

RAPD-PCR



(Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA)-
metoda polega na użyciu jednego, krótkiego,
losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie
elektroforetycznej otrzymuje się różnej długości
prążki będące cechą charakterystyczną danego
osobnika (fingerprinting). Niestety przez niską
temperaturę łączenia starterów (konieczne by
uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma
niską powtarzalność, i wynik zależy od wielu
trudnych do określenia czynników (np. niewielkie
wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy
nagrzewania/chłodzenia)

REP-PCR



(Repetitive sequence - based PCR)- jest to PCR z
wykorzystaniem sekwencji repetytywnych(powtarzające się).

REP-PCR polega na wykorzystaniu w reakcji PCR starterów

komplementarnych do sekwencji repetytywnych występujących w
genomie.

Produkty reakcji rozdzielane są na drodze elektroforezy w żelu

agarozowym, tworząc swoisty wzór prążków, charakterystyczny dla
danego szczepu bakterii.

Metoda ma wysoką powtarzalność i ze względu na niski koszt i krótki

czas, w porównaniu np. do reakcji Rea-PFGE może być stosowana do
badania stopnia pokrewieństwa dużej liczby szczepów. Najczęściej
stosowane są startery komplementarne do rodziny sekwencji BOX i
ERIC

RFLP



(ang. Restriction Fragments Length Polymorphism – polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych).

RFLP jest wykorzystywany w technice, w której organizmy mogą być

różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA.

Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA

pociętych restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA powstają w
wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te
enzymy. Sekwencje polimorficzne RFLP, które wykrywa się tą metodą, są
używane jako znaczniki zarówno w mapach fizycznych jak i genetycznych.

Jest to metoda, która pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez

porównywanie charakterystycznych wzorów polimorficznych, które są
otrzymywane, gdy określone regiony łańcucha DNA są powielane (szczególnie
przy użyciu techniki PCR) i pocięte przez określone enzymy restrykcyjne.

RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych

alleli u osobników. Mapowanie polimorficznych długości fragmentów restrykcyjnych
jest także używane w hodowli roślin po to, by wykazać czy cecha taka jak np.
odporność na choroby, została odziedziczona. Podobnie jeżeli polimorfizm zostaje
wykryty w pobliżu miejsca gdzie występuje defekt genetyczny, RFLP jest
wartościowym znacznikiem pokazującym drogę dziedziczenia tego defektu. W
szczególności dana osoba może być zidentyfikowana dzięki tej metodzie przy badaniu
pozostałości krwi, włosów i nasienia i w związku z tym RFLP jest szeroko używana w
kryminalistyce. Z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych metoda ta pozwala na niemalże
pewne odróżnianie poszczególnych osób. Jednak nawet w przypadku identycznych
bliźniąt pojawiły się doniesienia o możliwości stosowania tej analizy DNA do ich
rozróżnienia.

Pierwszym przestępcą skazanym na podstawie takiego materiału dowodowego był w

1987 brytyjski piekarz Colin Pitchfork, skazany za dwa morderstwa połączone z
gwałtem; w 1989 doszło do pierwszego uniewinnienia w oparciu o badanie RFLP –
pierwotnie skazany na podstawie relacji świadków na 50 lat więzienia za gwałt i
porwanie,

Amerykanin Gary Dotson został uniewinniony po przeprowadzeniu badań DNA w kilka lat

po rozpoczęciu odbywania wyroku. Gdy stosowanie tej techniki dochodzeniowej zostało
nagłośnione, pojawiły się też pierwsze przypadki oszustw: w 1992 kanadyjski doktor
John Schneeberger, oskarżony o gwałt na pacjentce, wszczepił we własne ramię
zasobnik z obcą krwią i antykoagulantami, by uniknąć pobrania obciążającej go próbki
na potrzeby badań.

Porównanie fragmentów restrykcyjnych matki, dziecka i domniemanego ojca pozwala

także na potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa.

nested-PCR



nested-PCR- stosowany gdy dysponuje się

niewielką ilością matryc DNA. Jego istotą jest
synteza kilku długich fragmentów
zawierających interesujący nas fragment na
początku reakcji (dzięki czemu powielamy
nasz materiał badawczy) a dopiero w
następnym kroku dodajemy startery okalające
nasz badany odcinek.

inverse PCR (ITCR)



inverse PCR (ITCR)- metoda wykorzystuje

koliste cząsteczki DNA (powstałe w wyniku
cięcia genomowego DNA enzymami
restrykcyjnymi i ligowaniu tych fragmentów
przez ligazę DNA pochodzącą z faga T4), które
stanowią matrycę w reakcji PCR. Uzyskane
produkty PCR są mniejsze niż odpowiednie
produkty hydrolizy, ponieważ startery zostały
zlokalizowane na koncach 5' i 3' sekwencji
znanej, która ulega amplifikacji.

SFRA/AFLP



Wymaga bardzo małej ilości wyjściowego DNA i polega na
badaniu obecności lub braku amplifikacji specyficznych
fragmentów restrykcyjnych, podczas gdy w metodzie RFLP
porównujemy długość specyficznych fragmentów restrykcyjnych.



Pierwszym etapem testu AFLP jest trawienie identyfikowanego
DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi i przyłączanie do
fragmentów restrykcyjnych 10-30 sekwencji DNA, tzw.
adaptorów.



Pierwszy enzym trawi DNA z małą częstością, drugi natomiast- z
częstością dużo większą. W efekcie otrzymuje się wiele
fragmentów DNA o długości przeważnie mniejszej niż 500pz. Do
fragmentów restrykcyjnych dołączają się adaptory.



W drugim etapie następuje selekcja amplifikowanych
fragmentów restrykcyjnych.

ASA-PCR (ang. Allele Specific Amplification)

ASO-PCR

odwrócona PCR (ang. inverted PCR)

PCR-SSCP(analiza polimorfizmu pojedynczoniciowych fragmentów DNA)

PCR-HD (analiza hetrodupleksów)

PCR-DGGE (analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika
denaturującego)

RG-PCR

ACRS-PCR

ARMS-PC

10.

PCR-DGGE

11.

PCR-TGGE

12.

PCR-OLA

13.

PCR-CCM

14.

PCR-PTT



Reakcja łańcuchowa polimerazy

polega na

przeprowadzeniu wielu cyklicznych reakcji syntezy nici DNA
w tzw. termocyklerze.



Termocykler jest urządzeniem służącym do sterowania
temperaturą. Probówki znajdujące się w termobloku raz są
podgrzewane, a raz oziębiane. Zakres zmiany temperatury
zależy m.in. od długości odcinka DNA, który planujemy
powielić, od długości starterów oraz optimów
temperaturowych enzymów (polimeraz).



Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki wprowadzeniu
do pamięci termocyklera określonego programu, zazwyczaj
podanego w opisie metodyki, na podstawie której powielamy
badany DNA. Okresowe zmiany temperatury wywołują
różnego typu reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie
(np. 35 cykli), doprowadzają do powielenia, określonego
przez primery (startery), fragmentu DNA. Tak otrzymany
produkt poddajemy dalszej analizie.

Document Outline