ANNA LEŚNIKOWSKA
JOLANTA BIAŁASIEWICZ
SYLWIA KOKOCKA

METODY ROZDZIELCZE:

CHROMATOGRAFIA GAZOWA,
CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA,
CHROAMTOGRAFIA CIECZOWA,
ELEKTROFOREZA,

Wprowadzenie do chromatografii
gazowej

Chromatografia jest fizykochemiczną metodą

rozdzielania, w której składniki rozdzielane

ulegają podziałowi między dwie fazy: jedna jest

nieruchoma (faza stacjonarna), a druga (faza

ruchoma) porusza się w określonym kierunku.

Różny podział składników mieszaniny pomiędzy

obie fazy powoduje zróżnicowanie prędkości

migracji i rozdzielenie składników. Jeżeli fazą

ruchomą jest gaz to jest to chromatografia

gazowa.

Fazą stacjonarną w chromatografii gazowej może

być:

Fazą stacjonarną w chromatografii gazowej może
być:

· ciało stałe: adsorbent, wtedy mamy do czynienia
z chromatografią adsorpcyjną

· ciecz osadzona na stałym nośniku w postaci
jednorodnego filmu (warstwy), wtedy mamy
do czynienia z chromatografią podziałową

Mechanizm procesu chromatograficznego.

Substancje różowa i zielona charakteryzują się

zróżnicowanymi współczynnikami retencji k.

Faza ruchoma porusza się wewnątrz kolumny

natomiast faza stacjonarna jest osadzona na

wewnętrznych ściankach kolumny. Związki

chemiczne z większym powinowactwem do fazy

stacjonarnej są selektywnie zatrzymywane przez

nią i poruszają się wzdłuż kolumny znacznie

wolniej.

Związki z mniejszym powinowactwem do fazy

stacjonarnej poruszają się wzdłuż kolumny

szybciej i tym samym opuszczają kolumnę, czyli

eluują z kolumny, jako pierwsze. Równowaga

podziału pomiędzy fazy ma charakter

dynamiczny, czyli cząsteczki substancji

nieustannie

przechodzą od fazy ruchomej do stacjonarnej i z

powrotem.

Parametry chromatograficzne w

chromatografii gazowej

Podstawowym parametrem określającym podział
substancji X pomiędzy dwie fazy jest
stała podziału Kc, którą można wyrazić
równaniem Nernsta.

Cs
Kc = -----
Cm

gdzie: cs - oznacza stężenie substancji X w fazie stacjonarnej,
cm – oznacza stężenie substancji X w fazie ruchomej.

Innym ważnym parametrem jest współczynnik

retencji k, który jest miarą czasu, w jakim

substancja X przebywa w fazie stacjonarnej, w

stosunku do czasu, w którym przebywa ona w

fazie

ruchomej. Określa on, ile razy dłużej dana

substancja jest zatrzymywana przez fazę

stacjonarną niż

potrzebowałaby na przejście przez kolumnę z

prędkością poruszania się fazy ruchomej. Związki

chemiczne charakteryzujące się różnymi

współczynnikami retencji mogą zostać

rozdzielone na

kolumnie chromatograficznej.

liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej
k=-----------------------------------------------------------------------------
liczba moli substancji X w fazie ruchomej

Efekt rozdziału chromatograficznego jest

wykreślany w postaci chromatogramu, który

przedstawia wykres wskazań sygnału uzyskanego

w detektorze w funkcji czasu lub w funkcji

objętości fazy ruchomej. Zapis stężenia

pojedynczej substancji w funkcji czasu ma postać

krzywej

Gaussa i nosi nazwę piku (ang. peak czyli szczyt).

Typowy chromatogram przedstawiony jest na rys.

2. Możemy określić na nim:

· czas retencji tR - czas mierzony od momentu

wprowadzenia próbki na kolumnę do

momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny

maksimum stężenia danego związku

chemicznego czyli maksimum piku

L
tR = --------- X (1+k)
u

gdzie: L - długość kolumny chromatograficznej, u - średnia, liniowa prędkość
przepływu
gazu nośnego, k - współczynnik retencji,

· zerowy czas retencji tM (czas „martwy”) - czas

przebywania w kolumnie substancji,

która nie ma powinowactwa do fazy stacjonarnej

np. metanu; czas zerowy jest równy

czasowi przepływu fazy ruchomej przez kolumnę,

· zredukowany czas retencji t’R - jest różnicą

pomiędzy czasem retencji a zerowym

czasem retencji

t’R = tR - tM

tM
L
u = (6)
Rys.

-współczynnik retencji k

tR- tM

k=---------------------

tM

· szerokość piku mierzoną u podstawy piku w lub

szerokość piku mierzoną na określonej

wysokości piku np. w połowie wysokości w1/2h,

· liniową prędkość przepływu fazy ruchomej (u)

przez kolumnę można łatwo wyznaczyć

eksperymentalnie poprzez analizę

chromatograficzną substancji niezatrzymywanej

na

kolumnie np. metanu i zmierzenie czasu przejścia

jej przez kolumnę czyli czasu

zerowego (tM).

Chromatogram i sposób pomiaru podstawowych wielkości
chromatograficznych.

Chromatografia cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa (w skrocie z

ang. TLC = Thin Layer Chromatography) ma

szereg cech wspólnych z bibułową - posiada

wszystkie jej zalety, natomiast pozwala uniknąć

wielu jej wad. Fazę nieruchomą (adsorbent, ciecz

na nośniku, jonit, porowaty polimer) nanosi się

cienką warstwą (ok.0,25 mm) na płytkę szklaną

lub metalową w postaci drobnoziarnistego

proszku. Aby uzyskać powtarzalne wyniki analiz,

zarówno grubość warstwy, jak

i równomierność jej rozłożenia na wszystkich

używanych płytkach musi być taka sama.

Dlatego

stosuje się zwykle specjalne urządzenia do

nanoszenia sorbenta na płytki. Po naniesieniu

warstwy

sorbenta poddaje się ją suszeniu w temperaturze

100 - 1100C.

W odmianie adsorpcyjnej chromatografii

cienkowarstwowej najczęściej stosuje się jako

fazę

stacjonarną żele krzemionkowe (ok. 80%

zastosowań), niekiedy tlenek glinu, ziemię

okrzemkową i in. Możliwości doboru

rozpuszczalnika w chromatografii

cienkowarstwowej są

bardzo szerokie. Doboru rozpuszczalnika

dokonuje się zwykle na podstawie tzw. szeregu

eluotropowego rozpuszczalników ułożonego w

kolejności rosnącej polarności jego składników.

Analizowane mieszaniny wprowadza się na płytkę

identycznie jak w przypadku chromatografii

bibułowej. Do rozwijania chromatogramów stosuje

się najczęściej technikę wstępującą.

Wywoływanie chromatogramów przeprowadza się

po wysuszeniu płytki. tj. po odparowaniu

zawartego w niej rozpuszczalnika rozwijającego

podobnie jak w chromatografii bibułowej.

Rownież metody jakościowej i ilościowej

interpretacji chromatogramów są takie same

(wizualizacja chromatogramów, porównywanie

wartości Rf, pomiary ilościowe). W tym miejscu

jednak warto wymienić szereg ‘zalet

chromatografii cienkowarstwowej

w porównaniu z bibułową. Obok wspomnianej już

wcześniej możliwości stosowania

roznorodnych faz stacjonarnych w TLC istnieje

znacznie

większy asortyment substancji

rozwijających i wywołujących, ponieważ w

odróżnieniu od bibuły, stosowane sorbenty

nieorganiczne są odporne na silnie agresywne

związki, takie jak stężone kwasy, ługi, silne

utleniacze itp. Istotną zaletą TLC jest możliwość

szybkiego rozwijania chromatogramów.

Przeciętny czas rozwijania chromatogramu wynosi

ok. 1 godz. podczas gdy w chromatografii

bibułowej jest to proces często wielogodzinny.

Ponadto na ogół sprawność rozdziału techniką

TLC jest wyższa niż w chromatografii bibułowej.

Objawia się to w lepszym wykształceniu

plamek i mniejszych ich rozmiarach. Dzięki temu

osiąga się z reguły lepsze wyniki interpretacji

jakościowej i ilościowej analiz.

Elektroforeza

Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym,

w którym pod wpływem

przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają

się makrocząsteczki obdarzone

niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym.

Prędkość przemieszczania się naładowanej

elektrycznie makrocząsteczki zależy od jej

ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu

środowiska. Wykorzystując te zależności można

dokonać szybkiej separacji różnych

makrocząsteczek przy zastosowaniu stosunkowo

prostych urządzeń i przy relatywnie niskim

nakładzie kosztów.

Te względy zadecydowały o powszechności

zastosowań technik

elektroforetycznych.

Głównym obszarem zastosowań elektroforezy są:

biochemia białek i kwasów

nukleinowych, biologia molekularna,

farmakologia, medycyna sądowa, weterynaria,

diagnostyka medyczna oraz kontrola jakości

żywności. Należy również wspomnieć, że

wykorzystanie technik elektroforetycznych

umożliwiło uzyskanie pełnej sekwencji DNA

człowieka w niedawno zakończonym projekcie

genomiki (ang. genomics). Wszystkie

powszechnie stosowane techniki

sekwencjonowania DNA w końcowym swym

etapie opierają

się bowiem o elektroforezę.

Ze względu na sposób umieszczenia nośnika

elektroforetycznego można wyróżnić

elektroforezę kapilarną, elektroforezę pionową

oraz elektroforezę poziomą.

Elektroforeza kapilarna. W elektroforezie

kapilarnej, określanej często skrótem

HPCE (ang. high performance capillary

electrophoresis) elektrolit wypełnia kapilarę

o wewnętrznej średnicy 50 - 100 μm i długości 20-

30 cm. Oba końce kapilary zanurzone są

w zasobnikach z odpowiednimi elektrolitami.

Sama kapilara wypełniona jest swobodnym

elektrolitem (elektroforeza swobodna) lub

porowatym nośnikiem (elektroforeza na nośniku).

Czas rozdziału

jednej próbki wynosi około 10-20 minut. Detekcja

rozdzielonych grup makrocząsteczek

realizowana jest u ujścia kapilary przy pomocy

detektora o konstrukcji zbliżonej do

przepływowego detektora stosowanego w

chromatografii cieczowej.

Elektroforeza pionowa - jest najpowszechniej

stosowną techniką. W technice tej

nośnik elektroforetyczny wypełnia szklane rurki

(elektroforeza rurkowa) lub znajduje się

pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi

przekładkami dystansowymi (ang. spacer)

(elektroforeza płytowa). Na rysunku 1 pokazano

schematycznie oba rodzaje elektroforezy

pionowej.

Na rysunku 1 pokazano schematycznie oba

rodzaje elektroforezy

pionowej.

A. elektroforeza rurkowa
B. elektroforeza płytowa

Jak łatwo zauważyć, górna część nośnika musi

być przykryta warstwą buforu

elektrodowego (elektrolitu). Rozwiązanie takie ma

naturalną tendencję do wyciekania

buforów z górnego naczynia, co wymaga uwagi

laboranta podczas trwania rozdziału. Brak

kontaktu elektrolitu z żelem powoduje przerwanie

obwodu elektrycznego i w związku z tym

przerwanie procesu elektroforezy.

Inną niedogodnością tego rozwiązania jest

trudność z odprowadzeniem ciepła generowanego

przez przepływający prąd. Dotyczy to szczególnie

elektroforezy rurkowej. W przypadku elektroforezy

płytowej możliwe jest odprowadzanie

ciepła przez ściankę kontaktującą się z jedną z

płyt. Zaletą tego typu rozwiązania jest zwykle

stosunkowo niska cena dostępnych na rynku

aparatów.

Elektroforeza pozioma - jest rodzajem

elektroforezy w którym nośnik umieszczony

jest w płaszczyźnie poziomej (rys. 2). Zaletą tego

rozwiązania jest brak wycieków elektrolitu

oraz możliwość łatwego odprowadzenia ciepła

generowanego w trakcie przepływu prądu.

Elektroforeza półsucha, w której bufory

elektrodowe zamknięte są w zestalonej agarozie

lub

w warstwach bibuły filtracyjnej, pozwala ponadto

na znaczne ograniczenie zużycia

chemikaliów niezbędnych do przygotowania

buforów.

A. elektroforeza zanurzeniowa
B. elektroforeza półsucha