Opracowanie na zaliczenie praktyczne z mikrobów

Prątki kwasooporne-

Mycobacterium tuberculosis

•Preparat bezpośredni
•Metoda Ziehl- Neelsena

Barwienie metodą Ziehla-Neelsena
1. na utrwalony rozmaz bakterii na
odtłuszczonym szkiełku podstawowym
nanosimy barwnik podstawowy
(stężona

fuksyna

) na 15 min. W trakcie

barwienia podgrzewamy

preparat

palnikiem (do tzw. "trzech par")
2. zlewamy barwnik. Nie spłukujemy

wodą destylowaną

3. odbarwiamy preparat w 3%
roztworze HCl w

etanolu

(

kwaśny alkohol

)

4. spłukujemy wodą destylowaną
5. nanosimy barwnik kontrastowy, np.

błękit metylenowy

na 10 min.

6. spłukujemy wodą destylowaną
7. suszymy preparat na pasku bibuły i
8. przeprowadzamy obserwacje w

mikroskopie świetlnym

zastosowaniem

imersji

Podłoże McConkeya:

- wybiórcze – uniemożliwia wzrost bakteriom

Gram(+) -> ponieważ zawiera fiolet

krystaliczny i sole źółciowe

- różnicujące -> laktoza (różnicowanie

laktozo-ujemnych i laktozo-dodatnich)

Podłoże zawiera barwnik (zwykle obojętny

barwnik czerwony) barwiący kolonie

fermentujące laktozę na różowo.

W preparacie mikroskopowym wszystkie

Gram(-) wyglądają identycznie!

Płytka z podłożem Chapmana (MSA) z wysianymi szczepami:

aureus,

epidermidis i Micrococcus sp.

Pożywka Chapmana - jest to

pożywka

typu wybiórczo-różnicującego

stosowana do hodowli

gronkowców

. Wykorzystuje się w niej fakt, że stafylokoki

(gronkowce) są w stanie rosnąć przy wysokim stężeniu

chlorku sodu

w przeciwieństwie do większości pozostałych bakterii. S. aureus i S. saprophyticus
fermentują mannitol, natomiast S. epidermidis nie (element różnicujący pożywki).
S. aureus można odróżnić od saprohyticus testem na

koagulazę

– po

wrzuceniu do krwi pierwszy ścina osocze, drugi nie.

[1]

S. aureus -

gronkowiec złocisty

w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych

wzrasta w postaci kolonii otoczonych żółtą strefą - zmiana barwy podłoża z
różowej na żółtą jest wynikiem rozkładu mannitolu i zakwaszeniu środowiska.
Podobnie zachowują się niektóre szczepy

Staphylococcus

saprophyticus,

wykazujące te właściwości w warunkach tlenowych.

Staphylococcus

epidermidis

nie rozkłada mannitolu i rośnie w postaci białych kolonii nie powodując zmiany
barwy podłoża.

[2]

Poza czynnikami wzrostu (

bulion

pepton

)

agar

zawiera również NaCl

(zazwyczaj w stężeniu 7,5% dla zahamowania wzrostu bakterii innych niż
gronkowce)
,

mannitol

oraz czerwień fenolową.

MSBL

Identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów oporności na linkosamidy,

makrolidy i streptograminy B – schemat algorytmu:

1. Szczepy wrażliwe na erytromycynę mogą być:

a) wrażliwe na linkomycynę/klindamycynę – nie stanowią one wtedy dużego problemu

klinicznego

b) oporne na linkomycynę i na klindamycynę:

- taką oporność warunkuje L-fenotyp, mechanizm związany z genem oporności lin(A)

- w zakażeniach szczepami z tego rodzaju opornością nie należy stosować linkomycyny i

klindamycyny!!

- przy wyniku wskazującym na L-fenotyp zaleca się powtórzenia badania w celu

wykluczenia błędu

2. Szczepy oporne na erytromycynę mogą być:

a) oporne na linkomycynę i klindamycynę:

- taki fenotyp oporności określamy jako MLS b konstytutywny!!

- mechanizm oporności związany jest z genem erm

- w takich przypadkach nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów i

streptogramin z grupy B!!

b) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę ze spłaszczeniem strefy zahamowania

wzrostu:

- taki fenotyp odporności określamy jako MLSb indkukcyjny!!

- mechanizm oporności również związany z genem erm

- tu również nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów ani

streptogramin grupy B!!

c) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę przy braku spłaszczenia strefy zahamowania

wzrostu:

- ten fenotyp odporności określamy jako MSb

- mechanizm związny jest z genem msr(A)

- w takich przypadkach nie powinno się stosować makrolidów 14- i 15-węglowych ani

streptogramin grupy B

Oporność Enterokoków na wysokie stężenia aminoglikozydów
(oznaczanie HLAR):
1. oznaczanie metodą krążkowo-dyfuzyjną:
- krążki z dużym stężeniem gentamycyny (Ge-120 ug) i streptomycyną
(S-300 ug)
- oporność na takie stężenia tych dwóch antybiotyków określamy
mianem HLAR
- oporność na gentamycynę oznacza oporność na wszystkie
aminoglikozydy,
nie zawsze jednak oznacza pełną oporność na streptomycynę (inny
mechanizm)
2. szczepy oporne na gentamycynę ale wrażliwce na streptomycynę
możemy
leczyć streptomycyną w połączeniu z beta-laktamami (penicylina,
ampicylina)
oraz glikopeptydami!!
3. szczepy HLAR najczęściej są wrażliwe na inne antybiotyki:
penicylinę,
wankomycynę, teikoplaninę, ale mogą też wytwarzać beta-laktamazę
co czyni je
niewrażliwymi na beta-laktamy

1. ESBL:
- są to β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (extended spectrum β-lactamases)

-warunkują oporność na penicyliny, cefalosporyny I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny!)

-oraz na monobaktamy (aztreonam)

-są wrażliwe na inhibitory β-laktamaz, choć często efekt ten nie wystarcza, by

-szczepy były wrażliwe na połączenie beta-laktam+inhibitor
- geny tych enzymów znajdują się na plazmidach
- występują głównie u fermentujących, najczęściej u Klebsiella pneumoniae

-wywodzą się od β-laktamaz o szerokim spektrum, które dodatkowo poszerzone

-zostało o II-IV generację cefalosporyn (są wtórnymi beta-laktamazami)

-bakterie posiadające ESBL są wrażliwe na: karbapenemy, cefamycyny oraz na

-beta-laktamy w połączeniu z inhibitorami beta-laktamaz!
- należą do klasy AID

-powstały i powstają na nowo z beta-laktamaz o szerokim spektrum substratowym:

-TEM-1, TEM-2, SHV-1; w wyniku mutacji punktowych dochodzi do poszerzenia

-spektrum substratowego enzymów

-wspomniane enzymy (beta-laktamazy) o szerokim spektrum nadają oporność na

-aminopenicyliny, karboksypenicyliny, również (w dużych ilościach): ureidopenicyliny,

-cefalosporyny I generacji i cefoperazon; (w przypadku ESBL spektrum dodatkowo

-rozszerzone o II-IV generacja cefalosporyn)

-ok. 150 wariantów ESBL należących do 10 rodzin: TEM, SHV, CTX-M itd. - najczęściej

-występują u Klebsiella pneumoniae i E. coli
- poszczególne enzymy mają różną selektywność, aktywność -> preferencje substratowe
- poszczególne enzymy różnią się też aktywnością enzymatyczną i poziomem produkcji

-często szczepy produkujące ESBL pozostają wrażliwe in vivo na niektóre beta-laktamy

- należące do spektrum ESBL

-znane są gatunki Enterobacteriaceae u których gatunkowo specyficzne beta-laktamazy

-spełniają kryteria ESBL

Metycylinooporność:

-szczepy gronkowców oporne na metycylinę (MRSA, MRSNS) są oporne in vivo na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe

-(tj. penicyliny, penicyliny skojarzone z inhibitorami beta-laktamaz, cefalosporyny, karbapenemy).
CA-MRSA:

-nowym problemem diagnostycznym i epidemiologicznym jest pojawianie się szczepów MRSA w środowisku pozaszpitalnym czyli

- CA-MRSA

-szczepy te charakteryzują się heterogennym poziomem oporności na antybiotyki beta-laktamowe, co niesie z sobą ryzyko nierozpoznania tego

-mechanizmu w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej a co za tym idzie – niepowodzeń terapeutycznych

-szczepy CA-MRSA poza opornością na antybiotyki beta-laktamowe związaną z metycylinoopornością, są wrażliwe na różne antybiotyki innego typu,

-podczas gdy szczepy HA-MRSA są zwykle wielolekooporne
- w przeciwieństwie do HA-MRSA, większość szczepów CA-MRSA posiada gen leukocydyny Panton-Valentine (PVL – Panton-Valentine leucocidin)
- PVL należy do cytotoksyn powodujących martwicę tkanek i lizę leukocytów

-obecność w genomie CA-MRSA genów PVL uznaje się za marker informujący nas, że mamy do czynienia ze szczepem pozaszpitalnym odmiennym

-od klonów szpitalnych!!
CA-MRSA – klinika:
- najczęściej powodują pierwotne zakażenia skóry i tkanek miękkich oraz martwicze zapalenie płuc, któremu często towarzyszy bakteriamia
- w przeciwieństwie do HA-MRSA, zakażenia CA-MRSA występują u osób młodych i bez czynników ryzyka

-75% przypadków martwiczego zapalenia płuc wywołanego przez CA-MRSA kończy się zgonem, średnia przeżywalność wynosi 4 dni, często jest

-ono wynikiem powikłań pogrypowych
Gronkowce skórne i koagulazo-ujemne szybciej nabierają oporności.
MRSA stanowi 10-25% gronkowców.
MRSA:

-dobrze zaadaptowane do przeżycia w warunkach szpitalnych, są bardzo łatwo przekazywane z pacjenta na pacjenta w obrębie oddziałów szpitalnych

-oraz pomiędzy szpitalami
- kolonizują osoby w wieku podeszłym oraz poważnie chore
- HaMRSA - Pol1 - najczęstszy
- HaMRSA - Pol2
Glikopeptydy - są skuteczne w leczeniu MRSA; zaburzają one syntezę ściany komórkowej bakterii
- wiążą się z warstwą peptydoglikanu a następnie swoiście z końcową amino-acylo-D-alanylo-D-alaniną rosnącego peptydoglikanu
Metycylinooporność:
- homogenna - wszystkie komórki są niewrażliwe
- heterogenna - 2/3 komórek jest niewrażliwych, ale reszta jest wrażliwa
VRSA:
- oporny na wankomycynę S. aureus
- mechanizm oporności polega na wytwarzaniu zmienionych prekursorów peptydoglikanu (D-Ala-...)
VISA:
- średnio wrażliwy na wankomycynę S. aureus
- polega na wiązaniu docelowego antybiotyku zanim osiągnie miejsce docelowego działania
hVISA:
- S. aureus średnio wrażliwy na wankomycynę, o heterogennej ekspresji oporności inaczej: S. aureus z obniżoną wrażliwością na wankomycynę
Zdarzają się pojedyncze przypadki VRSA u pacjentów z grup ryzyka (cukrzycą, niewydolnością nerek)

Nowe opcje terapeutyczne w leczeniu zalażeń o etiologii VRSA, VISA,
VRSA :
- streptograminy (chinupristyna B, dalfopristyna A)
- linezolid
- telitromycyna (ketolidy)
- tigecyklina (glicylcykliny – pochodne minocykliny)
- daptomycyna – nowy lek z grupy lipopeptydów, do stosowania
parenteralnego
Wskazania:
- leczenie powikłanych zakażeń skóry i tkanek miękkich, bakteriemii i
infekcyjnego zapalenia wsierdzia wywołanego przez Staphylococcus spp. i
Streptococcus spp. z wyjątkiem S. pneumoniae!
Oksazolidynony:
- chemioterapeutyki
- przedstawiciele: linezolid, eprezolid
- działają bakteriostatycznie
- ich mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy białka na bardzo
wczesnym etapie (kompleks inicjatorowy translacji w rybosomach
bakteryjnych)
Lipopeptydy, glikopeptydy, glikolipidy:
- powodują depolaryzację błony cytoplazmatycznej i ucieczkę jonów potasu

Leczenie zakażeń szczepami produkującymi ESBL:
- nie stosować penicylin, cefalosporyn I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny), monobaktamów

-w terapii stosujemy połączenia penicyliny z inhibitorami beta-laktamaz oraz antybiotyki innych grup

-(aminoglikozydy, fluorochinolony, karbapenemy)
Wykrywanie ESBL:
a) test dwóch krążków:

•krążki:

CAZ - ceftazidym – najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klas TEM i SHV, które są

wobec

niego bardzo aktywne

CTX - (cefotaxym – najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klasy CTX-M, które są wobec

niego

bardziej aktywne niż inne ESBL),

AMC (amoksycylina-klawulonian - w centrum)

Krążki ułożone są w odległości 2 cm (25-30 mm) od siebie.

•wynik odczytujemy jako dodatni (obecne ESBL), jeśli strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z

•ceftazidymem (lub cefotaksymem) rozszerza się też na rejon wokół krążka z połączeniem penicyliny i i

•nhibitora (AMC – amoksycylina+klawulonian) – synergizm inhibicyjny

b) metoda :krążków kombinowanych” (combined disc method):

•porównuje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z połączeniem cefalosporyny i

• inhibitora beta-laktamaz (kwas klawulanowy; jest to tzw. krążek „kombinowany”) ze strefą zahamowania

•wzrostu wokół krążka z samą cefalosporyną (bez inhibitora)

β-laktamazy AmpC:

-gatunkowo specyficzne, występują u szczepów: Enterobacter, Citrobacter,

-Serratia, Morganella, niektóre szczepy E. coli

-enzymy o bardzo szerokim spektrum: warunkują oporność na: aminopenicyliny,

-ureidopenicyliny, piperazynopenicyliny, cefalosporyny I-III generacji, monobaktamy,

-cefalosporyny o szerokim spektrum działania (cefamycyny)
- są niewrażliwe na działanie inhibitorów β-laktamaz
- geny tych enzymów znajdują się na chromosomie bakteryjnym – genoforze

-istnieją mutanty konstytutywnie wytwarzające β-laktamazy AmpC – określane są

-mianem szczepów zdereprymowanych

-leczenie: imipenem, meropenem

MBL – metalo β-laktamazy czyli karpapenemazy:
- metalozależne – kofaktorem jest przede wszystkim cynk
- są elementem naturalnej oporności na antybiotyki u Stenotrophomonas maltophila

-u Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter oraz Enterobacteriaceae (Serratia, Shigella,

- Klebsiella, Citrobacter itd.) są elementem oporności nabytej
- występują głównie u pałeczek niefermentujących
Wykrywanie MBL:
- CAZ, kwas 2-merkaptopropionowy
- IMP, EDTA (imipenem + EDTA)
- E-test
Kwas 2-merkaptopropionowy i EDTA są inhibitorami MBL, dlatego:

-pojawia się strefa przejaśnienia wokół krążka z ceftazidimem lub imipenemem od

-strony krążka zawierającego inhibitor

E-test:

•pełna nazwa: Epsilometer test

•służy do oznaczania wartości MIC

•na krążek z agarem, na który wysiano bakterię nakładany jest nasączony antybiotykiem pasek

•z narysowaną skalą

•antybiotyk dyfunduje tworząc gradient stężenia w agarze (najczęściej agar MH - Muellera-Hintona)

•powstaje eliptyczna strefa zahamowania wzrostu

•punkt w którym granica strefy zahamowania wzrostu przetnie się z paskiem wyznacza wartość MIC

•dla badanego szczepu
Przykład E-testu (eliptyczne przejaśnienie – strefa zahamowania wzrostu):

Document Outline