ANALIZA USZKODZEŃ 
DNA

23-24. 03. 2011
E. Ignatowicz

 

 

Przyczyny uszkodzeń DNA endogenne: błędy replikacji, reaktywne 
formy tlenu
 (źródła RFT w warunkach fizjologicznych i patologicznych)
Egzogenne: RFT pojawiające się w wyniku metabolizmu 
ksenobiotyków (jakich?), ekspozycji na promieniowanie jonizujące i 
UV, tworzenie dimerów pirymidynowych

Skutki działania RFT na kwasy nukleinowe: utlenianie zasad, tlenowa 
deaminacja,  przerwy pojedynczej/podwójnej nici, miejsca 
apurynowe/apirymidynowe, wiązania krzyżowe, addukty DNA z 
produktami peroksydacji lipidów

Uszkodzenia wynikające z działania interkalujacych związków 
chemicznych (jakich?), toksyn roślinnych (psoralenów), toksyn 
środowiskowych. Chemioterapia: leki alkilujące, antymetabolity.

Działanie policyklicznych węglowodorów aromatycznych na DNA – 
ten temat można powiązać z analizą adduktów metodą 

32

P – 

postlabelingu.

 

 

USZKODZENIA DNA:  MODYFIKACJA 

ZASAD

•

I. POJEDYNCZE ZASADY

•

   A. Deaminacja cytozyny do uracylu 

•

   B. Deaminacja adeniny do hipoksantyny 

•

   C. Alkilacja 

•

   D. Insercja lub delecja nukleotydu 

•

   E. Inkorporacja analogu zasady 

•

   F. Depurynacja 

•

II. DWIE ZASADY 

•

    A. Indukowane światłem UV tworzenie dimerów 

tyminy 

•

    B. Tworzenie wiązań krzyżowych 

 

 

USZKODZENIA DNA: MODYFIKACJE 

ŁAŃCUCHA

• III. PRZERWY POJEDYNCZEJ/PODWÓJNEJ NICI 
•     A. Promieniowanie jonizujące
•     B. Reaktywne formy tlenu 

• IV. WIĄZANIA KRZYŻOWE
•    A. Pomiędzy zasadami w tym samym 

łańcuchu lub   łańcuchu dopełniającym  

•    B. Pomiędzy DNA i białkami, np. histonami 

 

 

„ENDOGENNE” CZYNNIKI TWORZĄCE 

WIĄZANIA KRZYŻOWE W DNA

• KWAS AZOTAWY POWSTAJE W ŻOŁADKU 

Z PRODUKTÓW SPOŻYWCZYCH

• PRODUKTY PEROKSYDACJI LIPIDÓW 

(MDA) → ETENOADDUKTY

• HCHO (wiązania krzyżowe DNA-białko i 

białko-białko) 

 

 

PROMIENIOWANIE   KSENOBIOTYKI    INFEKCJE     AUTOUTLENIENIE 

  

.

OH

 PUFA

TOKSYCZNE ALDEHYDY

 

 

DNA

TLENOWE 
MODYFIKACJE
ZASAD

  
ADDUKTY

PROMIENIOWANIE   KSENOBIOTYKI    INFEKCJE

.

OH

POŚREDNIE I BEZPOŚREDNIE ODDZIAŁYWANIE RFT Z 
DNA

 

 

POWSTANIE MIEJSCA 

APURYNOWEGO

 

 

Uszkodzenia DNA a mutacje

Naprawa uszkodzeń DNA – krótkie przypomnienie wiadomości z 
biochemii
(BER, NER, MMR, NHEJ)

Odpowiedź komórek na uszkodzenia DNA

Cykl komórkowy, punkty kontrolne - krótkie przypomnienie wiadomości z 
biochemii

 

 

Wywołanie biologicznych następstw 

uszkodzeń DNA i schemat naprawy

 

DNA* - cząsteczka uszkodzona, DNA** - cząsteczka błędnie naprawiona 

 

 

NAPRAWA USZKODZONEGO DNA

• Bezpośrednie „odwrócenie” uszkodzenia 

– nie jest wymagana matryca, nie 

zachodzi przerwanie pojedynczej nici:

– Tworzenie dimerów tyminy pod wpływem UV – 

dodatkowe wiązania kowalencyjne pomiędzy 

sąsiednimi T – fotoreaktywacja przy udziale 

fotoliazy (aktywność zależna od absorpcji 

światła 300-600 nm)

– Metylacja guaniny odwracana przez 

aktywność MGMT (metylotransferaza), reakcja 

stechiometryczna a nie katalityczna, 1 

cząsteczka MGMT może być użyta 1x); MGMT 

jest indukowana przez niskie dawki czynników 

alkilujacych, warunkuje oporność komórek 

nowotworowych na chemioterapię

 

 

ODPOWIEDŹ KOMÓREK NA USZKODZENIA DNA

 

 

TECHNIKI ANALITYCZNE SŁUŻĄCE DO 

OCENY USZKODZEŃ DNA

• Elektroforeza kometkowa
• GC/MS
•

32

P-postlabeling

• Zsynchronizowana 

spektrofotometria 
fluorescencyjna

 

 

ELEKTROFOREZA KOMETKOWA

 

 

GC/MS

• Kolumna kapilarna wypełniona nośnikiem, stały przepływ gazu, 

który nie reaguje z nałożoną próbką (argon, hel, wodór, azot)

• Spektrometria mas (MS): cząsteczki naładowane elektrycznie 

przechodzą przez pole magnetyczne – rozpad naładowanych 

cząsteczek i identyfikacja fragmentów obciążonych ładunkiem, 

identyfikacja całej cząsteczki „poskładanej” z fragmentów

• Próbka do analizy MS musi mieć postać gazu (waporyzacja); w 

komorze jonizacyjnej cząsteczki rozpadają się na jony w kolizji z 

elektronami (M+  lub M

+

.); każdy jon indywidualnie wchodzi do 

akceleratora. Wszystkie jony mają te samą energię kinetyczną. 

Określone napięcie powoduje przejście tylko jednego 

naładowanego fragmentu do detektora

• Zderzenie jonu z powierzchnią detektora wybija elektrony 

(fotopowielacz – wzmocnienie ładunku)

• Elektrony wychwytywane w kolektorze – pomiar ładunku

• Masa proporcjonalna do wykrytego ładunku: m/z 

• Wykres widma masowego: każdy pik odzwierciedla inny fragment 

struktury cząsteczki; cząsteczka w całości – największa masa 

widma (jon molekularny; „masa macierzysta”) 

• Ograniczenia metody: zdolność rozdzielcza detektora

 

 

Policykliczne węglowodory 

aromatyczne są kancerogenne 

po aktywacji metabolicznej, 

która może prowadzić do 

powstawania adduktów – 

produktów interakcji metabolitów 

chemicznych kancerogenów z 

DNA. 

Addukty kancerogen - DNA 

uważane są za krytyczne 

uszkodzenia decydujące o 

inicjacji procesu 

nowotworowego.

 

32

P-POSTLABELING: WYKRYWANIE ADDUKTÓW,

np. kancerogen-DNA

W badaniach in vitro lub na zwierzętach możliwe jest 
zastosowanie kancerogenów znakowanych izotopami 
(tryt)

 

 

•

Wyizolowany DNA 

jest hydrolizowany 

enzymatycznie do 

nukleotydów

Nukleaza P1 

rozkłada 

niezmodyfikowane 

nukleotydy

Znakowanie 

32

P 

pozostałych 

nukleotydów w 

pozycji 5`

Chromatografia TLC

Autoradiografia

Hydroliza 
enzymatyczn
a

Mikrokokalna 
nukleaza 
fosfodiesteraza II

Np(m

5

Cp+Cp+Tp+Ap+Gp)

+G

*

p+A

*

p

Nukleaza P

1

N+pi+G

*

p+A

*

p

32

P-

labeling

32

P-G

*

p+

32

P-

A

*

p

Rozdział 
chromatograficzny

32

P-POSTLABELING

 

 

Pomiar 

zsynchronizowanej 

spektrofotometrii 

fluorescencyjnej – 

rejestrowanie 

widma 

fluorescencyjnego 

przy zmiennej 

długości fali 

wzbudzenia i 

emisji, ale przy 

utrzymywaniu 

stałej różnicy 

między tymi 
wartościami

Δλ=34 nm

a – wzorcowe 

addukty 

DNA:kancerogeny

b – DNA izolowane 

z próby badanej

ZSYNCHRONIZOWANA SPEKTROFOTOMETRIA 

FLUORESCENCYJNA