Diagnostyka
serologiczna kiły
Diagnostyka
serologiczna kiły
Diagnostyka serologiczna
kiły
„ seks i choroby przenoszone
drogą płciową są
nierozerwalnie związane z
życiem człowieka”
KIŁA – SYPHILIS, LUES
przewlekła, ogólnoustrojowa
choroba zakaźna
przebieg z okresami
bezobjawowymi
czynnik etiologiczny krętek blady
(Treponema pallidum)
drogi zakażenia: głównie kontakty
seksualne i droga wertykalna
KIŁA NABYTA WCZESNA
(Lues recens):
Kiła pierwszego okresu do 9 tyg.
(lues primaria)
Kiła drugiego okresu wczesna
od 9
do 16 tyg.
(lues secundaria recens)
Kiła drugiego okresu nawrotowa od 16
tyg. do 2 lat
(lues secundaria recidivans)
Kiła utajona wczesna
do 2 lat
(lues latens recens)
KIŁA PÓŹNA
(Lues tarda)
Kiła późna utajona
powyżej 2 lat (lues latens
tarda)
Kiła późna objawowa
powyżej 5 lat
(lues tarda simptomatica, lues tertiaria)
kiła późna skóry, błon śluzowych i kości
(lues tarda cutis, mucosae et ossium)
kiła sercowo-naczyniowa
powyżej 10-15 lat
(lues cardio-vascularis)
kiła układu nerwowego
powyżej 10-15 lat
(lues nervosa)
kiła innych narządów
(lues visceralis)
RÓŻNICOWANIE OSUTEK
WCZESNYCH I
NAWROTOWYCH
Osutka wczesna
(LII recens)
plamki, rzadko grudki
wykwity jednakowej
wielkości
nie grupują się
nie szerzą się
obwodowo
osutka bardzo obfita
rozmieszczona
symetrycznie
ustępuje bez
złuszczania
nie pozostawia śladu
Osutka nawrotowa
(LII recidivans)
grudki i/lub plamki i/lub
krostki
wykwity różnej wielkości
grupują się
szerzą się obwodowo
osutka mniej obfita
niesymetryczne
rozmieszczenie wykwitów
ustępowaniu wykwitów
towarzyszy złuszczanie ich
powierzchni
może pozostawić
przebarwienia i blizny
Treponema pallidum
Mikroskopia skannigowa
Systematyka
Cechy
Domena
prokariota
Królestwo
bakterie
Kształt bakterii
krętki
Barwienie metodą Grama ujemne
Nazwa systematyczna
Treponema pallidum
Treponema pallidum
Znanych jest pięć podgatunków:
• T. pallidum pallidum (kiła)
• T. pallidum pertenue
(frambrezja)
• T. pallidum carateum (pinta)
• T pallidum trirocllinum (kiła i
pinta)
• T. pallidum endemicum (bajel)
Treponema pallidum
• Krętek blady ma kształt spirali o
skrętach regularnych i trwałych, nie
deformujących się w ruchu.
• Długość waha się od 8-20 μm (w
przypadku leczenia penicyliną bądź w
hodowli są dłuższe).
• Grubość krętków: od 0,25 – 0,5 μm.
• Krętki posiadają rodzaj osłonki
(periplast), barwiący się barwnikiem
Giemsy na słabo różowo, który posiada
ciała tłuszczowe.
Treponema pallidum
• Na biegunach krętka widoczne jest
niekiedy wydłużenie periplastu w
rzęski (cecha niestała).
• Krętek najlepiej jest widoczny w
ciemnym polu, pod immersją, w
preparatach niebarwionych !!!
Treponema pallidum
• Ruch jest bardzo
charakterystyczną cechą krętków
bladych i stanowi podstawę
różnicowania krętkami bladymi a
krętkami niechorobotwórczymi
(występują na błonach śluzowych
jamy ustnej i narządów płciowych)
Treponema pallidum
Krętek blady posiada ruch:
• Postępujący
• Obrotowy (dookoła osi podłużnej)
• Wahadłowy (dookoła osi poprzecznej)
Ruchy krętka cechują się
równomiernością i przypominają
sprężynę zginaną i zawsze
powracającą do pozycji wyjściowej.
Treponema pallidum
Skręty krętków bladych nie ulegają
zmianie w trakcie poruszania
się .
Szybkość posuwania się krętków
zależy od lepkości środowiska (np.
rozcieńczenie badanego preparatu).
Treponema pallidum
• Podział krętków dokonuje się
przez przewężenie w części
środkowej (podział poprzeczny).
• Krętki blade w ciemnym polu
widzenia są widoczne w postaci
błyszczących, delikatnych
spiralek o spokojnych i równych
ruchach oraz trwałych skrętach
Identyfikacja krętka bladego
Kiła pierwszego okresu:
• Objaw pierwotny Huntera
(często)
• Węzły chłonne (często)
Kiła drugiego okresu:
• Lepierze płaskie (rzadko)
• Zmiany przymieszkowe (rzadko)
Kiła trzeciego okresu:
• Kilaki (niekiedy)
Epidemiologia
Zachorowalność:
• 5-7/ 100 000 mieszkańców,
Polska
• 1,5-1,8/ 100 000 mieszkańców,
Europa Zachodnia
• 269/ 100 000 mieszkańców, Rosja
Badanie przesiewowe
(skriningowe, skrining)
Badanie przesiewowe (skriningowe,
skrining) w medycynie to rodzaj
strategicznego badania, które
przeprowadza się wśród osób nie
posiadających objawów choroby,
którą dany test mógłby wykryć.
• wykrycie choroby we wczesnej fazie
• umożliwienie wczesnej interwencji
(redukcja cierpienia pacjentów w
danej chorobie oraz śmiertelności)
• doprowadzić do postawienia
wstępnej diagnozy
Badanie przesiewowe
(skriningowe, skrining)
• zawsze musi być potwierdzone
innymi badaniami (bardziej
dokładnymi)
• Istnieją potencjalne negatywne
skutki badań skriningowych, takie
jak: postawienie fałszywej
diagnozy
• wykazywać się dobrą swoistością,
przy akceptowalnej czułości,
zwłaszcza w przypadku chorób o
niskiej zapadalności.
Metody wykrywania krętków
• Barwienie metodą Giemsy , „delikatny
fiołkoworóżowy kolor”, preparat
trudny technicznie do wykonania.
• Barwienie tuszem (krętki nie barwią
się tuszem i są widoczne w postaci
jasnych spiralek na ciemnym tle)
• Badanie krętków w ciemnym polu
widzenia (tylko promienie boczne,
załamane pod kątem 45º, tło jest
czarne, a preparat stanowią świecące
krętki).
Metody wykrywania krętków
• Badanie imunofluorescencyjne
(IF)
• Badanie immunoenzymatyczne
(ELISA)
• Badanie molekularne (PCR)
Badanie
immunoenzymatyczne
(ELISA)
Paskowy test
immunoenzymatyczny
do potwierdzenia
przeciwciał
Treponema pallidum
w surowicy bądź osoczu.
Testy
immunofluorescencyjn
e
Testy immunofluorescencyjne
bezpośrednie wykrywają przy pomocy
znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał
określony antygen.
Testy immunofluorescencyjne pośrednie
wykrywają przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwciał
immunoglobuliny, które uprzednio związały
się ze swoistym antygenem.
Charakteryzują się większą czułością.
Testy
immunofluorescencyjn
e
Diagnostyka kiły
• Test immunofluorescencji
pośredniej
Poszczególne etapy testu
Podstawy fluoprescencji
pośredniej
Podstawy fluoprescencji
pośredniej
1
2
3
Fiksacja
Koniugacja
Fluorescencja
Testy
immunofluorescencyjn
e
Na szkiełko podstawowe nanosi się krętki kiły
Treponema pallidum (krętki pochodzą z laboratorium)
Testy
immunofluorescencyjn
e
Dodaje się surowicę pacjenta (Jeśli surowica
badanej osoby zawiera przeciwciała swoiste
wobec krętków (tj. zaraziła się kiłą), to
zwiążą się one z krętkami na szkiełku)
Testy
immunofluorescencyjn
e
Po przepłukaniu, dodaje się przeciwciała swoiste wobec ludzkich immunoglobulin.
Przeciwciała te znakowane są barwnikiem flourescencyjnym.
Testy
immunofluorescencyjn
e
Wynik pozytywny (osoba zarażona)
• pod mikroskopem fluoresecncyjnym
obserwuje się fluoryzujące krętki
Wynik negatywny (osoba nie jest
zarażona)
• brak "świecenia"
Zjawiska
immunologiczne
Zjawiska
immunologicz
ne
(wrażliwość
na
antybiotyki)
Grupy antygenów
• Nieswoisty antygen lipidowy
(posiadają go wszystkie krętki,
rośliny, zwierzęta, człowiek)
• Swoisty grupowo antygen
białkowy
(swoisty dla krętków)
• Swoisty typowo antygen białkowy
(swoisty dla krętka bladego)
• Swoisty typowo antygen cukrowy
(najbardziej swoisty dla krętka
bladego!!!!!!)
Metody wykrywania
przeciwciał przeciw
krętkowych
I. Odczyny klasyczne
(kardiolipinowe,
kłaczkujące, nieswoiste) –
łatwe i tanie w wykonaniu.
•
USR
•
VDRL
•
RPR
Metody wykrywania
przeciwciał przeciw
krętkowych
II. Odczyny krętkowe (swoiste)
• FTA
• FTA – ABS
• TPHA
• TPI
Odczyny klasyczne
Lipid
OWD kłaczkujące
WR Kolmera USR VDRL
RPR
Odczyny klasyczne
VDRL (Veneral Disease
Research Laboratrory)
• Jest testem jakościowym i ilościowym
• Wykonuje się na szkiełku podstawowym
(1 kropla surowicy nieinaktywowanej +
1 kropla antygenu fabrycznie
przygotowanego na szkiełko
podstawowe)
• Nadaje się do wczesnej diagnostyki i
monitorowania leczenia kiły (łatwo
śledzić miano przeciwciał)
VDRL
1. Brak
reakcji
2.Wątpli
wa
reakcja
3.Pewna
reakcja
Odczyny klasyczne
RPR (Rapid Plasma Reagin) :
• Jest wygodnym testem kartonikowym
• Wykonuje się go metodą jakościową i
ilościową
• Można go wykonać w gabinecie
lekarskim
• Zawsze potwierdzić wynik testem
krętkowym
Odczyny klasyczne
USR/VDRL/RPR:
• Na podstawie tych badań nie można
wdrożyć leczenia
• Wynik na „+++” nie świadczy o zakażeniu
krętkiem bladym (może ale nie musi)
Odczyny klasyczne
• Dodatnie wyniki pojawiają się
w 5-6 tyg. zakażenia.
• Wszystkie dodatnie i
wątpliwe wyniki odczynów
kardiolipinowych muszą być
zweryfikowane odczynami
krętkowymi !!!!!!
Metody krętkowe
(swoiste)
Skierowane są na wykrywanie
antygenów białkowych lub
wielocukrowych:
• Testy fluorescencyjne (FTA, FTA-
ABS)
• Test hemaglutynacyjny (TPHA)
• TPI
Odczyny krętkowe
Odczyny krętkowe
FTA TPHA TPI
Odczyn hemaglutynacji
(Treponema Pallidum
Haemagglutination Assay)
• Wykorzystuje się erytrocyty baranie
opłaszczone antygenem krętkowym
(rozbite ultradźwiękami krętki blade)
• Następnie dodaje się surowicę badanej
osoby chorej, która powoduje zlepianie
opłaszczonych erytrocytów
(przeciwciała przeciwkrętkowe) –
aglutynacja krwinek
• Reakcja zachodzi w rozcieńczeniach od
1:20 do 1:20 000- 40 000
• W kile nieleczonej: utrzymuje się
• W kile leczonej: maleje, ale nie zanika –
blizna immunologiczna!!!
Treponema Pallidum
Immobilization Test (TPI),
Odczyn Nelsona-Mayera
• Najstarszy test, najbardziej swoisty ale też
najmniej czuły
• Wykrywa się przeciwciała przeciwko
antygenom wielocukrowym
• Stosuje się żywe szczepy Nicolsa hodowane na
jądrach króliczych
• Wykonuje się test w dwóch probówkach
(Równocześnie przeprowadza się odczyn
kontrolny z surowicą cielęcą z inaktywowanym
dopełniaczem oraz z surowicą pacjenta z
inaktywowanym dopełniaczem)
• W badanej surowicy znajdują się immobilizyny
= reaginy (przeciwciała unieruchamiające
krętki).
Treponema Pallidum
Immobilization Test (TPI),
Odczyn Nelsona-Mayera
Interpretacja testu Nelsona:
• 0-50 % - wynik ujemny
• 50-60 % wynik wątpliwy
• 60-80 % wynik dodatni
• 80-100 % wynik wybitnie dodatni
Treponema Pallidum
Immobilization Test (TPI),
Odczyn Nelsona-Mayera
• Diagnostyka kiły drugiego i
trzeciego okresu
• Przeciwciała pojawiają się około
50-go dnia od zakażenia
krętkiem bladym.
FTA (Fluorescent Treponemal
Antibody Test)
• Najbardziej czuły test
• Stosuje się antygen krętkowy
(krętki szczepu Nicholsa)
• Obecne w surowicy przeciwciała
przeciwkrętkowe opłaszczają krętki
• Następnie używa się surowicy
antyglobulinowej z przeciwciałami
znakowanymi izocyjanianem
fluoresceiny
FTA (Fluorescent
Treponemal Antibody Test)
• Wizualizacja wyniki następuje przy
pomocy mikroskopu
fluorescencyjnego
• Reakcja następuje do rozcieńczeń
surowicy (od 1:50- kilkudziesięciu
tysięcy), nawet do 1: 36 000
• Mogą być wyniki fałszywie dodatnie
kiedy wystąpią przeciwciała przeciw
innym niechorobotwórczym krętkom.
• Szacuje się 5 % F(+) wyników, aby
zwiększyć swoistość wyniku
wykonuje się FTA-ABS
FTA-ABS (Fluorescent
Treponemal Antibody
Absorption Test)
• Jest to modyfikacja absorpcyjna
odczynu FTA
• Używając homogenatu krętków szczepu
Reitera (krętki niepatogenne) usuwa
się z surowicy badanej przeciwciała
przeciw wspólnym antygenom dla
różnych gatunków krętków
• Pozostają jedynie swoiste antygeny dla
krętka bladego
IgM FTA-ABS (IgM
Fluorescent Treponemal
Antibody Absorption Test)
• Test wykonuje się jak poprzedni
• Stosuje się dodatkowo antyglobulinową
monoklonalną surowicę przeciw IgM
• Ostanie przeciwciało jest sprzęgnięte z
izotiocyjanianem fluorsceiny.
• Diagnostyka kiły wrodzonej
• Diagnostyka u dorosłych (tylko u pacjentów z
kiła późną czynną) np. pacjent 60-letni z
wynikiem 1:1300, 1:4000 czy pacjent ma
niedoleczoną kiłę, czy utajoną późną kiłę z
blizną immunologiczną)
IgM FTA-ABS ( IgM Fluorescent
Treponemal Antibody
Absorption Test)
• W łożysku ludzkim obecne są
receptory dla IgG (brak receptorów
dla IgM)
• IgM wytwarzane są tylko w
organizmie zakażonym
• Aby u noworodka (niemowląt)
rozpoznać kiłę wrodzoną należy
wykonać potwierdzający test IgM FTA
ABS
19 S IgM FTA-ABS ( IgM
Fluorescent Treponemal
Antibody Absorption Test)
• Najpierw absorbuje się nieswoiste
antygeny przy pomocy homogenatu
szczepu Reitera
• Następnie przepuszcza się surowicę
przez kolumne Sefadex w celu
wyekstrachowania IgM o stałej
sedymentacji 19 S (czynnik
reumatoidalny 11 S)
Porównanie odczynów
Kolejność pojawiania się:
1.
FTA (od 3-go tygodnia, miano
maksymalne w okresie kiły
drugorzędowej)
2.
TPHA (około 5 tygodnia od zakażenia)
3.
VDRL, USR (około 6-go tygodnia, stąd
podział na kiłę surowiczoujemną i
surowiczododatnią)
4.
TPI (około 50-tego dnia od zakażenia)
Porównanie odczynów
Kolejność ustępowania:
1. VDRL, USR
2. TPI
3. FTA
4. TPHA
Porównanie odczynów
Największa swoistość testu:
1. TPI
2. 19 S IgM FTA ABS
3. TPHA
4. Inne FTA
5. VDRL
6. USR
Porównanie odczynów
Największa czułość testu:
1. Wszystkie FTA
2. TPHA
3. USR
4. VDRL
5. TPI
Zastosowanie
Profilaktyka (badania
przesiewowe):
1. USR + ewentualnie VDRL
2. U kobiet w ciąży (FTA z suchej
kropli, krew pobrana z palca
na bibułę, nie zalecane z
powodu wyników fałszywie
negatywnych)
Zastosowanie
Diagnostyka serologiczna kiły:
1. USR
2. Gdy USR dodatni zlecamy
VDRL
3. Gdy VDRL dodatni zlecamy
FTA ABS
4. Gdy FTA ABS dodatni mamy
prawo rozpoznać kiłę.
Zastosowanie
5. Jeśli FTA ABS jest wątpliwy
wykonujemy TPHA
6. Jeśli TPHA jest dodatni mamy
prawo rozpoznać kiłę
7. Jeśli TPHA jest wątpliwy
zlecamy test rozstrzygający TPI.
8. Jeśli TPI jest dodatni
rozpoznajemy ostatecznie kiłę.
Zastosowanie
Kontrola po leczeniu:
• FTA
• VDRL ilościowy (spadek
miana świadczy o
skuteczności leczenia)
Odczyny biologicznie
mylne
To takie reakcje gdzie zachodzi
reakcja immunologicza
(odczyn serologiczny dodatni)
niebędąca błędem
laboratoryjnym a nie
spowodowana infekcją
krętkiem bladym
Odczyny biologicznie
mylne
I.
Ostre:
•
Intoksykacja alkoholowa
•
Narkoza eterowa
•
Intoksykacja środkami chemicznymi
•
Narkomania
•
Infekcje wirusowe i bakteryjne
•
Ciąża (odczyny klasyczne, nie zaleca
się testu FTA z suchej kropli, ze
względu na dużą ilość wyników
fałszywie ujemnych, pacjentki miały
kiłę a nie były leczone)
Odczyny biologicznie
mylne
II. Graniczne
• Gruźlica
• Borelioza
• HBV, HCV, EBV
Odczyny biologicznie
mylne
III. Przewlekłe:
• Zespół antykardiolipinowy
• Toczeń rumieniowaty układowy
• Inne kolagenozy
• Szpiczak mnogi
• Chłoniaki
Nawrót serologiczny
• To sytuacja w której po pełnym
przeleczeniu bez uchwytnej
przyczyny dochodzi do wzrostu
miana przeciwciał przeciw
krętkowych
Nawrót kliniczny
• To taka sytuacja w której bez
uchwytnej przyczyny dochodzi
do wzrostu miana przeciwciał
przeciwkrętkowych z objawami
klasycznymi dla okresu kiły w
której pacjent znajdowałby się
gdyby nie był leczony
Nawrót kliniczny
Przykłady:
• Alkoholizm w trakcie leczenia
kiły
• Nieregularne zgłaszanie się po
leczeniu
Reinfekcja
• To ponowne zakażenie się
krętkiem kiły po uzyskanym
poprzednim wyleczeniu (tym się
różni od nawrotu
serologicznego i klinicznego)
Odczyny serologiczne
0-- 3 tyg ----6 tyg ----9 tyg ----16
tyg ----2 l.
FTA (najwcześniej)
USR/VDRL
TPHA
TPI